蛋白质定量实验

1、 生命科学是以探求生命奥秘为中心课题。生命科学是以探求生命奥秘为中心课题。 蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能。功能。 没有足够纯度的生物大分子，结构与功能没有足够纯度的生物大分子，结构与功能的研究就无从谈起。的研究就无从谈起。 必须首先解决生物大分子的制备问题。必须首先解决生物大分子的制备问题。 对获得的生物大分子进行鉴定。对获得的生物大分子进行鉴定。离心离心分子分子生物学技术生物学技术电泳电泳层析层析光学光学生化生化实验实验生化实验内容安排生化实验内容安排实验室实验室实验内容实验内容一一实验实验16：DEAE纤维素离子交换层析纤维素离子交换层析二二

2、实验实验17：血清：血清-球蛋白的提纯球蛋白的提纯实验实验8 ：醋酸纤维素薄膜电泳：醋酸纤维素薄膜电泳三三实验实验9 ：聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳四四实验实验3 ：测定蛋白质的比色分析法：测定蛋白质的比色分析法实验实验12：血脂蛋白电泳：血脂蛋白电泳五五实验实验18：真核基因组：真核基因组DNA的分离提取的分离提取六六实验实验7 ：酶促反应：酶促反应动力学动力学实验实验19：质粒：质粒DNA的提取及酶切鉴定的提取及酶切鉴定第一轮第一轮实验本身实验本身:实验室规则实验室规则:时间、穿着、时间、穿着、仪器不能乱动仪器不能乱动、赔偿制度、赔偿制度、整洁、整洁、卫生。卫生。预习报告、预习报

3、告、规范操作规范操作（辨认标签（辨认标签）、）、如实记录、如实记录、污染物、毒物、废弃物污染物、毒物、废弃物（酸碱烧伤大量自来水冲洗）（酸碱烧伤大量自来水冲洗）l实验实验 实验报告要求：实验报告要求：题目，组号题目，组号实验目的实验目的实验原理实验原理实验记录：实验记录：如实记录如实记录实验结果及结果分析：实验结果及结果分析：实事求是实事求是讨论或小结：讨论或小结：生物化学实验室规则生物化学实验室规则 实验前需预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果、实验前需预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果、 操作关键步骤及注意事项操作关键步骤及注意事项,写预习报告写预习报

4、告。 实验要严肃认真地按照操作规程进行，注意观察实验中出现的现象和结果，实验要严肃认真地按照操作规程进行，注意观察实验中出现的现象和结果，并把实验数据和结果并把实验数据和结果及时如实及时如实记录在实验记录本上，课后根据实验结果进记录在实验记录本上，课后根据实验结果进行科学分析。行科学分析。 实验室和实验台应实验室和实验台应保持整洁保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗净放好。仪器洗净放好。 注意节约药品、试剂和各种物品，爱护仪器，按规程操作仪器，注意节约药品、试剂和各种物品，爱护仪器，按规程操作仪器，以免损坏以免损坏。 实验室实验室严

5、禁吸烟！严禁吸烟！乙醇、丙酮等易燃物品不能直接加热，并远离火源。实乙醇、丙酮等易燃物品不能直接加热，并远离火源。实验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。 若发生酸碱灼烧事故，若发生酸碱灼烧事故，应用大量自来水冲洗应用大量自来水冲洗，酸灼伤者用饱和，酸灼伤者用饱和NaHCO3溶溶液中和，碱灼伤者用饱和液中和，碱灼伤者用饱和H3BO3溶液中和，氧化剂伤害者用溶液中和，氧化剂伤害者用Na2S2O4处理。处理。 所有所有固体废弃物固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于

6、垃圾桶中。强强酸、强碱酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。血浆脂蛋白的分类血浆脂蛋白的分类血浆脂蛋白组成特点血浆脂蛋白组成特点血浆脂蛋白的结构血浆脂蛋白的结构血脂代谢的临床意义血脂代谢的临床意义电泳技术简介电泳技术简介 电泳定义电泳定义 电泳技术电泳技术 影响电泳速度的主要因素影响电泳速度的主要因素 电泳的分类电泳的分类 水平电泳装置水平电泳装置 琼脂糖的特点琼脂糖的特点实验原理实验原理： 各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小、及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小、带电荷的数量相差也很大，因此以

