心肌细胞生长、死亡及再生

1、心肌细胞生长、死亡与再生心肌细胞生长、死亡与再生一般概念一般概念n终末分化：rat 34d human 5mn肥大： 退出细胞周期后，以肥大代替增殖； 心脏负荷增加，以肥大代偿； 心肌细胞死亡，以瘢痕修复，以肥大代偿。n病理刺激 心肌受损 心肌肥大 心力衰竭 n治疗：去除病因，减少负荷，逆转肥大心肌细胞是否有再生能力心肌细胞是否有再生能力19世纪末20世纪初：具有增殖能力19211925年：不具备增殖能力1.终末分化2. 缺乏干细胞3.心肌坏死，以瘢痕修复4.少量增殖：是偶然，非主流问题问题n心肌细胞的寿命人的寿命？n正常心肌细胞不存在死亡？n肥大心肌：细胞肥大细胞坏死？对心肌细胞死亡的观察对

2、心肌细胞死亡的观察n现代标记手段 ： 正常心肌细胞存在死亡，如果没有再生，几十年内心脏将丢失大部分 心衰者心肌细胞死亡 ，如果没有再生，心脏在几个月或几年内会消失n死亡 再生n死亡方式：凋亡，坏死，两者均有 正常、缺血：以凋亡为主； 梗死区：以坏死为主，周边以凋亡为主对心肌细胞增殖的观察对心肌细胞增殖的观察n1960S,德国 LINZBACH 严重心功能障碍伴随肥大和增生n几年后，RUMYANTSEV 细胞进入细胞周期n1990S。PCNA,Ki67,Brdu等与增殖相关的抗原、标记物的检出，证明心肌细胞存在有丝分裂。n1994 Quaini: 心衰末期，有丝分裂指数11/106；PCNA 4

3、9%nKAJSTWRA:CONFOCUS分裂指数 对照组：14 / 106 缺血性心脏病:152/ 106 先天性心脏病:131 / 106 对心肌细胞增殖的观察对心肌细胞增殖的观察n2001 BELTRAMI:13例心肌梗塞 细胞分裂相关核抗原Ki-67检测 近梗塞区4心肌细胞检出，为对照84倍 远离梗塞区1心肌细胞检出，为对照24倍 有丝分裂指数 近梗塞区0.08心肌细胞检出，为对照70倍 远离梗塞区0.03心肌细胞检出，为对照24倍 对心肌细胞增殖的观察对心肌细胞增殖的观察n1999，FELIX：成年心肌细胞出于S期新生鼠（2D）核与细胞质提取物70进入细胞周期n2002 QUAINI

4、正常心肌细胞中存在原始细胞，可分裂增殖对心肌细胞增殖的观察对心肌细胞增殖的观察压力负荷压力负荷n血流动力学改变是细胞生长的重要因素n当心功能处于代偿期、无心衰以肥大为主n当心功能下降、心衰出现增殖正常细胞寿命正常细胞寿命n心肌细胞体积：大细胞老 小细胞年轻 4M 大鼠 400011000um3 9000um3，P161nk4a （抑制细胞进入细胞周期）表达增多，凋亡增多。 小细胞P161nk4a 表达少，DNA复制活跃。n在正常、病理情况下，死亡 再生增殖细胞来源：增殖细胞来源：nKAJSTWRA实验室：把女性心脏移植到男性体内，心肌细胞内出现Y染色体。n骨髓来源的干细胞骨髓来源的干细胞n 肝

