基因工程基因工程的载体

1、基因工程基因工程的载体2022-5-7发展概况发展概况 1.1.第一阶段（第一阶段（19771977年前）：年前）：天然质粒和重组质粒的利用，天然质粒和重组质粒的利用，如如pSC101, colE1, pCR, pBR313pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 (1977, Bolivar pBR322 (1977, Bolivar et alet al) ) 2.2.第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如位点区和新的遗传标记基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。 3.3

2、.第三阶段：第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如同要求，如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含T3T3，T7T7，sp6sp6启动子载体，表启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。达型载体及各种探针型载体。 第1页/共66页2022-5-7第三章第三章 基因工程的载体基因工程的载体 作为基因工程载体的基本功能基本功能1. 运送外源基因高效转入受体细胞2. 为外源基因提供复制能力或整合能力3. 为外源基因的扩增或表达提供条件第2页/共66页2022-5-7第三章第三章 基因工程的载体基因工程的载体 作为基因工程载体必须具

3、备的基本条件基本条件1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3. 长度尽可能小，以提高其载装能力4. 具有多种单一的酶切位点5. 具有合适的选择性标记第3页/共66页2022-5-7遗传标记基因遗传标记基因 1. 1. 标记基因的作用标记基因的作用 1 1）指示外源）指示外源DNADNA分子（载体或重组分子）分子（载体或重组分子）是否进入宿主是否进入宿主细胞细胞 这种指示可以是选择性的（这种指示可以是选择性的（ApApr r ，TcTcr r ，KanKanr r），也可以），也可以是非选择性的（如是非选择性的（如lacZlacZ） 2

4、 2）指示外源指示外源DNADNA分子分子是否插入载体分子是否插入载体分子形成了重组子。形成了重组子。 * * 这种指示也可以是这种指示也可以是选择性选择性的（如的（如TcTcS S），也可以是），也可以是非选非选择性择性的（如的（如TcTcS S， lacZ, GUSlacZ, GUS），绝大多数为后者。），绝大多数为后者。 * * *有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的多采用非选择性的检测性标记基因。有的基因是不

5、能用作检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（选择性标记基因（lacZlacZ，GUSGUS等）。等）。第4页/共66页2022-5-72.2.标记基因的种类标记基因的种类 1 1）抗性标记基因抗性标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子） a.a. 抗生素抗性基因抗生素抗性基因: Ap: Apr r ，TcTcr r ，CmCmr r，KanKanr r，G418G418r r，HygHygr r ，NeoNeor r b. b. 重金属抗性基因重金属抗性基因: Cu: Cur r ，ZnZnr r ，Cd Cd r r c. c. 代谢抗性基因代谢抗性基因: TK:

6、 TK，抗除草剂基因，抗除草剂基因 2 2）营养标记基因营养标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1TRP1，URA3URA3，LEU2LEU2，HIS4HIS4等。等。 3 3）生化标记基因生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, lacZ, GUS, CATCAT 4 4） 噬菌斑噬菌斑 第5页/共66页2022

7、-5-73.3.使用标记基因注意要点使用标记基因注意要点 1 1）标记基因与宿主细胞）标记基因与宿主细胞 2 2）标记基因产物的作用机制）标记基因产物的作用机制: Ap: Apr r 3 3）标记基因的结构与适用范围）标记基因的结构与适用范围: : 基因启动子基因启动子, , 翻译起翻译起始序列始序列, , 密码子偏爱性密码子偏爱性 4 4）标记基因的结构变化对功能的影响）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS: LacZ, GUS 4.4.常用的遗传标记基因常用的遗传标记基因 1) 1) 四环素抗性基因四环素抗性基因（TcTcr r） Tetracycline Tetracyc

8、line 可结合在核糖体可结合在核糖体30s30s亚基中的一种亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种编码一种399 AAs399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。素分子进入细菌细胞。第6页/共66页2022-5-72) 2) 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（ApApr r） AmpicillinAmpicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。ApApr r抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周

