核酸化学2DNA的结构和特性

1、会计学1核酸化学核酸化学2DNA的结构和特性的结构和特性第1页/共106页第2页/共106页双螺旋分子中糖分子与纵轴双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，与碱基平面垂直。平行，与碱基平面垂直。稳定双螺旋稳定双螺旋结构的作用结构的作用力为氢键和力为氢键和碱基堆积力碱基堆积力（即疏水作（即疏水作用）。用）。第3页/共106页第4页/共106页DNA的大小：的大小：噬菌体噬菌体T2DNA长约长约50 mE-coli DNA 长约长约1 mm人生殖细胞人生殖细胞DNA长约长约1 m第5页/共106页第6页/共106页共价闭合环状共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,

2、 cccDNA）的）的超螺旋结构超螺旋结构（superhelical structure） 形成超螺旋的基础形成超螺旋的基础: : DNA双螺旋的扭双螺旋的扭曲形成超螺旋曲形成超螺旋（superhelix） 超螺旋超螺旋：指双螺旋环状：指双螺旋环状分子再度螺旋化即成为分子再度螺旋化即成为超螺旋结构。超螺旋结构。第7页/共106页自从自从1965年年Vinograd等人发现多瘤病等人发现多瘤病毒的毒的环形环形DNA的超螺旋的超螺旋以来，现已知道绝以来，现已知道绝大多数原核生物的大多数原核生物的DNA都是都是共价（封）闭共价（封）闭环环（covalently closed circle, 简称简称

3、cccDNA 分子）。分子）。对于真核生物来说，虽然其染色体上对于真核生物来说，虽然其染色体上多为线形多为线形DNA分子，但其分子，但其DNA均与蛋白质均与蛋白质结合，两个结合，两个结合点之间的结合点之间的DNA形成类似形成类似CCC分子的环结构分子的环结构（loop），同样具有超），同样具有超螺旋形成。螺旋形成。第8页/共106页拓朴学拓朴学（topology）是专门研究物体）是专门研究物体变形后仍然保留下来的结构特性。变形后仍然保留下来的结构特性。第9页/共106页第10页/共106页 噬菌体噬菌体DNA在不同的生活周期可以以在不同的生活周期可以以环形环形或或线线形形存在，线状存在，线状D

4、NA的两端有粘末端（的两端有粘末端（cos位点，位点，cohensive-end site），有助于），有助于DNA连接酶将互补的连接酶将互补的粘末端连成环状。其中会带来拓朴学的问题。粘末端连成环状。其中会带来拓朴学的问题。一段长一段长260 bp的的B-DNA，周期数为周期数为25，把它们连接成环，此时的，把它们连接成环，此时的DNA为为松弛型松弛型DNA。若将上述。若将上述DNA先先拧松拧松2周后再连接成环周后再连接成环，可以形成两种环形，可以形成两种环形DNA，一种称，一种称解链环形解链环形DNA（螺旋周数（螺旋周数23）和）和突环突环。另一种为。另一种为超螺旋超螺旋DNA，螺周数仍为螺

5、周数仍为25，但同时具有，但同时具有2个个超螺旋周超螺旋周。从力能学看，超螺旋更易形成。超螺旋。从力能学看，超螺旋更易形成。超螺旋DNA具有更为致密的结构，可以将具有更为致密的结构，可以将很长的很长的DNA分子压缩在一个较小的体积。分子压缩在一个较小的体积。生物体的生物体的DNA绝大多数是以超螺旋形式存在的。超螺旋绝大多数是以超螺旋形式存在的。超螺旋DNA密度较大，离密度较大，离心场中较线形或开环心场中较线形或开环DNA移动快，凝胶电泳时泳动的速度也较快。移动快，凝胶电泳时泳动的速度也较快。DNA拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶(topoisomeras

6、e)来实现的。来实现的。第11页/共106页图图 2420 bp环形双股DNA，形成42匝螺旋。切开后旋松6圈后再连成环状，会形成两种构象结构。第12页/共106页 超螺旋超螺旋DNA可采取两种拓扑学可采取两种拓扑学上相当的形式。一种相当于上相当的形式。一种相当于双螺旋双螺旋绕圆柱体旋转绕圆柱体旋转；另一种相当于；另一种相当于双螺双螺旋相互盘绕旋相互盘绕。超螺旋的这两种形式。超螺旋的这两种形式可以相互转变。可以相互转变。第13页/共106页图图 3第14页/共106页 DNA结构的上述变化可以用数学式来结构的上述变化可以用数学式来表述：表述：L = T W L称为称为DNA的连接数的连接数，它