5、脏来源的干细胞肝脏来源的干细胞n血管来源的干细胞血管来源的干细胞n骨骼肌来源的干细胞骨骼肌来源的干细胞n心肌干细胞心肌干细胞n多潜能、未分化，在一定条件下可重建组织器官（组织工程）；损伤是分化的动力，如缺血坏死等n输入BMC：分化为心肌、血管内皮、血管平滑肌n干细胞动员剂：改变心梗功能，细胞增殖，新生细胞15/ 106，动脉毛细血管生成。nBMC体外定向诱导：有搏动的心肌骨髓来源的干细胞骨髓来源的干细胞( (BMC) ) 骨髓来源的干细胞骨髓来源的干细胞( (BMC) )n骨髓间质干细胞骨髓间质干细胞n骨髓单个核细胞骨髓单个核细胞n骨髓造血干细胞骨髓造血干细胞n骨髓成血管细胞骨髓成血管细胞骨髓

6、间质干细胞骨髓间质干细胞 具有多分化潜能,可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞与肌肉细胞等。n人和动物的骨髓间质干细胞在体外经定向诱导后可分化为心肌细胞、骨细胞、软骨细胞等。n将纯化的骨髓间质干细胞注入到结扎左冠状动脉的小鼠升主动脉内,发现骨髓间质干细胞可经冠脉循环到达心脏的缺血损伤病灶内,形成新生的心肌细胞或成纤维细胞。骨髓单个核细胞骨髓单个核细胞 骨髓单个核细胞是指骨髓中细胞核形态为单个核细胞的总称,包括造血干细胞、成纤维细胞、成骨细胞、血管内皮细胞前体细胞等。n注入猪的心肌梗死灶中,可显著提高射血分数, 增加局部血流, 增加梗死灶侧枝循环n将骨髓造血干细胞植入急性心肌梗死患者病灶内,可缩小

7、梗死面积, 增加射血分数、心脏指数,以及降低运动时舒张末容积等。骨髓造血干细胞骨髓造血干细胞细胞(side population cell) 是骨髓造血干细胞中存在一种亚单位,表达34-,具有多分化潜能。n移植的细胞可经体循环系统迁移到心肌受损伤的病灶内,形成新生血管及心肌细胞。n从表达绿荧光增强蛋白(9)基因的裸鼠体内提取一种特异表达Lin-c kit pos基因的骨髓造血干细胞,将其直接注入到裸鼠心脏的心肌梗死病灶周围,可明显改善心功能指标，并在梗死病灶周围形成相当于病灶68%大小的新生组织,其中包含新生血管样结构及心肌细胞。骨髓成血管细胞骨髓成血管细胞 存在于骨髓中的一种成血管细胞,表达

8、34+,是血管内皮细胞的前体细胞.n将其从静脉注射到裸鼠心梗动物模型体内,2天后,可迁移至梗死灶内,诱导病灶内的微血管发生增殖与再生,抑制病灶周围的心肌细胞凋亡,抑制心肌重构,减少瘢痕的形成,并显著改善心功能。肝脏来源的干细胞肝脏来源的干细胞n来源于肝脏的干细胞亦可在体内被诱导成心肌细胞。将来源于鼠肝的干细胞直接注射到裸鼠的左心室壁内,可在左心室壁内形成新生的心肌细胞,而且,与内源的心肌细胞结合完整,形成缝隙连接和闰盘。血管来源的干细胞血管来源的干细胞n从胚胎鼠的主动脉内提取血管内皮细胞,将其与鼠心肌细胞在体外共同培养,发现血管内皮细胞分化为心肌细胞;将其注射到鼠的心脏内,也被诱导分化为心肌细

9、胞;将人的脐静脉血管内皮细胞,在上述类似的环境中培养,也可分化为心肌细胞。骨骼肌来源的干细胞骨骼肌来源的干细胞n骨骼肌中的成肌细胞,又称卫星细胞, 也具有干细胞的功能,可分化形成新的骨骼肌细胞。将成肌细胞移植到受损的心脏内,可分化为肌样细胞,但形态上与心肌细胞有差异。有研究报道,将骨骼肌成肌细胞移植到人的心脏内,可改善心脏功能。心肌干细胞心肌干细胞nOhH612周龄的 C57BL/6小鼠心脏，Sca-1+, lin, CD45, CD31+ CD38+细胞：缺乏血细胞系、骨髓造血干细胞、内皮祖细胞、成熟内皮细胞表型可表达一系列心肌转录基因（GATA-4， MEF-2C，TEF-1），但不表达心