7、带电荷的数量相差也很大，因此以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。使各种脂蛋白颗粒分离开来。 实验方法（概括）实验方法（概括） 将血清脂蛋白用脂类染料（如苏丹将血清脂蛋白用脂类染料（如苏丹黑或油红等）进行预染。再将预染黑或油红等）进行预染。再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行电泳分离，通电后，可以看出脂蛋电泳分离，通电后，可以看出脂蛋白向正极移动，并分离为几个区带。白向正极移动，并分离为几个区带。实验操作 、预染血清、预染血清 2 2、制备琼脂糖凝胶板、制备琼脂糖凝胶板 、点加血清、点加血清 、电泳、电泳 、观察

8、并记录电泳结果、观察并记录电泳结果 (1)苏丹黑染色液：称取100nag苏丹黑B加0.2mL2氧六环混匀，加3mL无水乙醇，37 0C水浴30min。 (2)巴比妥缓冲液：称取巴比妥钠5.4g，巴比妥2.76g及EDTA0.29g，加水溶解后再加蒸馏水至1000mL(pH为8.6离子强度0.075)，为电极缓冲液。 (3)凝胶缓冲液：取三羟甲基氨基甲烷1.212g，EDTA0.29g及NaCl5.85g，用蒸馏水溶解后，稀释至1000mL，pH为8.6。 (4)琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.5g溶于50mL凝胶缓冲液中，再加水50ml。在水浴中加热至沸。待琼脂糖完全溶解后，立即停止加热。试剂实验目

9、的实验目的1. 掌握双缩脲法测定蛋白浓度的原理。掌握双缩脲法测定蛋白浓度的原理。2. 掌握掌握Lowry氏法测定蛋白浓度的原理。氏法测定蛋白浓度的原理。3. 学会使用分光光度计。学会使用分光光度计。 4. 总结蛋白质定量方法的设计思路。总结蛋白质定量方法的设计思路。实验原理实验原理一、双缩脲法测定血清总蛋白一、双缩脲法测定血清总蛋白 双缩脲反应双缩脲反应 操作操作 计算计算 试剂及器材试剂及器材二、二、Lowry氏法测定蛋白质含量法氏法测定蛋白质含量法 原理原理 操作操作 计算计算 试剂及器材试剂及器材试剂使用规则试剂使用规则 使用试剂前应该使用试剂前应该仔细辨认标签仔细辨认标签，看清名称及浓

10、度，是，看清名称及浓度，是 否否为本实验所需。为本实验所需。 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。剂决不可倒回原瓶。 取标准溶液时，取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中应该将标准溶液倒入干试管中，再用干，再用干净吸管吸取标准液，净吸管吸取标准液，以免污染瓶中的标准液体。以免污染瓶中的标准液体。 使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。 使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸

11、取，以免造成意外。管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。吸量管的种类吸量管的种类 奥氏吸量管奥氏吸量管 供准确量取供准确量取0.50、1.0、2.0、3.0ml液体所用。这液体所用。这种吸量管只有一个刻度，当放出所量取的液体时，管尖余留种吸量管只有一个刻度，当放出所量取的液体时，管尖余留的液体必须吹入容器内。的液体必须吹入容器内。 移液管移液管 常用量取常用量取50.0、25.0、10.0、5.0、2.0、1.0ml的液体，的液体，这种吸量管只有一个刻度，放液时，量取的液体自然流出后，这种吸量管只有一个刻度，放液时，量取的液体自然流出后，管尖需在容器内滞留管尖需在容器内滞留15秒。秒。

12、注意管尖残留的液体不要吹出。注意管尖残留的液体不要吹出。 刻度吸量管刻度吸量管 供量取供量取10 ml以下任意体积的溶液。一般刻度包以下任意体积的溶液。一般刻度包括尖端部分。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管括尖端部分。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸量管为尖的溶液。此类吸量管为“吹出式吹出式”，吸量管上端标有，吸量管上端标有“吹吹”字。未标字。未标“吹吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。吸量管的使用吸量管的使用原则原则 量取整数量液体，并且取量要求准确时，应该选用奥氏量取整数量液体，并且取量要求准确时，应该选用奥氏吸量

