生化03章酶化学

1、 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。一、酶浓度的影响一、酶浓度的影响0 V E 二、底物浓度对反应速度的影响二、底物浓度对反应速度的影响中间复合物学说中间复合物学说E + S k1k2k3ESE + PD.Keilin(英英)&B.Chance(美美) 分别获得关于酶分别获得关于酶-底底物复合物存在的比较直接的证据物复合物存在的比较直接的证据 nChance：n植物（辣根）过氧化物酶（棕色植物（辣根）过氧化物酶（棕色-血红素）血红素）nH2O2H2O + O2n吸收管普检测：底物（吸收管普检测：底物（H2O2）+ 棕色酶棕色酶绿色绿色酶酶-

2、底物复合物底物复合物淡红色的酶淡红色的酶-底物复合物底物复合物H2O2降解产物降解产物H2O+O2溶菌酶溶菌酶-底物复合物结晶底物复合物结晶X线衍射图线衍射图 当底物浓度较低时当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比；反应反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。为一级反应。随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速；反应反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。为混合级反应。当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度；反反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应。应为零级反应。vVmaxS Km + S S：底物浓度底物浓度V：不同不

3、同S时的反应速度时的反应速度Vmax：最大反应速度最大反应速度(maximum velocity) m：米氏常数米氏常数(Michaelis constant) 中间复合物学说中间复合物学说: E+S ESE+P反应方程式反应方程式:E + S ES E + Pk1k2k3k4假设：假设：E + S k1k2k3ESE + P SE St ESS(EtES)SK2+K3ES K1整理得：整理得：K2+K3 KmK1令：令： Km(EtES)SES 则：则：ES EtSKm + S整理得整理得: :ES分解为限速步骤，分解为限速步骤， v=K3 ES即：即：K3EtS Km + S v当底物浓度

4、当底物浓度，酶活性中心全部饱和，即，酶活性中心全部饱和，即EtES，反应达最大速度：反应达最大速度：VmaxK3ESK3EtVmaxS Km + S v 米氏常数米氏常数 ：Km K2+K3 KmK1VmaxS Km + S v 米氏常数的意义米氏常数的意义Km值可用来表示酶对底物的亲和力值可用来表示酶对底物的亲和力K2+K3 Km ，当，当 K2 K3 时，时，K1ES K2ES K1Km Ks（解离常数）（解离常数）E + S k1k2k3ESE + P米氏常数的求法米氏常数的求法双倒数作图法双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为又称为 林林-贝氏贝氏(Lin

5、eweaver- Burk)作图法作图法2. 双底物酶促反应机制双底物酶促反应机制 双底物双底物反应反应 序列反应序列反应 乒乓反应乒乓反应 有序顺序反应有序顺序反应 随机顺序反应随机顺序反应 有序顺序机制有序顺序机制 （compulsory order reactions）（1）顺序）顺序(序列序列)机制（机制（ sequential reactions ）乙醇脱氢酶的作用乙醇脱氢酶的作用 随机顺序机制（随机顺序机制（random orderreactions）肌酸激酶催化的反应肌酸激酶催化的反应 （2）乒乓机制（）乒乓机制（ping pong reactions） 氨基转移酶催化的反应氨基

6、转移酶催化的反应三、温度对酶促反应的影响三、温度对酶促反应的影响双重影响双重影响最适温度最适温度 (optimum temperature)： 酶促反应速度最快时的酶促反应速度最快时的 境温度。境温度。 植物酶：植物酶：40-50C 动物酶：动物酶：35-40 C非固定常数非固定常数底物的种类、底物的种类、浓度浓度, 溶液的离子强度溶液的离子强度, pH, 反应时间等反应时间等四、四、pH对酶促反应的影响对酶促反应的影响反反应应速速度度pH最最适适p pH H68100pH影响反应速度的原因影响反应速度的原因 npH影响了酶分子、底物分子和影响了酶分子、底物分子和ES复合物复合物的解离状态。的

7、解离状态。 n过高、过低的过高、过低的pH导致酶蛋白变性。导致酶蛋白变性。五、激活剂的影响五、激活剂的影响六、抑制剂的影响六、抑制剂的影响抑制剂与变性剂：抑制剂与变性剂：抑制剂对酶有一定选择抑制剂对酶有一定选择性性必需基团；引起变性的因素对酶没有选必需基团；引起变性的因素对酶没有选择性。择性。 抑制作用的类型抑制作用的类型不可逆性抑制不可逆性抑制 (irreversible inhibition)可逆性抑制可逆性抑制 (reversible inhibition)：竞争性抑制竞争性抑制 (competitive inhibition)非竞争性抑制非竞争性抑制 (non-competitive

