地贫筛查中的血红蛋白电泳

1、地贫筛查中的血红蛋白电泳血红蛋白的组成血红蛋白的组成 血红蛋白由血红蛋白由血红素血红素与与珠蛋白珠蛋白组成组成血红素：铁原子与原卟啉血红素：铁原子与原卟啉复合物。复合物。珠蛋白：包括珠蛋白：包括、和和珠蛋白珠蛋白6 6种。种。 血红蛋是由两种不同的鳌合了血红素的血红蛋是由两种不同的鳌合了血红素的珠蛋白肽链所形成的四聚体结构，在人体的珠蛋白肽链所形成的四聚体结构，在人体的不同发育时期，其主要的血红蛋白（不同发育时期，其主要的血红蛋白（HbHb）组）组成不同。成不同。第1页/共28页 人体发育过程中人体发育过程中H H的组成的组成发育期发育期血红蛋白血红蛋白肽链组成肽链组成胚胎期胚胎期 Gower

2、12 2 2 2Gower22 2 2 2胎儿期胎儿期Porland2 2 2 2F2 2 2 2A2 2 2 20 02 2周岁左右周岁左右F2 2 2 2A2 2 2 2A2 22 2 2 22 2周岁后以后周岁后以后A2 2 2 2A2 22 2 2 2F2 2 2 2第2页/共28页HbHb的种类的种类A.正常的Hb分三类 a.HbA(2 22 2) b.HbF(2 22 2) c.HA2 2(2 22 2)B.异常Hb有两类 a.快速异常Hb:稳定Hb b.慢速异常Hb:不稳定Hb第3页/共28页基层常用的电泳分析方法基层常用的电泳分析方法醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳琼脂凝胶电泳琼脂

3、凝胶电泳第4页/共28页 醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳主要过程主要过程琼脂凝胶电泳琼脂凝胶电泳 RBC RBC洗涤洗涤 制备溶血制备溶血 点样点样 电泳电泳 染色与脱色染色与脱色 扫描法扫描法 比色法比色法: :分区剪下色带，洗脱分区剪下色带，洗脱 分区切割色带分区切割色带, ,融化琼脂，干燥融化琼脂，干燥, ,透明透明比色比色 第5页/共28页 血红蛋白电泳设备血红蛋白电泳设备第6页/共28页醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳第7页/共28页 H J K A G D E 点样线正常 A F A2 CA 第8页/共28页第9页/共28页HbAHbA2 2的常用测定方法的常用测定方法原理原理: :根据

4、不同根据不同HbHb自带电荷的不同、分子量大小的不自带电荷的不同、分子量大小的不同、结构和等电点的不同同、结构和等电点的不同, ,在一定在一定pHpH值的缓冲液中朝值的缓冲液中朝特定方向泳动，在一定的电压下经一定时间，可分特定方向泳动，在一定的电压下经一定时间，可分离出各自的区带。离出各自的区带。主要类别主要类别: : 醋酸纤维素膜电泳法醋酸纤维素膜电泳法 琼脂凝胶电泳法琼脂凝胶电泳法HbA2HbA2含量测定含量测定: : 洗脱法洗脱法 扫描法扫描法第10页/共28页血红蛋白血红蛋白A2测定测定 不连续电泳将不连续电泳将HbAHbA2 2分离后，分别分离后，分别剪剪出膜条中的出膜条中的HbAH

5、bA和和HbAHbA2 2区带，分别放入区带，分别放入试试管中，管中，HbAHbA加蒸馏水加蒸馏水20ml20ml， HbAHbA2 2加加4ml4ml，浸泡，浸泡3030分钟，不定时摇动，使分钟，不定时摇动，使HbHb完完全全冼脱下来后混匀，用冼脱下来后混匀，用721721分光光度计以分光光度计以波波长长413nm413nm蒸馏水校正零点，读取光密度蒸馏水校正零点，读取光密度ODOD值并计算出结果。值并计算出结果。第11页/共28页抗碱血红蛋白抗碱血红蛋白(HbF)(HbF)测定测定设备：设备：721721分光光度计，刻度吸管，秒表，玻璃分光光度计，刻度吸管，秒表，玻璃漏斗漏斗，滤纸。，滤纸

6、。试剂：试剂：1/12mol/LKOH1/12mol/LKOH或或NaOHNaOH溶液，酸性半饱和溶液，酸性半饱和硫酸硫酸铵溶液。铵溶液。方法：取两支试管，测定管加入溶血液方法：取两支试管，测定管加入溶血液0.1ml0.1ml，对照对照管加入管加入0.02ml0.02ml，于测定管中加入，于测定管中加入KOH1.6mlKOH1.6ml，摇，摇匀，匀，1 1分钟时立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液分钟时立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液3.4ml3.4ml，倒倒转转6 6次，放次，放1010分钟，滤取溶液检测，用波长分钟，滤取溶液检测，用波长 540nm 540nm 蒸馏水校正零点，分别读取测定管和对照管光