7、是，它是DNA的一股链绕另一的一股链绕另一股链盘绕的次数，它代表环型双螺旋股链盘绕的次数，它代表环型双螺旋DNA分子的拓扑分子的拓扑特性。在不发生链的断裂时特性。在不发生链的断裂时, 它是一常数。例如，前图它是一常数。例如，前图中中DNA原来的原来的L为为42，放松后为，放松后为36。在右手双螺旋中，。在右手双螺旋中，L规定为正。规定为正。T称为盘绕数称为盘绕数，它代表，它代表DNA的一股链绕双螺旋轴所的一股链绕双螺旋轴所做的完整的旋转数。对做的完整的旋转数。对B-DNA而言，它等于而言，它等于DN A的碱的碱基数除以基数除以10（晶体中）。（晶体中）。W为超盘绕数为超盘绕数，代表双螺旋轴，代

8、表双螺旋轴在空间的转动数，在空间的转动数，T和和W是可变的是可变的。第15页/共106页 前图中，其中原来的环型前图中，其中原来的环型DNA的的L=42，T=42，故，故W=0，即不存在，即不存在超螺旋。它螺旋轴处在同一平面中超螺旋。它螺旋轴处在同一平面中，分子处于松弛状态。在保留一单，分子处于松弛状态。在保留一单链区的链区的DNA分子中，分子中，L和和T都为都为36，分子仍未形成超螺旋。在超螺旋分子仍未形成超螺旋。在超螺旋DNA中，中，L仍为仍为36，若使，若使T保持未松保持未松开前的开前的42，W就成就成-6，即成为超，即成为超盘绕盘绕 6次的负超螺旋次的负超螺旋。第16页/共106页超螺

9、旋是超螺旋是DNA三级结构的一种普遍形式。三级结构的一种普遍形式。双双螺旋螺旋DNA的松开导致形成负超螺旋的松开导致形成负超螺旋，而，而DNA的的拧紧则导致形成正超螺旋拧紧则导致形成正超螺旋。 天然的天然的DNA都呈负超螺旋都呈负超螺旋，但在，但在体外可得正超体外可得正超螺旋螺旋。溴乙锭、放线菌素。溴乙锭、放线菌素D等的分子都是扁平的等的分子都是扁平的，它们可以嵌入，它们可以嵌入DNA的碱基对之间。溴乙锭分的碱基对之间。溴乙锭分子的嵌入能使相邻碱基对的间隔增至子的嵌入能使相邻碱基对的间隔增至0.7 nm。对。对一个呈负超螺旋的环形一个呈负超螺旋的环形DNA分子来说，溴乙锭分子来说，溴乙锭的嵌人

10、并没有改变连接数，但盘绕数减少，结果的嵌人并没有改变连接数，但盘绕数减少，结果超螺旋数向相反方向改变。随着溴乙锭量的增加超螺旋数向相反方向改变。随着溴乙锭量的增加，负超螺旋，负超螺旋DNA就转变为松弛态；溴乙锭的再就转变为松弛态；溴乙锭的再进一步增加，进一步增加，DNA就转变为正超螺旋。就转变为正超螺旋。第17页/共106页第18页/共106页Gyrase：促旋酶，旋转酶：促旋酶，旋转酶Topoisomerase：拓扑异构酶：拓扑异构酶第19页/共106页DNA双螺旋为右旋螺旋。细双螺旋为右旋螺旋。细胞中的胞中的环状环状DNA一般呈一般呈负超负超螺旋螺旋，即右旋螺旋不足导致，即右旋螺旋不足导致

11、部分碱基不形成配对，分子部分碱基不形成配对，分子通过整体拓扑学上的右旋来通过整体拓扑学上的右旋来补足右旋螺旋的不足，在数补足右旋螺旋的不足，在数学上呈学上呈1：1，即分子整体右，即分子整体右旋一圈来补双螺旋上的一圈旋一圈来补双螺旋上的一圈不足。不足。正超螺旋为正超螺旋为双螺旋旋转过度双螺旋旋转过度，通过分子整体的左旋来解，通过分子整体的左旋来解去过度的螺旋去过度的螺旋。第20页/共106页为了说明超螺旋的方向，我们可以用为了说明超螺旋的方向，我们可以用一根细绳做实验，假设一根细绳做实验，假设原来的绳子两股以原来的绳子两股以右旋方向缠绕右旋方向缠绕。如果在一端。如果在一端使绳子向紧缠使绳子向紧缠