10、肌结构基因（- MHC ，-MHC，MLC-2a，MLC -2v，c&sk -actin等）在体外分化成心肌细胞，将其注入心肌梗死区后也能在体内分化成心肌细胞，改善心脏功能。 新生心肌细胞检测方法新生心肌细胞检测方法n心肌细胞鉴别nDNA合成检测n有丝分裂图n3HTDRnBRDUnPCNAnKi-67心肌细胞鉴别心肌细胞鉴别n搏动n相关蛋白检测：MHC,肌动蛋白。DNADNA合成检测合成检测n有丝分裂图：光镜组化（假阴性）n3HTDR：高特异性（放射性污染）nBRDU：DNA合成底物（假阳性）nPCNA：灵敏（假阳性，DNA修复期，凋亡细胞，肿瘤细胞）nKi-67：仅与核分裂有关，灵敏

11、，特异性高调控心肌细胞分裂的细胞因子调控心肌细胞分裂的细胞因子n胰岛素样生长因子n心脏营养因子n白介素1n成纤维生长因子n1，25（OH）2-D3n其他：细胞周期素，细胞周期蛋白依赖激酶（CDK），CDK抑制因子，P21，P27，TGF-成体干细胞在心脏疾病中的应用成体干细胞在心脏疾病中的应用 干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。由于胚胎干细胞移植存在着免疫排斥，从而限制了其在临床上的应用。近年来发现多种组织来源的成体干细胞存在着多向分化潜能，在特定条件下可定向诱导分化为多种组织的功能细胞。成体干细胞作为成年新生心肌细胞的重要来源之一，在心脏疾病中的治疗中受到极大关注，其最大优点是避免排斥反应

12、，因而有望优先进入临床使用。成体干细胞与缺血的心肌组织成体干细胞与缺血的心肌组织n造血干细胞：移植到裸鼠的体内,10周后制成心肌缺血再灌注损伤的模型,发现造血干细胞迁移到心肌受损伤的病灶内,并形成新生血管及心肌细胞。 n单个核细胞（成人外周血）体外培养7天获得的造血干细胞静脉注射给心肌梗死大鼠 7天后：在缺血的心肌组织中聚集着标记的造血干细胞已转化为血管母细胞，并整合到局部新生的血管中/28天后超声检查：心功能得到改善，梗死区周围以及缺血区域的血管密度增加，右心室瘢痕较对照组减小。成体干细胞与缺血的心肌组织成体干细胞与缺血的心肌组织n骨髓间充质干细胞：3周后缺血心肌组织的血供明显改善。血管造影

13、表明，侧支循环的数目增加5-7倍，新生的毛细血管与宿主的血管网相通，且有舒缩反应/注入到结扎左冠状动脉2周后的小鼠升主动脉内病灶内, 形成新生的心肌细胞或成纤维细胞成体干细胞与缺血的心肌组织成体干细胞与缺血的心肌组织成体干细胞与心肌梗死成体干细胞与心肌梗死n骨髓造血干细胞：直接注入到裸鼠心脏的心肌梗死病灶周围, 心功能指标有明显改善;九天后病检发现,在心肌梗死病灶周围由新生血管样结构及心肌细胞组成的新生组织,而对照组未见此结果。骨骼肌成肌细胞：n将经处理的骨骼肌成肌细胞注入到一位等待接受心脏移植的志愿病人心脏内,结果发现心脏能在较长时间内工作良好而无须接受心脏移植。n将大约7X106个骨骼肌成

