啤酒微生物检测手册

1、啤酒检验手册（微生物检验部分）目录A、半成品质量检验一、冷麦汁2二、发酵酒2三、贮酒4四、一滤酒6五、清酒7B、成品质量检验8C、原辅材料质量检验13附录1:培养基、中和剂及染色剂的配制和染色方法15附录2:玻璃器皿的洗涤、包扎与灭菌19附录3:无菌吸样要求19附录4:大肠菌群最可能数（MPN检索表20A、半成品质量检验一、冷麦汁1、抽样方法1.1 传统发酪1.1.1 每班至少抽检一批。1.1.2 取样时先打开取样阀排放少量液体，后用70-75%的酒精由内至外消毒取样阀，再用火焰灭菌（酒精火焰外焰灼烧15秒以上）。重新打开阀门排放样品，待阀门冷却后，取150200ml入已灭菌的三角瓶。1.2

2、锥形罐发酪逐批抽检，取样方法同A、1.1.22、检验项目好气菌（每班至少抽检一批）厌气菌（每天至少抽检一批，原则上由日班完成）注：停产搞卫生后的第一批麦汁一定要抽样检验好气菌和厌气菌。3、检验方法3.1 好气菌：无菌操作吸取1ml样品加入已灭菌的平皿内，及时将冷却至45±1C（手感不烫手）的营养琼脂培养基注入平皿10-15ml,并转动平皿使混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1C的电热恒温培养箱内培养24或48土2小时后，在菌落计数器上计菌落总数，结果即是每毫升样品中所含的好气菌数。3.2 厌气菌：无菌操作吸取1ml样品加入已灭菌的平皿内，及时将冷却至45±

3、1C的UBAD（或NBBD）培养基注入平皿10-15ml,并转动平皿使混合均匀。待培养基凝固后，翻转平板，置25±1C的厌氧培养箱内培养57天后，在菌落计数器上计菌落总数，结果即是每毫升样品中所含的厌气菌数。4、结果处理4.1 检验结果以电脑报告单或书面报告单的形式报给企业领导、生技部和酿造部。二、发醉酒1、抽样方法1.1 传统发酯1.1.1 0代的酵母，半罐即取样；满罐1小时后再取样。1代以上（包括1代）的酵母满罐1小时后取样。取样时先打开取样阀排放少量液体，后用70-75%的酒精由内至外消毒取样阀，再用火焰灭菌（酒精火焰外焰灼烧15秒以上）。重新打开阀门排放样品，待阀门冷却后，取

4、150200ml入已灭菌的三角瓶。1.1.2 满罐56小时后再取前酵液150200ml检测高泡时期的酵母数。1.2 锥形罐发酪1.2.1 0代的酵母，添加第一批麦汁后1小时及满罐后1小时取样；1代以上（包括1代）的酵母满罐1小时后取样。无菌操作取样，方法同A、1.1.2。1.2.2 满罐的第四日取样检测厌氧菌，方法同A、1.1.2。1.2.3 满罐的第20日取发酵液150200ml检测酵母数和死亡率。2、检验项目2.1 传统发酪2.1.1 每罐检验项目：酵母数、出芽率、酵母形态及厌气菌；高泡期酵母数。2.1.2 抽检项目：0代酵母逐罐检验死亡率及好气菌；1代以上（包括1代）每月至少抽4罐检验好

5、气菌及死亡率。2.2 锥形罐发酪2.2.1 每罐检验项目：酵母数、出芽率、死亡率、酵母形态、好气菌及厌气菌；2.2.2 抽检项目：20天后的酵母数；（0代的酵母逐罐检验，0代以上的酵母抽检的罐数不少于当日满罐总数的50%）20天后的死亡率（0代的酵母逐罐检验，0代以上的酵母每月至少抽检4罐）3、检验方法3.1 好气菌：同A、一、3.1中好气菌的检验方法3.2 厌气菌：同A、一、3.2中厌气菌的检验方法3.3 酵母形态与死亡率：取1:5000的美蓝染色液一滴，滴在一块洁净的载玻片中央，用滴管或玻棒加一滴酵母悬浮液，混合均匀，染色3分钟后盖上盖玻片制成水浸片，镜检（在3分钟内用高倍镜观察）。染上蓝