12、的方向的方向（overwinding）捻转捻转，再将绳子两，再将绳子两端连接起来，则会产生一个端连接起来，则会产生一个左旋的超螺旋左旋的超螺旋以解除外加的捻转造成的胁变以解除外加的捻转造成的胁变，这样的超，这样的超螺旋叫做螺旋叫做正超螺旋正超螺旋。相反如果在绳子一端。相反如果在绳子一端向松缠方向（向松缠方向（underwinding）捻转，再将）捻转，再将绳子两端连接起来，则会产生一个右旋的绳子两端连接起来，则会产生一个右旋的超螺旋以解除外加的捻转造成的胁变，这超螺旋以解除外加的捻转造成的胁变，这种超螺旋叫做种超螺旋叫做负超螺旋负超螺旋。第21页/共106页（1）对于右手螺旋的）对于右手螺旋的

13、DNA分子来说，当处于分子来说，当处于B-DNA构型时，一般每转一圈有构型时，一般每转一圈有10.5个核苷酸对，双螺旋处于个核苷酸对，双螺旋处于能力学上最稳定状态，称为能力学上最稳定状态，称为松弛（松弛（relaxed）状态）状态（双（双螺旋轴没有螺旋轴没有“净弯曲缠绕净弯曲缠绕”）。）。（2）如果每圈初级螺旋的碱基对数）如果每圈初级螺旋的碱基对数少于少于10.5，则其二，则其二级结构处于级结构处于紧缠状态紧缠状态，由此而产生的超螺旋是，由此而产生的超螺旋是正正超螺旋。超螺旋。（3）如果每圈初级螺旋的碱基对数）如果每圈初级螺旋的碱基对数多于多于10.5，则其二，则其二级结构处于级结构处于松缠状

14、态松缠状态，由此而产生的超螺旋是，由此而产生的超螺旋是负负超螺旋超螺旋。 因此，因此，超螺旋总是要向着抵消初级螺旋改变的方向发超螺旋总是要向着抵消初级螺旋改变的方向发展展；双螺旋双螺旋DNA的松开导致形成负超螺旋的松开导致形成负超螺旋；而；而DNA的的拧紧，则导致形成正超螺旋拧紧，则导致形成正超螺旋；所有的超螺旋都比松弛；所有的超螺旋都比松弛型含有更多的自由能。型含有更多的自由能。第22页/共106页松弛型，松弛型，OC, Open circular DNA超螺旋超螺旋, CCC, covalently-closed circular DNALinear DNA从细菌抽提得到从细菌抽提得到的质

15、粒的质粒DNA 样样品中不含线状品中不含线状DNA第23页/共106页电电泳泳方方向向第24页/共106页平均每平均每200bp的的DNA绕核小绕核小体左旋体左旋1.75转，因此真核生转，因此真核生物的物的DNA分子为正超螺旋分子为正超螺旋第25页/共106页第26页/共106页 大多数大多数DNA的的超螺旋密度约为超螺旋密度约为-0.05，这相，这相当于当于每每200bp存在存在1负超螺旋负超螺旋。DNA的超螺旋水的超螺旋水平在活体中是重要的，但它并不是在整个平在活体中是重要的，但它并不是在整个DNA分子中都是均匀的。分子中都是均匀的。DNA特定区域中超螺旋的特定区域中超螺旋的增加有助于增加

16、有助于DNA的结构转化。的结构转化。DNA结构变化结构变化之一就是使之一就是使DNA双股链分开双股链分开，或，或局部熔解局部熔解。超。超螺旋所具有的多余的能量被用于碱基间氢键的螺旋所具有的多余的能量被用于碱基间氢键的断裂。断裂。DNA中，中，10bp的分离大约需的分离大约需 50-209 kJ/mol，因此，因此，DNA所具有超螺旋水平仅是分所具有超螺旋水平仅是分离很少几个碱基对，但离很少几个碱基对，但DNA的这种结构上的变的这种结构上的变化化对复制、转录等的启动仍很重要对复制、转录等的启动仍很重要。第27页/共106页第28页/共106页第29页/共106页分离核酸的一般原则分离核酸的一般原