9、间质的酶，催化抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化内酰胺内酰胺环的环的水解水解，使氨苄青霉素失活。，使氨苄青霉素失活。3) 3) 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（CmCmr r） ChlorophenicolChlorophenicol可结合在核糖体可结合在核糖体50 S50 S亚基上，阻止蛋白质合亚基上，阻止蛋白质合成。成。CmCmr r基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化乙酰化，导致乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。的氯霉素不能结合在核糖体上。4) 4) 卡那霉素卡那霉素(Kan(Kanr r), ), 新霉素新霉素(Neo(Neo

10、r r) )和和G418G418抗性抗性(G418(G418r r) )基因基因 KanamycinKanamycin，NeomycinNeomycin和和G418G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5Tn5和和Tn903Tn903的的KanKanr r抗性基因均可使这类抗生素抗性基因均可使这类抗生素磷酸化磷酸化，使之不能进入细胞，使之不能进入细胞内。内。第7页/共66页2022-5-75 5）半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ lacZ 和和lacZl

11、acZ） 半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021 AAs1021 AAs，基因产物不具酶活，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链和链。前者负责四聚体装配，后者具链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作互补作用用。这两个部分可独立存在，。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为分别由两个基因编码。为链编链编码的基因称之为码的基因称之为lacZlacZ( (编码编码145 AA

12、s)145 AAs)。这两个基因（。这两个基因（LacZLacZ和和LacZLacZ）均可作为标记基因。）均可作为标记基因。 半乳糖苷酶基因的优点半乳糖苷酶基因的优点: : a.a.酶催化酶催化X-GalX-Gal水解为兰色产物，检测直观水解为兰色产物，检测直观 b. lacZb. lacZ编码编码5-5-端可容许很大的变化而不影响酶活性端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZc. lacZ和和链基因的分别表达可使载体小而容量大链基因的分别表达可使载体小而容量大第8页/共66页2022-5-76 6）葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（GUSGUS） 该基因编码一种可分解各种该基因编码

13、一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述解酶。该标记基因除具有上述lacZlacZ基因的优点外，它的适用范围十基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。分广泛，因为许多生物中没有这种基因。 7 7）荧光素酶基因荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入生荧光，若在反应中加入CoACoA，可使灵敏度提高，可使灵敏度提高1010倍；或由发光细倍；或由发光细菌（菌（Photobacterium fischeriPhotoba

14、cterium fischeri）产生的荧光素酶，它与）产生的荧光素酶，它与FMN-FMN-氧化氧化还原酶联用，通过还原酶联用，通过NAD(P)HNAD(P)H的变化测定酶活的变化测定酶活。 8 8）发光蛋白质基因发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。大肠杆菌菌落呈蓝色。第9页/共66页2022-5-7 分子克隆载体的复制起点与种类分子克隆载体的复制起点与种类1. 1. 复制起点的种类复制起点的种类 1) 1) 核内复制起点核内复制起点 a. a. 染色体复制起点染色体复制起点原核生物原核

15、生物( (环状环状) )和真核生物和真核生物( (线状线状) )染色体染色体 b. b. 染色体外复制起点染色体外复制起点 i. i. 质粒质粒DNA,RNA,DNA,RNA,线状线状, ,环状环状, ,单链单链, ,双链双链 ii. ii. 病毒病毒同上同上, , 细胞内和病毒颗粒内细胞内和病毒颗粒内 2) 2) 核外复制起点核外复制起点 a. a. 线粒体线粒体所有真核细胞所有真核细胞 b. b. 叶绿体叶绿体所有绿色植物细胞所有绿色植物细胞 原核与真核生物原核与真核生物两种质体中亦可能含有质粒两种质体中亦可能含有质粒第10页/共66页2022-5-73. 3. 按复制起点划分克隆载体按复

16、制起点划分克隆载体 1) 1) 质粒复制型质粒复制型复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体 2) 2) ARSARS复制型复制型ARSARS（autonomus replicative sequence)autonomus replicative sequence)，或，或称染色体复制型称染色体复制型3) 3) 病毒复制型病毒复制型复制起点来自病毒，若为复制起点来自病毒，若为RNARNA病毒，必须反转病毒，必须反转录为录为cDNAcDNA。 4) 4) 混合复制型混合复制型 a.a. 同种生物复制起点混合同种生物复制起点混合质粒形式存在；质粒或病毒质粒形式存在；质粒或