13、管。量取大体积时要用移液管。同一定量实验中，吸量管。量取大体积时要用移液管。同一定量实验中，如欲加同种试剂于不同的管中，并且取量不多时，如欲加同种试剂于不同的管中，并且取量不多时，应应选择一支与最大取液量接近的刻度吸量管。选择一支与最大取液量接近的刻度吸量管。吸量管的使用方法吸量管的使用方法 正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端端 取液：用橡皮球吸液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸取液：用橡皮球吸液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。完后用食指顶住吸量管上端。 调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触

14、，并调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。面、刻度和视线应在一水平面上。 放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，仍使其出口尖放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。奥氏吸量管和刻度到底的吸量管应吹出使液体自动流出。奥氏吸量管和刻度到底的吸量管应吹出尖端残留的液体。移液管应最后靠壁尖端残留的液体。移液管应最后靠壁15秒。秒。 加

15、样器的正确使用加样器的正确使用 移液管的正确使用（特别注意每种试剂移液管的正确使用（特别注意每种试剂的专用管不可混用）的专用管不可混用） 加样量的准确性加样量的准确性 温度与时间的准确性温度与时间的准确性 分光光度计的校准和使用分光光度计的校准和使用 开启电源，仪器预热开启电源，仪器预热20分钟。分钟。 波长调至测试用波长。波长调至测试用波长。 将比色皿架处于空白管位置，打开试样室盖，选将比色皿架处于空白管位置，打开试样室盖，选择择“T”档，调节档，调节“0”按钮，使数字显示为按钮，使数字显示为“0.00”。 盖上试样室盖，使光电管受光，调节透过率盖上试样室盖，使光电管受光，调节透过率“100

16、%”按钮，使数字显示为按钮，使数字显示为“100.0”。 吸光度的测量，将选择开关置于吸光度的测量，将选择开关置于“A”，调节吸光，调节吸光度调零按钮，使数字显示为度调零按钮，使数字显示为0.00，然后将被测，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。 722机的光谱范围在机的光谱范围在360nm-800nm722分光光度计使用方法分光光度计使用方法该机的光谱范围在该机的光谱范围在360nm-800nm。 接通电源，打开机器开关，使仪器通电，打开箱盖，预热接通电源，打开机器开关，使仪器通电，打开箱盖，预热10分钟。分钟。 将空白液或对照液

17、及测定液分别装入比色杯将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用软纸擦清外壁，体积并用软纸擦清外壁， 放入样品室。放入样品室。 调节电流计上零点调节器，使读书盘上指针的吸光度为调节电流计上零点调节器，使读书盘上指针的吸光度为A或透光率为或透光率为0。 调节测定所用波长。调节测定所用波长。 盖上箱盖，光径开关自动打开。转动光量调节器使空白或对照管的吸光盖上箱盖，光径开关自动打开。转动光量调节器使空白或对照管的吸光 度为度为0，或透光率为，或透光率为100，待读数指针稳定后，逐步拉出样品盒滑干，待读数指针稳定后，逐步拉出样品盒滑干， 通过读数指针，读取测定管上的吸光度。有时需调节灵敏度开

18、关，才能通过读数指针，读取测定管上的吸光度。有时需调节灵敏度开关，才能 正确读得吸光度。此时应重新转动零点调节器至吸光度为正确读得吸光度。此时应重新转动零点调节器至吸光度为A。 读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净。读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净。 溶液定量测定时，应注意吸光度在溶液定量测定时，应注意吸光度在0.11.0范围，浓度太大时应适当稀范围，浓度太大时应适当稀 释。释。 *注意事项：注意事项： 1）用手拿比色杯的磨砂面。）用手拿比色杯的磨砂面。 2）液体的体积装满比色杯的）液体的体积装满比色杯的3/4。 3）不要将比色杯放在分光光度计上）不要将比色杯放在分光光度计上。1.比色杯光学表面不能有任何污损，否则会比色杯光学表面不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。用手拿比色杯的磨砂面。引起光吸收的增加。用手拿比色杯的磨砂面。 3.装液量不能超过装液量不能超过3/4,用前润洗。用前润洗。2.2.比色杯的外表面应以高质量的柔软擦镜纸或比色杯的外表面应以高质量的柔软擦镜纸或绸布擦干净，不能使用易磨损比色杯的滤纸。绸布擦干净，不能使用易磨损比