17、则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故级结构中，故完整的一级结构完整的一级结构是保证核是保证核酸结构与功能研究的基础。酸结构与功能研究的基础。核酸的分离和纯化时应遵循两个原则：核酸的分离和纯化时应遵循两个原则： 保证核酸一级结构的完整性保证核酸一级结构的完整性-完整完整； 排除其它分子的污染排除其它分子的污染-纯纯。第30页/共106页核酸的纯度要求核酸的纯度要求 核酸样品中核酸样品中不应存在对酶有抑制作不应存在对酶有抑制作用的用的有机溶剂有机溶剂和和过高浓度的过高浓度的金属离子金属离子； 其它生物大分子如其它生物大分子如蛋白质、多糖和蛋白质、多糖和脂脂类

18、分子的类分子的污染应降低到最低程度污染应降低到最低程度； 排除排除其它核酸分子其它核酸分子的污染的污染，如提取，如提取DNA分子时应去除分子时应去除RNA，反之亦然。，反之亦然。第31页/共106页核酸分离纯化的注意事项核酸分离纯化的注意事项 尽量尽量简化操作步骤简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；害因素对核酸的破坏； 减少化学物质对核酸的降解减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH410条件下条件下进行；进行； 防止核酸的生物降解防止核酸的生物降

19、解。细胞内或外来的各种。细胞内或外来的各种核酸酶核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中。其中DNA酶酶需要金属二价阳离子需要金属二价阳离子Mg2+、Ca2+的激活的激活，因此使用，因此使用金属离子螯合剂金属离子螯合剂，如，如EDTA或柠檬酸盐等基或柠檬酸盐等基本上可以抑制本上可以抑制DNA酶的活性。而酶的活性。而RNA酶酶不但不但分布广泛分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所，所以生物降解是以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素；提取过程中的主要危害因素； 第

20、32页/共106页 减少减少物理因素物理因素对核酸的降解对核酸的降解，物理降解因素，物理降解因素主要是主要是机械剪切力机械剪切力，其次是，其次是高温高温。机械剪切力机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式的破拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式的破裂及裂及DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是危害对象是大分子量的线性大分子量的线性DNA分子分子，如真核，如真核细胞的染色体细胞的染色体DNA等。等。高温高温，如长时间煮

21、沸，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为程中常规操作温度为04以降低核酸酶的活以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。性从而减少对核酸的生物降解。第33页/共106页核酸分离纯化的一般步骤核酸分离纯化的一般步骤 破碎细胞破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子分子沉淀核酸沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质去除盐类、有机溶剂等杂质纯化干燥纯化干燥溶解。溶解。 核酸提取方案，应根据具体生物材料和待核酸提取方案，

22、应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。两方面质量均高的核酸分子。 第34页/共106页 真核真核DNA以以核蛋白核蛋白（DNP）形）形式存在，式存在，DNP溶于水或高盐溶液溶于水或高盐溶液（1 mol/L NaCl），但不溶于低），但不溶于低盐溶液（盐溶液（0.14mol/L NaCl）。）。 去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异去除蛋白质：水饱和酚，氯仿

23、异戊醇。戊醇。 DNA沉淀：沉淀：0.3 M NaAC-70%乙乙醇。醇。第35页/共106页第36页/共106页核酸的测定方法核酸的测定方法 紫外吸收法紫外吸收法 在一定在一定pH下测定样品的紫外吸光度（下测定样品的紫外吸光度（A260），），即可由下式计算样品中的核酸含量：即可由下式计算样品中的核酸含量： 其中：其中：C为核酸的含量（为核酸的含量（mg/mL），），Mr为为相对分子质量，相对分子质量，A260为核酸溶液的吸光度，为核酸溶液的吸光度，为为摩尔消光系数（即摩尔消光系数（即1升溶液中含升溶液中含1摩尔核酸的光摩尔核酸的光吸收值），吸收值），L为比色杯的内径（为比色杯的内径（cm）

24、C=MrA260/L第37页/共106页紫外吸收法紫外吸收法 1个个A (1 OD260) 50g/ml 双链双链DNA 40g/ml RNA或单链或单链DNA核酸纯度的测定核酸纯度的测定 OD260OD280 纯纯DNA 比值比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染、苯酚污染； 纯纯RNA 比值比值2.0， 2.0 DNA、 Pr、苯、苯酚污染。酚污染。第38页/共106页核酸密度的测定核酸密度的测定 8 M CsCl，45000 rpm，16h 密度梯度：密度梯度：1.80 g/ml1.55 g/ml平衡时：浮力密度平衡时：浮力密度=CsCl密度密度=离心力离心力=0 + 4.22（r2 -