17、病毒形式存在形式存在第11页/共66页2022-5-7例：大肠杆菌（例：大肠杆菌（E.coliE.coli）的）的噬粒噬粒（phagemidphagemid）载体既含有来自质粒）载体既含有来自质粒的复制起点，又含有来自噬菌体（如的复制起点，又含有来自噬菌体（如M13M13）的复制起点。在不）的复制起点。在不同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制，从而同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制，从而获得质粒获得质粒ds- DNAds- DNA或噬菌体或噬菌体ss ss DNADNA又如：酿酒酵母（又如：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyce

18、s cerevisiae）的某些载体既含有）的某些载体既含有质粒（质粒（22）复制起点，又含有）复制起点，又含有ARSARS片段片段 b.b. 不同生物复制起点混合不同生物复制起点混合穿梭载体穿梭载体（shuttle vectorshuttle vector）两种两种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中以质粒或病毒形式存在生物中以质粒或病毒形式存在 * * 穿梭载体范围穿梭载体范围：细菌：细菌细菌（放线菌），细菌细菌（放线菌），细菌酵母菌，酵母菌， 细菌细菌真菌，细菌真菌，细菌动物动物第12页/共66页2

19、022-5-7分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝数的关系数的关系 1. 1. 复制起点种类与拷贝数间的关系复制起点种类与拷贝数间的关系1) 1) 质粒复制起点类型：低拷贝（严紧型，质粒复制起点类型：低拷贝（严紧型，1-2 copies1-2 copies，受宿主染色，受宿主染色体基因控制）；高拷贝（松弛型，体基因控制）；高拷贝（松弛型，20 copies20 copies，受宿主染色体控，受宿主染色体控制较弱）制较弱） 2) ARS2) ARS型载体：拷贝数较高（约型载体：拷贝数较高（约20 copies20 copies）3) 3) 病毒型复

20、制起点：高拷贝病毒型复制起点：高拷贝 2.2.标记基因与拷贝数的关系标记基因与拷贝数的关系 若标记基因表达效率高，宿主细胞可能不大量产生标记基若标记基因表达效率高，宿主细胞可能不大量产生标记基因以满足选择压力要求，因而载体拷贝数会降低。对于不同标记因以满足选择压力要求，因而载体拷贝数会降低。对于不同标记基因，可采取相应方法提高其拷贝数。基因，可采取相应方法提高其拷贝数。 如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。 对于营养标记基因，可降低该基因的表达效率或更换其他低对于营养标记基因，可降低该基因的表达效率或更换其他低效率的标记基因效率的标记基因第13页

21、/共66页2022-5-7分子克隆载体的转化频率和稳定性分子克隆载体的转化频率和稳定性 1. 1. 影响转化频率的因素影响转化频率的因素 1) 1) 复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点 2) 2) 标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因 2.2.影响稳定性的因素影响稳定性的因素 1)1)复制起点类型复制起点类型低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定性低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定性差差 2)2)选择压力选择压力 3)3)载体在宿主细胞中的状态载体在宿主细胞中的状态自主复制型和整合型自主复制型和整合型 宿主细胞的遗传特性和生

22、理特性宿主细胞的遗传特性和生理特性第14页/共66页2022-5-7第一节第一节 E.coliE.coli 质粒载体质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质1、定义 质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）第15页/共66页2022-5-7第一节第一节 E.coliE.coli 质粒载体质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征 自主复制性自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自

23、主复制 第16页/共66页2022-5-7第一节第一节 E.coliE.coli 质粒载体质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征 不相容性不相容性 利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争 ，几种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。 第17页/共66页2022-5-7第一节第一节 E.coliE.coli 质粒载体质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征 可扩增性可扩增性 pMB1或ColEI类质粒在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯

