免疫组织化学技术

1、 免疫组织免疫组织/细胞化学细胞化学 IHC/ICC主要内容免疫组织化学概况免疫组化实验步骤和试剂常见问题及处理方法多色标记免疫组织/细胞学简介免疫组织学免疫组织学 是一种把分子水平的物质在组织原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应进行定性、定位测定，准确具体表达出来的一种方法。这些分子水平的物质可能与癌细胞、蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等等有关技术平台技术平台组织切片或细胞爬片纯化的一抗（单克隆或多克隆）标记的二抗(酶、金颗粒或者荧光）显色系统（DAB、AEC、BCIP/NBT、FAST RED等） 检测系统（普通或荧光显微镜）免疫组织学方法分类免疫组织学方法分类酶免疫组织化学染

2、色（IHC） IHC-Fr：冰冻切片 IHC-P：石蜡切片荧光免疫组织染色（IF） 多用于冰冻组织切片或者细胞爬片胶体金免疫组织染色（GIHC）根据标本类型分类石蜡切片：用酶免疫组织染色冰冻切片：多用荧光免疫染色细胞爬片：多用荧光免疫染色免疫组化相关名称简写简写中文名称中文名称ICC 免疫细胞化学免疫细胞化学ICC/IF 免疫荧光（细胞标本）免疫荧光（细胞标本） IHC-P 免疫组织化学免疫组织化学 (石蜡切片石蜡切片) IHC-Fr 免疫组织化学免疫组织化学 (冰冻切片冰冻切片) IF免疫荧光免疫荧光IHC 免疫组织化学IHC (Methanol fixed) 免疫组织化学 (甲醇固定) I

3、HC (PFA fixed) 免疫组织化学 (PFA 固定标本) IHC-FoFr 免疫组织化学 (灌注固定冰冻切片) IHC-FrFl 免疫组织化学 - Free Floating IHC-G 免疫组织化学 (Glycolmethacrylate sections) IHC-Glut 免疫组织化学 (PFA-glutharaldehyde fixed) IHC-M 免疫组织化学 (Methylmethacrylate sections) 酶免疫组织化学（酶免疫组织化学（IHC）常用方法）常用方法v PAP/APAAP：二抗-HRP/AP + HRP-抗HRP/AP；v LAB/LSAB：二抗

4、 生物素(Biotin) + HRP-亲和素；v S-P/SAP： 二抗 生物素 + 链酶亲和素-HRP/AP；v ABC/SABC：亲和素/链酶亲和素-生物素化HRP/AP复合物；v非Biotin/Avidin方法/Envision两步法：二抗直接偶联酶S-P/LAB方法复合物:链酶亲和素-HRP/AP基本原理S-P/LAB方法:一个亲和素和多个标记酶（HRP）结合，多个生物素与抗体（一抗或二抗）结合，细胞的抗原（或一抗）先与生物素化的抗体结合，既而将酶标记的亲和素结合在生物素上，最后进行显色反应定位。ABC方法ABC复合物:亲和素-生物素化HRP/APA亲和素，B生物素，C复合物基本原理A

5、BC法：先按一定比例将亲和素与酶标生物素结合，形成ABC复合物，抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，形成巨大复合物（网络大量酶分子），最后显色。二抗直接偶联酶的Polymer俗称两步法基本原理Envision两步法：抗原与抗体反应结合后，第二抗体上标记有多聚化合物酶复合物（EnVision复合物），与第一抗体结合，进而由酶作用底物进行显色定位。荧光免疫组织染色方法使用荧光标记抗体，直接定位、定性检测组织或细胞蛋白表达情况。较免疫组化具有灵敏度高、操作简单的优点。缺点是染色组织片不能长期保存IF常用荧光素FITC：绿色，激发波长488nm；发射波长515nmRhodamine：

6、橙色，激发波长570nm；发射波长570-590nmTexas Red：红色，激发波长589nm；发射波长570-615nmCy3：橙色，激发波长512/550nm；发射波长570nmCy5：红色，激发波长625/650nm；发射波长670nm免疫组化实验注意事项正确选配抗体 一抗必须是说明书上经过验证(tested application)可以用于IHC(IHC-P;IHC-Fr)检测的 二抗必须是和一抗来源及亚型相配套的 正确设置合适的对照正确选配固定方法和修复方法正确选配显色系统免疫组化实验对照设置阳性对照：判断染色全过程和所有试剂的正确性：A、内部对照：对照组织本身明确存在的抗原（二抗

7、系统的正确性）B、外部对照：明确表达待测抗原的组织或细胞（一抗的工作性）阴性对照：明确不表达待测抗原的组织或细胞二抗对照：不加一抗，余操作相同免疫组化基本操作步骤及需要的试剂免疫组化基本操作步骤Envision二步法操作步骤1、组织切片60预热2、常规脱蜡入水（二甲苯、各级酒精、水）3、抗原修复4、PBS/T洗3次，5min/次5、3%H2O2 RT 10min（封闭内源HRP）6、PBS/T洗3次，5min/次7、10%正常山羊血清RT 30min（阻断组织内源IgG、Fc-R）8、一抗4 孵育过夜9、PBS/T洗3次，5min/次10、二抗RT 30min11、PBS/T洗3次，5min/