8、inhibition)反竞争性抑制反竞争性抑制 (uncompetitive inhibition)1. （irreversible inhibition） 透析和超滤透析和超滤ROROPOX+HOEROROPOOE+HX有机磷化合物有机磷化合物羟基酶羟基酶(胆碱酯酶胆碱酯酶)磷酰化酶磷酰化酶(失活酶失活酶)酸酸R、R : 烷基烷基 ; X: -F, -CN等等巯基酶抑制剂巯基酶抑制剂n烷化剂：例烷化剂：例 ICH2COOH，ICH2CONH2等等E-S H + I CH2COOHE-S-CH2COOH + HIn有机汞、有机砷化合物有机汞、有机砷化合物(对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸, 路易士气路

9、易士气)COOHHgSE+ HClE-S H +COOHHgClClAsClCHCHCl+ ESHSHESAsSCHCHCl+2HCl路易士气路易士气巯基酶巯基酶失活酶失活酶酸酸路易士气的解毒路易士气的解毒ESSAsCHCHCl+CH2SHCHSHCH2OHESHSH+CH2SCHSCH2OHAsCHCHCl失活酶失活酶BAL(二巯基丙醇二巯基丙醇)巯基酶巯基酶BAL与砷剂结合物与砷剂结合物DIFP对胰凝乳蛋白酶的抑制对胰凝乳蛋白酶的抑制 (reversible inhibition)竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制 （）（） 竞争性抑制作用竞争性抑制作用（

10、competitive inhibition） +反应模式反应模式抑制剂是底物的结构类似物抑制剂是底物的结构类似物 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用 丙二酸丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶延胡索酸延胡索酸琥珀酸琥珀酸丙二酸丙二酸二氢蝶呤啶二氢蝶呤啶 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸二氢叶酸二氢叶酸合成酶合成酶二氢叶酸二氢叶酸COOH H2N SO2NHR H2N 磺磺 胺胺 类类 药药 物物磺胺类药物的抑菌机制磺胺类药物的抑菌机制与与对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸竞争竞争二氢叶酸合成酶二氢叶酸合成酶人：人： 叶酸叶酸(食

11、物食物)FH2FH4叶酸还原酶叶酸还原酶细菌：细菌： 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸FH2合成酶合成酶FH2FH4竞争性抑制作用动力学竞争性抑制作用动力学E + S ES E + Pk1k2k3+Iki2ki1EI)K I 1(KKSKSVvimmmmax I增加而增加增加而增加（2 2） 非竞争性抑制非竞争性抑制（noncompetitive inhibition） * * 反应模式反应模式非竞争性抑制作用动力学非竞争性抑制作用动力学E + S ES E + Pkm+IkiEI + S+IkiEISkmimaxmaxmmaxK I 1VVSKSVv I增加减小增加减小() 反竞争性抑制反竞争性抑制

12、（uncompetitive inhibition） * * 反应模式反应模式反竞争性抑制作用动力学反竞争性抑制作用动力学E + S ES E + P+IkiESISKSVvmmax imaxmaxK I 1VV immK I 1KK I增加减小增加减小可逆性抑制作用比较可逆性抑制作用比较动力学参数动力学参数表观表观Km Km增大增大不变不变减小减小最大速度最大速度Vmax不变不变降低降低降低降低林林-贝氏作图贝氏作图斜率斜率Km/Vmax增大增大增大增大不变不变纵轴截距纵轴截距1/Vmax不变不变增大增大增大增大横轴截距横轴截距-1/Km增大增大不变不变减小减小与与I结合的组分结合的组分EE

13、、ESES作用特征作用特征无抑制剂无抑制剂竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制第第 六六 节节 重要酶类及其活性调节重要酶类及其活性调节 一、多酶体系与反馈调节一、多酶体系与反馈调节反馈调节反馈调节苏氨酸苏氨酸异亮氨酸异亮氨酸二、别构酶和别构调节别构酶和别构调节（3）别构酶（）别构酶（allosteric enzyme） cooperative effect）2.别构调节实例别构调节实例 NOCH2OOHONNNNH2POOH（2）大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶（aspartate transcarbamylase, ATCase） CCC