24、霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增氯霉素扩增。 第18页/共66页2022-5-7第一节第一节 E.coliE.coli 质粒载体质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征 携带遗传标记携带遗传标记 在实验室中将质粒通过物理方法导入受体细胞，但是即使在最佳条件下，受体细胞中也只有少数细胞能稳定地接受质粒，要想找到这些进入了质粒的受体细胞，就要利用载体质粒上的遗传标记，天然质粒上碰巧携带许多功能基因，它们便可被用作选择标记。 第19页/共66页2022-5

25、-7第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质3、分类 接合型和非接合型 严紧性和松弛型在基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒第20页/共66页2022-5-7第一节第一节 E.coliE.coli 质粒载体质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建1、理想质粒载体所具备的条件 质粒较小 质粒带有可供选择的标记 带有尽可能多的单一限制酶切位点 应有较高的基因表达能力第21页/共66页2022-5-7第一节第一节 E.coli E.coli 质粒载体质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建2、质粒人工构建的目的 天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用作基因工

26、程的载体必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 （2）增加或减少合适的酶切位点增加或减少合适的酶切位点，便于重组 （3）缩短长度缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量增加装载量 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件加装特殊的基因元件方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。第22页/共66页2022-5-71.多拷贝质粒 经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。 2. 测序质粒 拷

27、贝数高，加装测定顺序所必需的序列，如多切口接头，便于各种片段方便克隆 3. 整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上 4.穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制 5.表达质粒 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达 6.探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件，他通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等。 人工构建的质粒根据其功能及用途分为：第23页/共66页2022-5-7第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建3、人工组建克

28、隆载体-pBR322 大小：4.3 kb 选择标记：Apr Tcr 单一酶切位点：EcoR Hind BamH PstI Sal 等第24页/共66页2022-5-7第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建3、人工组建克隆载体-pBR322 用于组建pBR322的三个亲本质粒的特征： pSE2124：Apr基因 pMB8 :Col EI松弛型复制子 pSC101:Tcr基因第25页/共66页2022-5-7第26页/共66页2022-5-7第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建4、人工组建克隆载体-pUC系列质粒 多拷贝大肠杆菌型质粒，包括

29、pUC8/9 pUC18/19 pUC的亲本质粒是pBR322,包括如下四个部分： 来自 pBR322 的复制起点（ori） 来自pBR322的Apr基因（核甘酸序列已发生改变） E.coli的lacZ基因及其启动子组成lacZ 基因 lacZ内部人工组装了一个多克隆位点（MCS）它含有如下单一酶切口：EcoRI、SstI、KpnI、SmaI、BamHI、XbalI、PstI、SphI、HindIII，。第27页/共66页2022-5-7第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建4、人工组建克隆载体-pUC系列质粒 pUC系列质粒的优点 更小的相对分子量和更高的拷贝数

30、可用组织化学法检测重组体 具有多克隆位点（MCS）区段是基因工程中目前最常用的E.coli克隆载体第28页/共66页2022-5-7第一节 E.coli 质粒载体三、质粒（plasmid）的制备1. 碱裂解法 （1）将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中 （2）加溶菌酶裂解细菌细胞壁 （3）加NaOH与SDS的混合溶液，去膜释放内含物 （4）加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质 （5）离心取上清液，用苯酚氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质及核酸酶 （6）乙醇或异丙醇沉淀水相质粒 （7）无DNase的RNase处理残余RNA第29页/共66页2022-5-7第一节 E.co

31、li 质粒载体三、质粒（plasmid）的制备2.沸水浴法 （1）将菌体悬浮在含有EDTA和Triton X-100的缓冲液中 （2）加溶菌酶破细胞壁 （3）放入沸水浴中煮40秒 （4）离心，用无菌牙签挑去沉淀物 （5）乙醇异丙醇沉淀第30页/共66页2022-5-7一、一、Ti质粒载体质粒载体1.根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与与Ti质粒质粒 G-菌，可侵入菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crowngalltumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征：冠瘿瘤细胞具有以下特征：i.不需要补充植物激素便可进行离体