25、r02） 10-10 ：浮力密度：浮力密度 ：角速度（弧度：角速度（弧度/秒）秒）r：样品到转轴的距离：样品到转轴的距离第39页/共106页测定测定DNA的的G-C含量含量G-C含量与含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系的浮力密度之间呈正比关系=0.1 xG-C + 1.658xG-C =（-1.658） 10第40页/共106页定糖法定糖法 RNA的测定的测定：RNA分子中所含的分子中所含的核糖经核糖经浓硫酸或浓盐酸作用脱水生成糠醛浓硫酸或浓盐酸作用脱水生成糠醛，糠醛，糠醛可与可与3，5-二羟甲苯（二羟甲苯（苔黑酚或地衣酚苔黑酚或地衣酚）反）反应生成应生成绿色化合物绿色化合物，该化合物可在，

26、该化合物可在670-680 nm波长下进行比色测定。波长下进行比色测定。 DNA的测定的测定：DNA分子中的分子中的脱氧核糖在脱氧核糖在冰醋酸或浓硫酸存在下可与冰醋酸或浓硫酸存在下可与二苯胺二苯胺反应生反应生成兰色化合物成兰色化合物，该化合物可在，该化合物可在595-620 nm波长下进行比色测定。波长下进行比色测定。第41页/共106页RNA和和DNA中都含有中都含有磷酸磷酸，可以，可以进行磷的测定。进行磷的测定。纯的核酸中含磷量在纯的核酸中含磷量在9.5%左右左右，1 g磷相当于磷相当于10.5 g核酸核酸，测定核酸中磷的含量就可计算核酸，测定核酸中磷的含量就可计算核酸的含量。测定时先将核

27、酸用的含量。测定时先将核酸用强酸将其强酸将其中的磷消化成无机磷酸中的磷消化成无机磷酸，后者，后者与定磷与定磷试剂中的钼酸反应生成磷钼酸试剂中的钼酸反应生成磷钼酸，在经，在经过过还原作用而生成蓝色的复合物还原作用而生成蓝色的复合物-钼钼蓝蓝，最后在，最后在650-660 nm进行比色测进行比色测定。定。第42页/共106页核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳凝胶电泳是当前核酸研究中凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法，有最常用的方法，有琼脂糖凝胶电琼脂糖凝胶电泳泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者。前者常用于常用于DNA的分离分析，后者的分离分析，后者用于用于RNA及及DNA的分离分析。的分离

28、分析。第43页/共106页溴乙锭能插入溴乙锭能插入DNA分子的碱基分子的碱基对间形成复合物对间形成复合物,在紫外线照射在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光下溴乙锭发橘红色荧光,荧光强荧光强度与度与DNA含量成正比含量成正比第44页/共106页第45页/共106页DNA核酸序列分析的简史核酸序列分析的简史上世纪上世纪60年代末就已掌握了充分的理论知年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。一，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。一方面，方面，如何分离寡核苷酸片段如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在；

29、另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。1965，Cornall大学以大学以S. W. Holley为首的科学为首的科学家小组，首次完成了家小组，首次完成了75个核苷酸的个核苷酸的酵母酵母Ala-tRNA的全序列测定的全序列测定-即利用多种即利用多种RNA酶把酶把tRNA降解成寡核苷酸降解成寡核苷酸，经，经分离纯化分离纯化后，再后，再分分别测定短片段顺序别测定短片段顺序。第46页/共106页 1968年年华裔生物化学家、生物学家华裔生物化学家、生物学家吴瑞吴瑞博士（博士（Dr. Ray Wu） 独创性地设计出一种崭新的独创性地设计出一种崭新

30、的引物引物一延伸一延伸测序策略测序策略，并于，并于1971年首次成功地测定了年首次成功地测定了噬菌体两个噬菌体两个COS末端末端的完整序列；的完整序列； 1977，F. Sanger在该策略的基础上，发展出了在该策略的基础上，发展出了快速测定快速测定DNA序列的序列的末端终止法末端终止法； K. Mullis采纳他的方法，完善了采纳他的方法，完善了PCR扩增扩增DNA的方法；的方法； M. Smith发明了发明了碱基定点突变技术碱基定点突变技术。这三位科。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。学家全都获得了诺贝尔奖。第47页/共106页第48页/共106页The Sanger method is a