7、密蒸馏水校正零点，分别读取测定管和对照管光密度度ODOD值，计算出结果。值，计算出结果。第12页/共28页 HbCSHbCS的区带多在的区带多在HbAHbA2 2位置的前位置的前后，含量低，后，含量低，2 2左右，很不稳定，左右，很不稳定，有时还可分开成三或四小区带，用有时还可分开成三或四小区带，用联苯胺染色可确定。联苯胺染色可确定。HbEHbE为慢速异常为慢速异常区带，其位置相当于区带，其位置相当于HbAHbA2 2。HbHHbH和和HbBartHbBarts s为快速异常区带。为快速异常区带。第13页/共28页全自动全自动HbHb电泳仪电泳仪目前国内使用的主要有目前国内使用的主要有美国的美

8、国的HelenaHelena电泳仪、扫描仪和分析系统。电泳仪、扫描仪和分析系统。法国的法国的SebiaSebia电泳仪、扫描仪和分析系统。电泳仪、扫描仪和分析系统。国产的金桑特电泳仪、扫描仪和分析系统。国产的金桑特电泳仪、扫描仪和分析系统。1.1.通过扫描定量给出通过扫描定量给出HbAHbA、 HbA HbA2 2和和HbFHbF值。值。2.2.异常区带通过查表确定。异常区带通过查表确定。第14页/共28页HbEHbE区带的鉴别区带的鉴别A.A.联苯胺染色联苯胺染色, ,鉴定是否为鉴定是否为Hb Hb B.B.区带位于区带位于HbA2 HbA2 区带位置上区带位置上, ,在阴性在阴性(-)(-

9、)泳动速度最慢的一种异常泳动速度最慢的一种异常Hb,Hb,难与难与A2A2区分区分开开C.HbA2C.HbA2定量在定量在10%10%以上以上, ,应考虑为应考虑为HbE HbE D.HbED.HbE纯合子只有纯合子只有HbFHbF和和HbE,HbEHbE,HbE高达高达95%95%以上以上第15页/共28页HbHHbH区带的鉴定区带的鉴定A.A.联苯胺染色联苯胺染色, ,确定是否为确定是否为HbHb B.B.在阳极在阳极(+)(+)泳动速度最大的泳动速度最大的HbHb区带区带C.HbHC.HbH包含体阳性包含体阳性(+) (+) D.pH6.5D.pH6.5缓冲液缓冲液( (酸性酸性) )唯

10、一向阳性唯一向阳性(+)(+)移动的移动的HbHb区带区带E.HbMCVMCHE.HbMCVMCHF.HbBartF.HbBarts s 区带在区带在HbHHbH区带后区带后, ,泳动速度比泳动速度比HbHHbH稍慢稍慢 些些, ,有有BartBarts s 区带区带, ,一般都有一般都有H H区带区带,H,H含量高达含量高达30%30% 多多, ,但不会超出但不会超出40%,40%,低少到低少到1%1%左右。左右。第16页/共28页HbAHbA2 2 在血红蛋白病中的意义在血红蛋白病中的意义HbAHbA2 2组成组成: : 2 2 2 2HbAHbA2 2参考值参考值:1.2%-3.5%:1

11、.2%-3.5%HbAHbA2 2含量的改变含量的改变: HbA: HbA2 2水平升高水平升高, ,是是地地贫基因携带者的特征性标志贫基因携带者的特征性标志, , 故故HbAHbA2 2定定量的准确与否量的准确与否, ,对于临床一线对于临床一线地贫基地贫基因因携带者的筛查至关重要。携带者的筛查至关重要。第17页/共28页血红蛋白（血红蛋白（Hb）病）病1.1.血红蛋白病：基因突变导致合成的珠蛋血红蛋白病：基因突变导致合成的珠蛋白白肽链肽链结构异常结构异常（如：镰状细胞血红蛋白病（如：镰状细胞血红蛋白病/HbS/HbS）2.2.地中海贫血：基因突变导致一种或多种地中海贫血：基因突变导致一种或多

12、种珠珠蛋白肽链蛋白肽链合成减少或缺如合成减少或缺如（/地贫）地贫）3.3.获得性血红蛋白病：接触或误服化学药获得性血红蛋白病：接触或误服化学药物物第18页/共28页 Hb Hb病为世界上发病率最高危害最大的单基因病为世界上发病率最高危害最大的单基因遗遗传病，被传病，被WHOWHO列为严重危害人类健康六大疾病之列为严重危害人类健康六大疾病之一。一。 全球约有全球约有4.83%4.83%的人口携带的人口携带HbHb病基因病基因, ,每年各每年各类类重型地贫重型地贫( (包括地贫复合异常包括地贫复合异常HbHb病类型病类型) )患儿的出患儿的出生生率不低于率不低于2.42.4。据此推算。据此推算,