32、培养不需要补充植物激素便可进行离体培养 ii.ii.合成肿瘤特有的化合物合成肿瘤特有的化合物冠瘿碱冠瘿碱(opine)(opine)，能专一，能专一 的为根癌农杆菌所利的为根癌农杆菌所利用用. . 这两个特征由这两个特征由TiTi质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。 三、其他质粒载体第31页/共66页2022-5-7二、二、酿酒酵母酿酒酵母(Saccharomycea cerevisiae)的分子克隆载体的分子克隆载体1.克隆载体的种类克隆载体的种类1)按复制方式划分按复制方式划分i.自主复制型；自主复制型；ii.整合型（非自主复制型）整合型

33、（非自主复制型）YeastIntegrationplasmid(YIp)2)按复制子来源划分按复制子来源划分 i.附加体型附加体型-yeastepisomalplasmid(YEp)，其复制起点来自于酿，其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒酒酵母的天然质粒-2质粒质粒ii.染色体复制型染色体复制型-YeastReplicatingplasmid(YRp)，其复制起点来，其复制起点来自染色体上的自主复制序列自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomousreplicatingsequence)三、其他质粒载体第32页/共66页2022-5-74.pYAC载体载体 酵母菌人工染色体酵母菌人工染

34、色体(yeastartificialchromosome,YAC)广泛用于构建高等广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建动植物基因组文库的构建,由由YLp经适当改造后构建成经适当改造后构建成pYAC载体。载体。pYAC载体具有以下特点：载体具有以下特点： 1）双双TEL位点；位点；2）三个酵母菌遗传标记基因；三个酵母菌遗传标记基因；3）一个一个SUP4基因用于检测重组子基因用于检测重组子，其原理是：，其原理是：SUP4是是tRNAtyr的赭色抑的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的制突变基因，但把该基因转入酵母菌的ade2赭色突变体时，宿主菌为白色赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在菌落

35、，要是在SUP4基因中插入外源基因中插入外源DNA片段后在转化片段后在转化ade2宿主菌，转化子宿主菌，转化子成红色菌落。成红色菌落。第33页/共66页2022-5-7YAC:酵母人工染色体（yeast artificial chromosome）目前能容纳最大外源DNA片断的载体. YAC载体有两个臂，每个臂的末端有一个端粒（TEL），臂上有着丝粒（CEN）、自主复制序列（ARS）、选择标记（TRP1和URA3）装载容量：50Kb-2000KbYAC载体是以质粒的形式出现，如：pYAC2第34页/共66页2022-5-7第35页/共66页2022-5-7第二节 噬菌体载体一、l噬菌体的分子生

36、物学l噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和l DNA组成1. l-DNA的物理图谱 l-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端），称为cos区，全长48.5kb。 左边是外壳蛋白的基因，右边是负责裂解宿主细胞，DNA自主复制以及调控基因，中间是负责与宿主染色体DNA遗传重组整合的基因第36页/共66页2022-5-7第二节 噬菌体载体二、l噬菌体载体的构建天然的lDNA由于包装上下限的存在以及同种酶切口太多不适合作为重组实验的载体1. 1. 缩短长度缩短长度 野生型lDNA包装的上限为50.9kb，本身长度为48.5kb，那么外源DNA片段允许插入的大小至多

37、为2.4kb，这样才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒，如果将缩短便提高装载量。其实lDNA上约有40-50%的DNA片段（J-N区间）是复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。第37页/共66页2022-5-7第二节 噬菌体载体二、l噬菌体载体的构建1.1.缩短长度缩短长度 插入型载体插入型载体 该类载体经改造后的长度为37kb，有单一酶切位点，便于外源DNA的插入。其允许插入片段最大为13.9kb。根据插入失活效应的特异性分为两种亚型：免疫功能失活插入型载体半乳糖苷酶失活插入型载体第38页/共66页2022-5-7第二节 噬菌体载体二、l噬菌体载体的构建1.1.缩短长度缩短长度 替换型载