6、色的细胞是死细胞，未着色的是活细胞。用血球分类计算器计出死亡酵母数与酵母细胞总数（检酵母死亡率时，要求每个视野不少于50个酵母，数1000个以上酵母个数）。同时观察酵母形态，主要观察酵母的形状、大小、内含物、液泡及细胞壁。（单纯观察酵母形态时可以用蒸储水代替美蓝染色死亡酵母数酵母死亡率（）=X100（计算结果保留一位小数）酵母细胞总数3.4 酵母数与出芽率：3.4.1 计酵母数时一般要求用2%的H2SO4稀释10倍（1ml酵母液加入9ml2%H2SO4）,使血球计数板每个小方格中平均46个细胞为宜。但酵母含量少时不用稀释。3.4.2 取一块洁净的血球计数板，在中央计数区的上方加盖一块洁净的盖玻

7、片。3.4.3 用滴管或玻棒取酵母悬浮液滴于盖玻片的边缘，让菌液靠毛细作用渗入计数室，注意不得有气泡产生。将计数板置于显微镜的载物台上，静止5分钟，使酵母细胞全部沉降到计数板的表面。3.4.4 分别统计5个中方格（左上、右上、左下、右下、中央）中细胞总数及芽体数，酵母菌的芽在未脱离母细胞前，若已达母细胞的1/2大小，则不作为芽体而作为成熟的细胞计数。在计数时，若遇到位于中方格间线上的细胞，只统计位于左线及下线上且在线内的体积不少于一半的细胞。为尽量减少实验误差，对同一样品血球计数板的上下两个划线区域的5个中方格（左上、右上、左下、右下、中央）均要计细胞总数及芽体个数，分别取其平均值（酵母细胞总

8、数平均值以A表示、芽体个数平均值以B表示）。3.4.5 使用完毕后，将血球计数板冲洗干净（绝对不能用硬物洗刷），让其自行晾3.4.6 将细胞总数平均值A乘以5即得25个中方格中的细胞总数3.4.7 细胞数/毫升=25个中方格中细胞总数X稀释倍数X104,即稀释10倍的计算结果是25个中方格中细胞总数将其小数向前移1位x106个/毫升，没稀释的则向前移两位小数。（计算结果保留一位小数）3.4.8芽体个数（B）出芽率（）=X100（计算结果保留一位小数）细胞总数（A）4、结果处理4.1检验结果以电脑报告单或书面报告单的形式报给企业领导、生技部和酿造部。三、贮酒（仅对传统发醉）1、抽样方法1.1 满

9、罐后即时取样1.2 取样时先打开取样阀排放少量液体，后用70-75%的酒精由内至外消毒取样阀,再用火焰灭菌（酒精火焰外焰灼烧15秒以上）。重新打开阀门排放样品，待阀门冷却后，取150200ml入已灭菌的三角瓶。2、检验项目2.1 厌气菌：每班抽检的罐数不小于当班满罐总数的50%2.2 好气菌与死亡率：每月至少抽检4罐2.3 酵母数：每班抽检的罐数不小于当班满罐总数的50%3、检验方法3.1 厌气菌：同A、一、3.2中厌气菌的检验方法3.2 好气菌：同A、一、3.1中好气菌的检验方法3.3 酵母数：3.3.1 同A、二、3.4.13.3.2 同A、二、3.4.23.3.3 同A、二、3.4.33

10、.3.4 分别统计5个中方格（左上、右上、左下、右下、中央）中酵母细胞总数，在计数时，若遇到位于中方格间线上的细胞，只统计位于左线及下线上且在线内的体积不少于一半的细胞。为尽量减少实验误差，对同一样品血球计数板的上下两个划线区域的5个中方格（左上、右上、左下、右下、中央）均要计数，取其平均值（数值以A表示）。3.3.5 将酵母细胞总数平均值A乘以5即得25个中方格中的细胞总数3.3.6 细胞数/毫升=25个中方格中细胞总数X稀释倍数X104,即稀释10倍的计算结果是25个中方格中细胞总数将其小数向前移1位x106个/毫升，没稀释的则向前移两位小数。计算结果保留一位小数。3.4 死亡率：同A、二

11、、3.3中死亡率的检测方法4、结果处理4.1检验结果以电脑报检单或书面报检单的形式报给企业领导、生技部和酿造部。四、一滤酒1、抽样方法1.1取样方法同A、1.1.22、检验项目：2.1 好气菌：每天日班至少抽检一罐2.2 厌气菌：每周至少抽检一罐3、检验方法3.1 好气菌：同A、1.3.13.2 厌气菌：同A、1.3.24、结果处理4.1检验结果以电脑报检单或书面报检单的形式报给企业领导、生技部和酿造部五、清酒1、抽样方法1.1 满罐后即取样。1.2 取样时先打开取样阀排放少量液体，后用70-75%的酒精由内至外消毒取样阀，再用火焰灭菌（酒精火焰外焰灼烧15秒以上）。重新打开阀门排放样品，待阀