31、lso known as dideoxy sequencing or chain terminationThe dideoxy chain-termination method 第49页/共106页Sanger双脱氧双脱氧(链终止链终止)法法(酶法测序）酶法测序） DNA的合成总是从的合成总是从5端向端向3端端进行，合成需要进行，合成需要模板模板和和相相应的引物链应的引物链。DNA的合成过程中，在合成的的合成过程中，在合成的DNA链的链的3末末端，依据碱基配对的原则，端，依据碱基配对的原则，双脱氧底物通过生成新的双脱氧底物通过生成新的3,5磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的

32、链合成终止，产生短的DNA链。具链。具体测序工作中，平行进行体测序工作中，平行进行四组反应四组反应，每组反应均使用，每组反应均使用相同相同的模板的模板，相同的引物相同的引物以及以及四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸；并在四组反应；并在四组反应中中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接，使其随机地接入入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的度的、不同长短的DNA链。这四组链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带胺凝胶电泳按链的长短

33、分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。 第50页/共106页第51页/共106页第52页/共106页MOV : MCB4.0Dideoxy sequencing of DNA第53页/共106页每一种双脱氧核苷酸上可以连接上一个荧光每一种双脱氧核苷酸上可以连接上一个荧光标记分子，使得每一段被终止位置的寡核苷标记分子，使得每一段被终止位置的寡核苷酸片段产生不同的荧光。所有标记的双脱氧酸片段产生不同的荧光。所有标记的双脱氧核苷酸被加入同一根反应管，结果带不同荧核苷酸被加入同一根反应管，结果带不同荧光颜色的光颜色的DNA片段用毛细管电

34、泳按片段大小片段用毛细管电泳按片段大小被分离，每个片段通过激光束给出一个单一被分离，每个片段通过激光束给出一个单一峰，峰，DNA序列通过峰的颜色被阅读。序列通过峰的颜色被阅读。DNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧四色荧光基团标记的光基团标记的ddNTP第54页/共106页第55页/共106页(1)先将先将DNA的末端之一进行标记的末端之一进行标记(通常为放射性通常为放射性同位素同位素32P)；(2)在多组互相独立的化学反应中在多组互相独立的化学反应中分别进行特定分别进行特定碱基的化学修饰碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法在修饰碱基位置化学法断开断开DNA链链；(4)聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯

35、酰胺凝胶电泳电泳将将DNA链按长短分开；链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接根据放射自显影显示区带，直接读出读出DNA的的核苷酸序列核苷酸序列。第56页/共106页化学裂解法化学裂解法 Maxam-Gilbert ， 1977原理：原理： 利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群经测序胶电泳和核苷酸的片段群，然后将此片段群经测序胶电泳和放射自显影得到测序图谱。放射自显影得到测序图谱。 32P-GCTACGTA：在在A处：处：32P-GCT和和32P-GCTACGT在在G处：处： 32p ，32p-GCTAC在

36、在C处：处：32P-G和和 32P-GCTA在在T处：处：32P-GC和和32P-GCTACG第57页/共106页G反应：硫酸二甲酯反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸反应：甲酸/哌啶哌啶C反应：肼反应：肼/NaCl/哌啶哌啶C+ T：肼：肼/哌啶哌啶哌啶：促使修饰化碱基脱落，并使脱碱哌啶：促使修饰化碱基脱落，并使脱碱基的磷酸二酯键断裂基的磷酸二酯键断裂第58页/共106页32P *ACTTCGACAG硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（G）：）： *ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（甲酸（G+A）：）： *A*ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼肼/Nacl（C

37、）：）： *AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼（肼（C+T）：）： *AC *ACT *ACT T *ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG从下往上读：从下往上读：CTACGTA，末端，末端G不能读出。不能读出。第59页/共106页第60页/共106页第61页/共106页（1）酶裂解法）酶裂解法胰胰RNase A：嘧啶结尾：嘧啶结尾米曲霉米曲霉RNase T1：鸟苷酸结尾：鸟苷酸结尾黑粉菌黑粉菌RNase U2：腺苷酸结尾：腺苷酸结尾多头黏菌多头黏菌RNase Phy I：A、G、U结尾结尾（2）化学裂解法）化学裂解法（3）逆转录成）逆转录成cDNA法