38、体（取代型载体）替换型载体（取代型载体） 该类载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。 第39页/共66页2022-5-7第二节 噬菌体载体二、l噬菌体载体的构建2.2.删除重复的酶切口删除重复的酶切口插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须是唯一的；取代型载体在取代位点有两个酶切口，多了也不行天然的l-DNA上有许多重复的酶切口，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切口必须被删除。第40页/共6

39、6页2022-5-7第二节 噬菌体载体二、l噬菌体载体的构建3. 构建琥珀型密码子突变体 终止密码子有三种：UAA（赭石）；UGA（乳白）；UAG（琥珀） 琥珀型突变：CAG-UAG（stop） 将野生型-DNA上A和B两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG，当这种l-DNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的A和B头部蛋白，也就不能被包装，不能裂解细菌。阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。第41页/共66页2022-5-7第二节 噬菌体载体三、l l-DNA作为载体的优点1.l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染

40、大肠杆菌2.l-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载量3.重组l-DNA的筛选较为方便4.4. 重组l-DNA分子的提取比质粒容易第42页/共66页2022-5-7第三节 Cosmid载体一、Cosmid的定义 Cosmid（cos sitecarrying plasmid）：是一类由人工构建的含有l l-DNA两端cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。质粒复制子包括：一个复制起点和两个抗性基因Apr 、Tcr。第43页/共66页2022-5-7Cosmid载体的特点载体的特点1.具有具有噬菌体的特性；噬菌体的特性；2.具有质粒载体的特性；具有质粒载体的特

41、性；3.具有较高容量的克隆能力；具有较高容量的克隆能力；4.具有与同源性序列的质粒进行重组的能力具有与同源性序列的质粒进行重组的能力第44页/共66页2022-5-7第三节 Cosmid载体二、Cosmid的构建 Cosmid含有l-DNA两端cos区的质粒。由于l-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，均1.5kb长。如果将这一小段DNA与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载更大的外源DNA片段，同时它仍可象l-DNA一样，在体外被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌，与噬菌体DNA所不同的是，Cosmid不能在体内被包装，更不能裂解细胞，它的制备与质粒相同。进

42、入细胞后，通过质粒上的复制子进行复制。第45页/共66页2022-5-7第三节 Cosmid载体三、Cosmid的优越性1. 能象l-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞2. 可以装载比质粒或l-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该Cosmid最大可装载45.9kb的外源DNA3. 由于携带质粒的选择标记，便于筛选4. 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。第46页/共66页2022-5-7采用Cosmid作载体的困难载体自身只相当于可以插入片段的载体自身只相当于可以插入片段的1/101/10左右，因此往往会出现载体同左右，因此往往会

43、出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出析，后来专门选出303045kb45kb的外源的外源DNADNA插入载体插入载体DNADNA，此时，每个载体只，此

44、时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；粒的限度；细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一筛选所需的含某一DNADNA片段的菌落很费时间。片段的菌落很费时间。第47页/共66页2022-5-7第四节 单链DNA噬菌体M13一、M13单链噬菌体的分子生物学 M13是一种单链DNA噬菌体，总长6407bp，闭合环状正链ssDNA。噬菌体首先吸附大肠杆菌的雄性鞭毛上，然后穿过鞭毛内孔将DNA注入细菌

45、体内。 单链DNA利用宿主细胞的复制另一条链（负链），形成dsDNA（RFDNA），故M13能以dsDNA的形式从细胞中分离作为克隆载体宿主细胞不会发生裂解。第48页/共66页2022-5-7M13载体 具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。 可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（）链，所以M13载体克隆的外源DNA片段在子

46、代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全取决于外源克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。 第49页/共66页2022-5-7第四节 单链DNA噬菌体M13二、M13-DNA作为载体的优点及用途1、最为显著的优点是它能使插入的外源DNA片段变成单链，单链DNA的用途： 用于双脱氧末端终止测定DNA顺序用于单链DNA的定点诱变 用于合成探针第50页/共66页2022-5-7第四节 单链DNA噬菌体M13二、M13-DNA作为载体的优点及用途2. 筛选方便 感染的受体细胞生长缓慢，形成浑浊圈，易于挑选辨认而且重组分