12、门冷却后，取150200ml入已灭菌的三角瓶。2、检验项目2.1 每罐检验项目：好气菌（60c前及60c后）2.2 抽检项目：60c后厌气菌（每10罐至少检测1罐）3、检验方法3.1 好气菌：无菌操作吸取1ml清酒加入已灭菌的平皿内，将余下的酒液重新包扎放入电热恒温水浴锅中，60±1C恒温15分钟模拟杀菌。再吸取已杀菌的酒液1ml入已灭菌的平皿。及时将冷却至45±1C的营养琼脂培养基注入平皿10-15ml,并转动平皿使混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1C的电热恒温培养箱内培养24或48±2小时后，分别在菌落计数器上计菌落总数。3.2 厌气菌：无

13、菌操作吸取已模拟杀菌的酒液1ml入已灭菌的平皿。及时将冷却至45±1C的UBA（或NBB）培养基注入平皿10-15ml,并转动平皿使混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，置25±1C的厌氧培养箱内培养57天后，在菌落计数器上计菌落总数，结果即是每毫升酒液中所含的厌气菌数。4、结果处理4.1检验结果以电脑报告单或书面报告单的形式报给企业领导、酿造部、生技部和包装部。B、成品质量检验1 .抽样方法1.1 瓶/罐装酒1.1.1 正常生产情况下，每批取前、中、后期三个酒样；当同一个清酒桶包两条线时，各取前、后期两个酒样。1.1.2 同一批酒，如包装时间超过8小时，除按正常取样外，每3小

14、时加取1个微检样。1.1.3 同一批酒，如包装时间小于6小时，则可只取前、中期或前期酒样。1.1.4 如一批酒中有头板酒、PU或杀菌温度偏低、杀菌运行时间偏短部分，则各取两支酒样。1.1.5 以上酒样均由包装线检验人员提供给微检检验人员。1.2 桶装啤酒1.2.1 同一个清酒桶包出来的桶装啤酒为一批，每批取第三桶作前期酒样；同一个清酒桶的酒未包完而停包4个小时以上的，再重包时作另一批，也取第三桶的酒样，由车间通知取样。1.2.2 正常生产情况下，每班至少抽检一桶。2 .检验项目2.1 瓶/罐装啤酒2.1.1 每支酒检验项目：好气菌（前期要做平行样）2.1.2 抽检项目：活酵母（每批至少抽检前期

15、酒样；640ml瓶装线使用旧瓶包装时加抽后期酒样，抽检批数不低于当月总批数的80%（头板、PU偏低、杀菌温度偏低、杀菌时间偏短至少抽检一支）大肠菌群（每批至少抽检前期酒样）厌气菌（连续生产时至少批数逢“0”抽检，停产一段时间后包返的第一批要求抽检，每批抽检前期酒样）2.2 桶装啤酒2.2.1 每桶酒检验项目：好气菌（前期要做平行样）活酵母2.2.2 抽检项目：大肠菌群（每批至少抽检前期酒样）厌气菌（连续生产时每3批至少抽检1批，停产一段时间后包返的第一批要求抽检，每批抽检前期酒样）3 .检验方法3.1 好气菌、活酵母与厌气菌3.1.1 样品处理3.1.1.1 瓶/罐装啤酒：在无菌状态下，用70

16、-75%的酒精棉抹干净开瓶器、瓶口（或罐装拉环部分），再用酒精火焰灭菌。无菌操作开启瓶/罐盖，迅速倒出2/3左右的酒液后马上用酒精棉盖住瓶/罐口，并轻轻摇荡，使CO2逸出后备用。3.1.1.2 桶装啤酒：依次用1%的碘液与70-75%的酒精棉抹干净酒阀，再用酒精火焰对酒阀及取样器与酒阀接触的部分杀菌，连接好取样器（已用1%的碘液浸泡灭菌）及酒阀。打开取样阀排放100-150ml的酒液，用70-75%的酒精棉由内至外抹干净取样口，再用酒精火焰灭菌（灼烧15秒钟以上），打开取样阀排放液体，待取样口冷却后，无菌操作接取400500ml的样品入已灭菌的三角瓶中备用。3.1.2 检验程序：见下图1:（图

17、1）3.1.3 操作步骤无菌操作吸取1ml的酒液加入已灭菌的平皿内，及时将冷却至45±1C的培养基注入平皿10-15ml,并转动平皿使混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，置培养箱内培养一定时间，在菌落计数器上计菌落总数。3.1.4培养条件检验项目培养基培养条件培养时间培养箱好气菌营养琼脂36±1C24或48±2小时电热恒温培养箱活酵母麦汁琼脂30±1C48±2小时电热恒温培养箱厌气菌UBANBB25±1C57天厌氧培养箱103.2 大肠菌群3.2.1 样品处理：同3.1.1,详细见3.1.1.1及3.1.1.23.2.2 检验程序：见下