14、CCCR汞汞盐盐完完整整的的催催化化亚亚基基调调节节亚亚基基CCCCCC+（三三聚聚体体）（二二聚聚体体）（活活性性）ATCaseRR RR RR RR RR R3调节调节2聚体聚体赤道面；赤道面；2催化三聚体分位上、下方催化三聚体分位上、下方居中洞穴居中洞穴ATP、CTP对对ATCase的调节及生理意义的调节及生理意义双底物复合物双底物复合物/过渡态类似物过渡态类似物PALA（N-磷乙酰磷乙酰-L-天冬氨酸）天冬氨酸）是是ATCase的强抑制剂的强抑制剂 PALA结合在结合在ATCase催化部位上的方式催化部位上的方式PALA结合引起结合引起ATCase空间结构重空间结构重大变化大变化ATC

15、ase的别构效应通过四级的别构效应通过四级结构的变化转达结构的变化转达ATCase 的两种结构状态的两种结构状态CTP的结合稳定的结合稳定T态态PALA的结合稳定的结合稳定R态，但态，但 无产物释放无产物释放n调节方式调节方式ATCase动力学曲线动力学曲线 3别构酶的动力学曲线为别构酶的动力学曲线为S-形曲线形曲线4别构调节的机理别构调节的机理序变模型序变模型（sequential model，也称，也称KNF模型）模型） 1966年由年由Koshland、Nemethy和和Filmer提出提出要要 点点 （2）齐变模型齐变模型（concerted model，亦称，亦称MWC模型）模型）1

16、965年年 Monod Wyman Changeux提出提出模型要点模型要点 别构激活剂和别构抑制剂对别构酶的影响别构激活剂和别构抑制剂对别构酶的影响 三、酶的可逆共价调节（共价修饰酶的可逆共价调节（共价修饰covalently modulated enzymes ） 共价修饰共价修饰u磷酸化与脱磷酸化（最常见）磷酸化与脱磷酸化（最常见） -OHThrSerTyr酶蛋白酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶磷蛋白磷酸酶 ATPADP蛋白激酶蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白酶蛋白酶的磷酸化与脱磷酸化酶的磷酸化与脱磷酸化糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶（别构调节和共价调节）（别构调节和共价调节） 糖

17、原磷酸化酶活性的调节糖原磷酸化酶活性的调节 n别构调节别构调节 酶分子的结构（两个相同二聚体酶分子的结构（两个相同二聚体 ）四、四、 同工酶（同工酶（isoenzyme or isozyme） 概念概念 同工酶是指由不同基因或等位基因编码同工酶是指由不同基因或等位基因编码的多肽链所组成的单体、纯聚体或杂合体，催的多肽链所组成的单体、纯聚体或杂合体，催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构理化化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。性质乃至免疫学性质不同的一组酶。举例：乳酸脱氢酶（举例：乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase LDH） 乳酸乳酸 丙酮

18、酸丙酮酸 LDH5骨骼肌骨骼肌:乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 心肌心肌:LDH1乳酸脱氢酶的同工酶乳酸脱氢酶的同工酶结构特征（结构特征（2种亚基种亚基4聚体，聚体，5种同工酶）种同工酶） 电泳行为电泳行为乳酸脱氢酶同工酶在不同组织中乳酸脱氢酶同工酶在不同组织中的分布（的分布（%）生理意义生理意义 同工酶谱的改变有同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断助于对疾病的诊断心肌梗死和肝病病人血清心肌梗死和肝病病人血清LDHLDH同工酶谱的变化同工酶谱的变化1 1酶酶活活性性心肌梗死酶谱心肌梗死酶谱正常酶谱正常酶谱肝病酶谱肝病酶谱2 23 34 45 5*肌酸激酶（肌酸激酶（creatine phosphate k

19、inase CPK）肌酸激酶同工酶在人体组织中的分布肌酸激酶同工酶在人体组织中的分布肌酸激酶肌酸激酶（CPK）骨骼肌骨骼肌心脏心脏 脑脑肝肝胃胃肾肾总活力（总活力（IU/g） 1900-3000380160 4125 18 MM MM 10076-90310 MB MB -22-6210 BB BB - 1100 49590第七节第七节酶的分离纯化酶的分离纯化和活力测定和活力测定二、酶活力与测定二、酶活力与测定2.酶活力单位酶活力单位 （unit, U） 1961Kat（specific activity，比活性），比活性） 每每mg蛋白质所具有的酶活力蛋白质所具有的酶活力 比活力比活力= 酶活力（酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml） 总活力单位体积酶活力总活力单位体积酶活力(U/ml)分离溶液总体积分离溶液总体积(ml)（TN or kca