38、法RNA的测序的测序第62页/共106页第63页/共106页第64页/共106页双链双链DNA分子可以被上千分子可以被上千种从微生物中分离得到的种从微生物中分离得到的限制性内切酶限制性内切酶（restriction enzyme）切断切断, 又可以又可以被被连接酶连接酶再连接起来。切断再连接起来。切断的过程不需要能量，而连的过程不需要能量，而连接的起来的过程却需要接的起来的过程却需要2个分子的个分子的ATP。这就是分这就是分子克隆和重组子克隆和重组DNA技术的技术的基础。基础。第65页/共106页大部分限制性大部分限制性内切酶识别的内切酶识别的碱基序列为碱基序列为 6 个碱基个碱基的的回文回文

39、(palindrome )序列序列。它们在。它们在微生物细胞内微生物细胞内扮演的却是扮演的却是防防御外来御外来DNA入入侵侵的国防军的的国防军的作用。如何不作用。如何不把自身的把自身的DNA也降解了呢？也降解了呢？第66页/共106页第67页/共106页DNA重组示意图重组示意图EcoRI与与DNA的复合体的复合体第68页/共106页第69页/共106页 DNA双螺旋结构模型，不仅与其生物学功能有密切关双螺旋结构模型，不仅与其生物学功能有密切关系，还能解释系，还能解释DNA的重要特性的重要特性-变性与复性变性与复性，这对于，这对于深入了解深入了解DNA分子结构与功能的关系有重要意义。分子结构与

40、功能的关系有重要意义。 DNA变性变性 (Denaturation)1、DNA变性变性的的概念概念：指：指DNA分子中的分子中的双螺旋结构解双螺旋结构解链链为无规则线性结构的现象。为无规则线性结构的现象。2、DNA变性的变性的本质本质：维持双螺旋稳定的：维持双螺旋稳定的氢键断裂，碱氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏基间的堆积力遭到破坏，不涉及到一级结构的改变。，不涉及到一级结构的改变。3、导致、导致DNA变性的变性的因素因素：凡能：凡能破坏双螺旋稳定性的因破坏双螺旋稳定性的因素素，如加热、极端，如加热、极端pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺、低离子浓度等，均可引起

41、核酸分子变性。甲酰胺、低离子浓度等，均可引起核酸分子变性。第70页/共106页第71页/共106页第72页/共106页DNA变性变性：双链解开。：双链解开。 OD260增高增高 粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降 浮力密度增加浮力密度增加 酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失RNA变性变性：从局部螺旋到线团之间的：从局部螺旋到线团之间的转变，转变，RNA的变性引起的性质变化没的变性引起的性质变化没有有DNA的明显的明显。第73页/共106页DNA变性是在一个变性是在一个很窄的很窄的温度范围温度范围内发生的。通常内发生的。通常将核酸加热变性过程中，将核酸加热变性过程中，紫

42、外光吸收值达到最大值紫外光吸收值达到最大值50%时的温度时的温度称为核酸的称为核酸的解解链温度链温度，由于这一现象与，由于这一现象与结晶的融解结晶的融解相类似，又称相类似，又称融解温度融解温度(Tm, melting temperature)。在。在Tm时，核时，核酸分子内酸分子内50%的双螺旋结构的双螺旋结构被破坏被破坏。特定核酸分子的。特定核酸分子的Tm值与其值与其GC所占总碱基所占总碱基数的百分比成正相关。数的百分比成正相关。一般一般DNA Tm 值在值在85 - 90 C之间。之间。第74页/共106页增色效应增色效应(hyperchromic effect)：指：指DNA变性后变性后

43、其其紫外吸收明显增加的效应紫外吸收明显增加的效应。DNA分子中碱基分子中碱基间电子的相互作用使间电子的相互作用使DNA分子具有吸收分子具有吸收260 nm波长紫外光的特性。在波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基双螺旋结构中碱基藏入螺旋内侧，变性时藏入螺旋内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是双螺旋解开，于是碱基外露碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。吸收，故而产生增色效应。完全变性后核酸紫外吸收值增加：完全变性后核酸紫外吸收值增加： 天然天然DNA 2540%、RNA 约约1.1% 实质：碱基暴露实质：碱基暴露第75页/共106