14、肌细胞自体植入兔的心肌组织的瘢痕边缘中，发现成肌细胞可以修复心肌的瘢痕组织 成体干细胞与心肌梗死成体干细胞与心肌梗死成体干细胞与心肌梗死成体干细胞与心肌梗死n骨骼肌的成肌细胞：植入心肌梗死组织中，2周后该细胞表达慢收缩细胞的标志物肌凝蛋白重链，而不是心肌细胞特异的标志物肌凝蛋白。它在心肌瘢痕组织内转变为抗疲劳的慢反应纤维，以适应心肌的负荷及做功，说明移植的骨骼肌成肌细胞不是分化为心肌细胞，而是分化成为能够负担心肌工作的慢收缩细胞。n植入心肌组织的成肌细胞在超微结构上与正常心肌细胞不同，它们缺乏A及M带，提示骨骼肌成肌细胞可能仅仅是增加了瘢痕组织的顺应性，而不是收缩功能。因此，无收缩功能的成肌细

15、胞的心肌植人能否与正常的心肌细胞有相似的生理功能还值得进一步探讨。成体干细胞与心肌梗死成体干细胞与心肌梗死n有人将同源骨骼肌成肌细胞植入大鼠心力衰竭模型的心肌组织中，研究结果表明，能够有效地防止心室的扩张，左心室压力上升和下降最大速率增加，改善心脏的功能。自体骨髓间充质干细胞的移植有助于心力衰竭患者心功能的改善，为心力衰竭的治疗开辟了一个新的途径。成体干细胞与心功能不全成体干细胞与心功能不全n综上所述，针对成年心肌细胞生长、死亡与再生的最新研究打破了长期以来将心肌细胞作为终末分化细胞的观念，从而为相关的基础及临床研究开辟了新的方向，并随着成体干细胞应用的研究进一步深入，为临床心血管疾病的治疗提

16、供了新的前景。 前景前景已成为细胞移植的首选供体！多向分化潜能多向分化潜能取材方便取材方便不存在伦理问题不存在伦理问题高度自我高度自我更新能力更新能力自体移植无自体移植无免疫排斥反应免疫排斥反应可促进血管新生可促进血管新生优点优点骨髓间充质干细胞（BMSCs）骨髓间充质干细胞（BMSCs）n大量研究表明： BMSCs在一定条件下可诱导分化为心肌细胞（CM）及血管内皮细胞，目前关于其分化的机制尚未明确，有学者提出，环境诱导分化是其中的重要因素。环境诱导分化n环境诱导分化是干细胞进入微环境后受周围细胞的影响，对相应的各种物理或化学信号做出反应。n其机制可能与细胞接触、基因水平调控、细胞因子调控等有

17、关。GFP-BMSCsCM光镜下光镜下(10X20)(10X20)荧光显微镜下荧光显微镜下(10X20)(10X20) GFP (绿绿)Torpo-3 (蓝蓝)重叠重叠 Troponin I (红红)共聚焦显微镜下观察染色结果 (10X40)-actininMEF-2CGFPTORPO-3重叠重叠共聚焦显微镜下观察染色结果 (10X40)荧光显微镜下搏动的GFP-BMSCs5 mV25 s-26 mV-38 mV20 mV5 s250 ms20 mV0 mV-51 mV正常正常CM膜电位改变膜电位改变 BMSCs获得的心肌分化表型的膜电位改变获得的心肌分化表型的膜电位改变AB实验材料与仪器设备n实验动物: 成年GFP转基因C57BL/6小鼠（812周龄），雄性；成年C57BL/6小鼠（812周龄），雌性，购自加拿大Charles River公司。n试剂: 同第一部分实验方法n实验分组n对照组（n=3）：单纯骨髓重建术，术后4w处死，观察心肌组织中Troponin I的表达。n心 肌 梗 死 组 （ n = 4 ） ： 雌 性C57BL/6小鼠经骨髓重建后4w，行冠状动脉左前降支（LAD）结扎术建立心肌梗死模型，术后7d处死，观察心肌组织中Troponin I的表达。B GFP骨髓移植骨髓移植A 辐射破坏骨髓辐射破坏骨髓C 心梗模型建立心梗模型建立D BMSCs归巢及分化归巢