13、,全球每年至少约全球每年至少约3535万万HbHb病患儿出生病患儿出生; ; 至今为止，全球在分子水平上已鉴定出近至今为止，全球在分子水平上已鉴定出近10001000种不同的珠蛋白突变基因，其中包括种不同的珠蛋白突变基因，其中包括700700多种异多种异常常HbHb变异体和变异体和200200余种余种地贫基因以及地贫基因以及7070多种多种地贫地贫突变突变, ,其中中国人群中异常其中中国人群中异常HbHb、地贫基因和地贫基因和地贫地贫突变突变各占各占7070多种、多种、3434种和种和1111种。种。第19页/共28页临床常见的异常血红蛋白临床常见的异常血红蛋白以速度快慢排序以速度快慢排序 1

14、. 1.血红蛋白血红蛋白E/AE/A2 2 2. 2.血红蛋白血红蛋白D/SD/S3.3.血红蛋白血红蛋白G G 4.4.血红蛋白血红蛋白K K 5.5.血红蛋白血红蛋白J J6.6.血红蛋白血红蛋白H H第20页/共28页HbHb电泳操作中的经验与教训电泳操作中的经验与教训1.RBC1.RBC洗涤：离心的速度和时间要够，生理盐水洗涤：离心的速度和时间要够，生理盐水与血与血 比例要比例要5 5：1 1，血浆与冼涤生理盐水要尽量吸干，血浆与冼涤生理盐水要尽量吸干净。净。2.2.制备溶血：加入的溜水、溶血剂与红细胞体积制备溶血：加入的溜水、溶血剂与红细胞体积要要 符合要求。离心的速度和时间要够。符

15、合要求。离心的速度和时间要够。3.3.点样点样: :血红蛋白液适量，不能太宽。血红蛋白液适量，不能太宽。4.4.电泳电泳: :醋纤膜浸泡时间要够长，平衡时间要够。醋纤膜浸泡时间要够长，平衡时间要够。5.5.染色与脱色染色与脱色: :时间要够。时间要够。第21页/共28页1.1.正常新生儿正常新生儿 9.9.轻型轻型地中海贫血地中海贫血2.2.胎儿水肿综合征胎儿水肿综合征 10.10.异常异常HbDHbD杂合子杂合子3.3.地中海贫血地中海贫血1(1(脐血脐血) ) 11.11.异常异常HbGHbG杂合子杂合子4.HbCS-HbH4.HbCS-HbH病型病型 12.12.轻型轻型地中海贫血复合地

16、中海贫血复合HbEHbE5.5.重型重型地中海贫血复合地中海贫血复合HbE 13.HbE 13.正常成人正常成人 6.6.轻型轻型地中海贫血地中海贫血 14.14.正常成人正常成人 7.7.异常异常HbKHbK杂合子杂合子 15.HbH 15.HbH病病8.8.异常异常HbJHbJ杂合子杂合子 第22页/共28页 谢谢！谢谢！地贫防治网站：地贫防治网站：联系电话：联系电话：28702952870295（地贫检验）（地贫检验） 28701352870135（地贫输血）（地贫输血） 28706402870640（遗传咨询）（遗传咨询）28706402870640（药物邮购（药物邮购） 第23页/共

17、28页 人体发育过程中人体发育过程中H H的组成的组成发育期发育期血红蛋白血红蛋白肽链组成肽链组成胚胎期胚胎期 Gower12 2 2 2Gower22 2 2 2胎儿期胎儿期Porland2 2 2 2F2 2 2 2A2 2 2 20 02 2周岁左右周岁左右F2 2 2 2A2 2 2 2A2 22 2 2 22 2周岁后以后周岁后以后A2 2 2 2A2 22 2 2 2F2 2 2 2第24页/共28页 醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳主要过程主要过程琼脂凝胶电泳琼脂凝胶电泳 RBC RBC洗涤洗涤 制备溶血制备溶血 点样点样 电泳电泳 染色与脱色染色与脱色 扫描法扫描法 比色法比色法: :分区剪下色带，洗脱分区剪下色带，洗脱 分区切割色带分区切割色带, ,融化琼脂，干燥融化琼脂，干燥, ,透明透明比色比色 第25页/共28页HbEHbE区带的鉴别区带的鉴别A.A.联苯胺染色联苯胺染色, ,鉴定是否为鉴定是否为Hb Hb B.B.区带位于区带位于HbA2 HbA2 区带位置上区带位置上, ,在阴性在阴性(-)(-)泳动速度最慢的一种异常泳动速度最慢的一种异常Hb,Hb,难与难与A2A2区分区分开开C.HbA2C.HbA2定量在定量在10%10%以上以上, ,应考虑为应考虑为HbE HbE D.HbED.HbE纯合子只有纯合子只有HbFHb