47、子越大，浑浊圈的浑浊度亦越大，这样可以直接辨认哪些菌落含有外源DNA片段。第51页/共66页2022-5-7第五节 其他载体一、BAC：细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome） 基于F因子建立起来的单拷贝E.coli载体，装载容量300Kb，稳定性较好，用于克隆大片端DNA，从而构建整个人类基因组文库第52页/共66页2022-5-7BAC载体第53页/共66页2022-5-7 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质

48、粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等。动物分子克隆载体第54页/共66页2022-5-7（二）（二）病毒型载体病毒型载体1.特点特点 1)可在动物细胞中形成病毒颗粒（形态构成组分来自天然病毒可在动物细胞中形成病毒颗粒（形态构成组分来自天然病毒或原病毒细胞）或原病毒细胞）2)DNA转移效率高，但必须与天然转移效率高，但必须与天然(辅助辅助)病毒共感染动物细胞病毒共感染动物细胞3)大多数被感染动物细胞将是致死的，但有少数病毒（如逆病大

49、多数被感染动物细胞将是致死的，但有少数病毒（如逆病毒）载体可稳定整合到染色体毒）载体可稳定整合到染色体DNA中。中。4)插入病毒载体的外源基因只能在动物细胞中作瞬时表达插入病毒载体的外源基因只能在动物细胞中作瞬时表达2.载体种类载体种类根据构建载体的病毒基因大小可分为两类：根据构建载体的病毒基因大小可分为两类：第55页/共66页2022-5-71）复制型：由小分子病毒DNA构建而成，具复制起点，其克隆位点可在病毒DNA之内，亦可在病毒DNA之外，这类载体有的容量十分有限（如SV40），有的则很大（如HSV），其容量大小主要取决于病毒外壳蛋白的包装能力。2）非复制型：这类载体是在细菌克隆载体中插

50、入一段病毒DNA（不含复制起点）。当外源DNA插入该载体后，与相应的天然病毒一起感染动物细胞，外源DNA可借助两病毒DNA同源部分的重组插入天然病毒。这类载体特别适合于那些较大的病毒DNA分子。实例：痘病毒长180kb,编码150多种多肽，整个生存阶段均在细胞质内，它能合成DNA复制、转录和转录后修饰的各种酶类，由此病毒构建的非复制型载体就是在细菌载体中插入一段痘病毒DNA.第56页/共66页2022-5-7（三）质粒型载体 1.特点：不能形成病毒颗粒，以高拷贝质粒形式存在于动物细胞内，不导致动物细胞死亡。2.组成：pMB1和病毒复制起点（如SV40，BPV，EBV等），适合于细菌和动物细胞的

51、选择标记基因。 3.实例1)SV40质粒载体SV40具如下物理图谱，5243bp,为两种抗原（T-和t-抗原）和三种病毒衣壳蛋白编码。其中T-抗原参与SV40的有效感染，并能特异地结合在病毒DNA复制起点上，这种结合对DNA复制是必须的。因复制起点与该基因的启动子顺序相近，故它本身的表达也受到T-抗原的控制。当含SV40复制起点的质粒型载体或重组DNA分子转入COS细胞后(含有SV40的T-抗原)可大量复制,其拷贝数可达20-40万。第57页/共66页2022-5-7发展概况发展概况 1.1.第一阶段（第一阶段（19771977年前）：年前）：天然质粒和重组质粒的利用，天然质粒和重组质粒的利用

52、，如如pSC101, colE1, pCR, pBR313pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 (1977, Bolivar pBR322 (1977, Bolivar et alet al) ) 2.2.第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如位点区和新的遗传标记基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。 3.3.第三阶段：第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如同要求，如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含T3T3，T7T7，sp6sp6启动子载体，表启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。达型载体及各种探针型载体。 第58页/共66页2022-5-72) 2) 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（ApApr r） AmpicillinAmpicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。ApApr r抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化内酰胺内酰胺环的环的水解水解，使氨苄青霉素失活。，使氨苄青霉素失活。3) 3) 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（CmCmr r） Chloro