44、页1.37倍倍1 OD260 DS DNA 50 g SS DNA 37 g RNA 40 g第76页/共106页第77页/共106页（1）DNA的均一性的均一性 （2）GC含量：含量： 经验公式：经验公式： XG+C（Tm69.3）2.44 或或（3）介质中的离子强度）介质中的离子强度第78页/共106页DNA的复性：的复性： 指经加热变性的指经加热变性的DNA在适当条件在适当条件下，下，二条互补链全部或部分恢复到天二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象然双螺旋结构的现象，它是变性的一，它是变性的一种逆转过程。热变性种逆转过程。热变性DNA一般经一般经缓慢缓慢冷却冷却后即可后即可复性

45、复性(renaturation)，此过，此过程称之为程称之为退火退火(annealing)。这一术语这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成。也用以描述杂交核酸分子的形成。第79页/共106页第80页/共106页DNA的复性不仅受的复性不仅受温度影响温度影响，还受，还受DNA自身特性自身特性等其等其它因素的影响：它因素的影响：1、温度和时间、温度和时间：比：比Tm 低低20-25左右的温度是复性的左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一温度下降必须是一缓慢过程缓慢过程，若在超过，若在超过Tm的温度下迅的温度下迅速

46、冷却至低温速冷却至低温(如如4以下以下)，复性几乎是不可能的，核，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持酸实验中经常以此方式保持DNA的变性的变性(单链单链)状态。状态。这说明这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性降温时间太短以及温差大均不利于复性。2、DNA浓度浓度：溶液中：溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合分子越多，相互碰撞结合的机会越大，有利于复性。的机会越大，有利于复性。3、DNA顺序的复杂性：顺序的复杂性：简单顺序的简单顺序的DNA分子，如多分子，如多聚聚(A)和多聚和多聚(U)这二种单链序列复性时，互补碱基的配这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。顺序复杂的序列要

47、实现互补则困难得多对较易实现。顺序复杂的序列要实现互补则困难得多。 第81页/共106页T1/2 C const第82页/共106页第83页/共106页复性过程，复性过程，DNA的片段越大的片段越大复性越慢复性越慢，浓度越大复性越浓度越大复性越快快。一定条件下用。一定条件下用Cot来衡量来衡量复性的速度，复性的速度，Co为变性为变性DNA的原始浓度的原始浓度，以核苷酸对摩，以核苷酸对摩尔浓度表示，尔浓度表示，t为时间为时间，用秒，用秒表示。两种浓度相同但来源表示。两种浓度相同但来源不同的不同的DNA，复性时间长短，复性时间长短与基因组的大小有关。具有与基因组的大小有关。具有重复序列的重复序列的

48、DNA，复性也快，复性也快。第84页/共106页第85页/共106页 哺乳动物的哺乳动物的DNA 一一般均呈般均呈左左图的曲线，这图的曲线，这是因为它们的基因组是因为它们的基因组DNA 中插入了大量的中插入了大量的重复序列，如人的重复序列，如人的DNA中就插入了长度中就插入了长度为为350bp的的Alu序列达序列达50万份拷贝之多。万份拷贝之多。第86页/共106页第87页/共106页第88页/共106页第89页/共106页杂交可以发生于杂交可以发生于DNA与与DNA之之间间，也可以发生于，也可以发生于RNA与与RNA之间之间或或DNA与与RNA之间之间。第90页/共106页（1）（2）（3）

49、（4）（1）电泳）电泳 （2）转膜（印迹）转膜（印迹） （3）杂交）杂交 （4）放射自显影）放射自显影第91页/共106页PCR是应用是应用最广的分子最广的分子生物学技术，生物学技术，在在DNA测序测序中只用了单中只用了单链扩增技术，链扩增技术，所产生的模所产生的模板板DNA并不并不指数上升，指数上升，而只以热循而只以热循环数为倍数。环数为倍数。需要：模板需要：模板DNA、引物、底物（、引物、底物（dNTPs）、）、DNA Pol (Taq)、扩增缓冲液。变性（扩增缓冲液。变性（94）-退火退火-延伸（延伸（72）循环。循环。第92页/共106页第93页/共106页利用足迹法确定利用足迹法确定 RNA 聚合酶结合聚合酶结合位点的实验位点的实验第94页/共106页原位分子杂交原位分子杂交 （in situ hybridization）荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）