8、次12、DAB显色，显微镜下观察，控制显色程度13、充分水洗14、苏木素复染核15、1%盐酸酒精分化16、充分水洗返蓝17、脱水、透明，中性树胶封片1、载玻片处理重酪酸钾浓硫酸浸泡24hddH2O漂洗95%乙醇浸泡12h防脱粘片剂处理： Poly-L-Lysine; AEPS; Special Reagent可直接购买处理好的载玻片2、组织固定石蜡切片冰冻切片细胞涂片组织固定液10%中性福尔马林4%多聚甲醛冷丙酮，4%多聚甲醛甲醇、乙醇特点需要修复不需修复，冷丙酮固定不需破膜不需修复如果待测蛋白位于细胞浆或者细胞核内，同时还需要进行破膜处理标本类型及常用固定液标本类型及常用固定液3、抗原修复加

9、热修复技术修复方法修复方法：微波加热修复、高压热修复、煮沸热修复：常用常用buffer：柠檬酸Buffer:0.01M, pH6.0 EDTA buffer: pH9.0非加热修复技术胃蛋白酶(细胞内抗原): 0.4%,37,30mins 胰酶(细胞间抗原): 0.05-0.25%,37,10-15mins Proteinase K : 20ug/ml正常血清正常血清(5-10%)：阻断组织内源IgG、Fc-RBSA (5%) ：阻断组织内源IgG、Fc-R特殊封闭试剂特殊封闭试剂：当使用小鼠源性抗体检测小鼠组织抗原时内源性生物素内源性生物素/亲和素亲和素：有些组织如肾脏、肝脏、脾脏含有很高的

10、内源性生物素，如使用SP或者ABC试剂盒需要进行封闭封闭条件：室温 30-120mins如是HRP系统，则同时需要使用3% H2O2室温10-30mins淬灭内源性HRP的活性4、封闭、封闭5、一抗孵育选择验证过待测种属和实验方法的一抗根据说明书上推荐的固定和修复方法处理标本说明书推荐的稀释比例仅作参考，需要根据标本类型来摸索最佳稀释比例一般是在含1%封闭试剂的缓冲液（比如PBS(T) /TBS(T)中4过夜6、二抗及酶标记物孵育根据一抗的来源和Ig亚型选择合适的二抗根据说明书推荐的稀释比例和标本类型摸索最佳稀释比例一般是在含1%封闭试剂的缓冲液（比如PBS(T) /TBS(T)中室温(RT)

11、 30-60mins也可以选择商业化的试剂盒：SP,ABC或者两步法7、显色 HRP AP AEC（red) Fast Red(pink) DAB(brown/gray)BCIP/NBT(blue/violet) 根据所用酶类型选择合适的显色底物8、复染、复染苏木素(染核,蓝色)甲基绿(染核,绿色)核固红(染核,红色)DAPI(染核,兰色)AEC,DAB,AP Red/Fast Red, 免疫金-银染色DAB, BCIP/NBTBCIP/NBT荧光9、脱水/透明/封片AEC,AP Red/ Fast Red, 和其它有机染料DAB,New Fuchsin, Vega Red,BCIT/NBT和

12、其它水溶性染料荧光染料不需脱水、透明脱水、透明脱水、透明水溶性封片剂如AEC封片剂 有机封片剂如中性树胶水溶性封片剂，最好是含荧光抗淬灭成分的(PE不能用含甘油的封片剂)10、结果观察普通光学显微镜荧光显微镜IHC/ICC常见问题分析常见问题及处理方法常见问题及处理方法 组织脱片 非特异性背景染色 染色弱 无阳性染色载玻片处理不充分组织固定、脱水、透明不充分组织切片太厚（5um)组织切片有折叠过度的热抗原修复（高压、微波、水煮）抗原修复液的pH值偏高操作过程中冲洗方法不正确组织脱片常见原因组织脱片常见原因封闭不充分封闭不充分：增加封闭试剂浓度、延长封闭时间冲洗不充分冲洗不充分：短时间多次数的洗

13、涤更有效实验过程中切片干燥实验过程中切片干燥：试剂量充足，注意观察，避免干片组织切片折叠组织切片折叠组织抗原弥散组织抗原弥散：组织标本及时固定，选择合适的固定液抗原修复不充分抗原修复不充分：更改修复方法，优化时间内源性生物素内源性生物素/亲和素亲和素：使用封闭试剂或者不用SP/ABC系统二抗原因二抗原因：选择Fab段的抗体或者吸附过的抗体，设置二抗对照一抗原因一抗原因：抗体浓度过高：降低抗体浓度、建议4过夜选择纯化的抗体设置阳性对照试剂污染试剂污染：重新配置新的缓冲液和试剂非特异性背景染色非特异性背景染色组织固定、包埋时抗原被破坏抗原位于细胞内，未使用破膜剂(尤其是定位于细胞核)抗体浓度过低，孵育时间过短操作中滴加试剂时缓冲液未漓干，致使试剂稀释室内温度15 过度封闭试剂超过有效期抗体保存不当导致活性降低染色过程中未避光（荧光染色）染色弱常见原因染色弱常见原因操作错误（漏加试剂）组织中无抗原固定、包埋、修复时抗原被破坏修复方法不当一抗与二抗不匹配底物和酶不匹配封闭过度封片剂选择不当一种或多种试剂活性降低或失活抗原位于细胞内，未使用破膜剂无阳性染色常见原因无阳性染色常见原因多标记检测多标记染色法多标记染色法适用于同一组织