18、图2:箪兰耳阳七|革兰氏阴性无琴抱杆菌_k-._L_1产气不产气大肠菌群阴件1,_1I大肠菌群阳性大肠菌群阴性报告报告报查（图2）3.2.3 操作步骤3.2.3.1 乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量为10ml者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及0.1ml者，用单料乳糖发酵管。每一接种量各接种3管，加2%NaOH中和至中性。置36±1C电热恒温培养箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。3.2.3.2 分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1C电热恒温培养箱内，培养

19、1824小时，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。3.2.3.3 证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1C电热恒温培养箱内培养24±2小时，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即为大肠菌群阳性。3.2.4 大肠菌群含量判定根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，即可得到每100ml酒样中大肠菌群的MPN值。（附MPN检索表）4、结果判定与处理4.1 检验结果以电脑报告单或书面报告单的形式报给企业领导、生技部、酿造部、包装部。4.2 电脑报检时成品前、中、后期的好气菌及活酵母取其

20、各自的平均值（保留整数位）；如前、中、后期好气菌检验结果均为零，则整批酒的好气菌结果为“1”，平均值不足“1”时取为“1”，超过“1”时保留整数位。电脑检验报告单中的取样日期及检验日期统一报检成品前期相应的日期。4.3 如好气菌w50个/毫升、100ml酒液中大肠菌群w3MPN则为合格品；如好气菌50个/毫升、或大肠菌群3MPN,则为不合格品，由有关部门按不合格品控制程序处理。C原辅材料质量检验一、硅藻土等过滤材料1、抽样方法1.1 新购进硅藻土等过滤材料，以同一天同一单位进货并且同一类型为一批，每批按进货量抽样：进货量20吨以下（含20吨）2040吨（含40吨）4060吨（含60吨）以此类推

21、抽样包数1包2包3包1.2 现场使用的硅藻土等过滤材料，每月至少抽检两次，每次至少抽一包。1.3 取样时先用70-75%的酒精棉抹干净开包处包表面及开包工具（剪刀或刀片等），再用酒精火焰灭菌，用已灭菌的勺子在每包内采样（150200ml）,装入采样容器内混匀加盖封好。要求整个操作过程在火焰旁进行，并且手不得接触样品。2、检验项目2.1好气菌3、检验方法3.1 无菌操作称取1g样品放入已灭菌的平皿内，吸取10ml无菌水注入平皿，并转动使混合均匀。3.2 无菌操作吸取1ml样品的稀释液加入已灭菌的平皿内，及时将冷却至45±1C的营养琼脂培养基注入平皿10-15ml,并转动平皿使混合均匀。

22、待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1C的电热恒温培养箱内培养24或48士2小时后，在菌落计数器上计菌落总数，结果乘以10即得每克样品中所含的好气菌数。4、结果处理4.1 检验结果以电脑报告单或书面报告单的形式报给企业领导、生技部、酿造部、供应部。二、无菌水、脱氧水1、抽样方法1.1取样时先打开取样阀排放少量液体，后用70-75%的酒精由内至外消毒取样阀,再用火焰灭菌（酒精火焰外焰灼烧15秒以上）。重新打开阀门排放样品，待阀门冷却后，取150200ml样品入已灭菌三角瓶。2、检验项目2.1 好气菌：每月至少抽检8次2.2 厌气菌：每月至少抽检1次2.3 大肠菌群：每月至少抽检1次3、检验

23、方法3.1 好气菌：同A、一、3.1中好气菌的检验方法3.2 厌气菌：同A、四、3.2中厌气菌的检验方法3.3 大肠菌群：同B、3.2.2及B、3.2.3中大肠菌群的检验方法4、结果处理4.1检验结果以电脑报告单或书面报告单的形式报给企业领导、生技部和酿造部。注：以上样品的细菌检验结果如每平板中的菌落总数1500时，即判为样品中的细菌含量无法计数，电脑报告单中以“9999”表示。附录1:培养基、中和剂及染色剂的配制和染色方法1、营养琼脂1.1 配制方法称取40克（当瓶身标签上的定量与之有出入时，按照标签上所规定的量配制）营养琼脂加入1000ml蒸储水，边加热边搅动，使培养基全部溶解，待培养基沸

24、腾后分装入干燥洁净的三角瓶，装入三角瓶的培养基的量一般为三角瓶容积的1/31/2。在分装时应注意不得使培养基沾污瓶口，以免浸湿棉塞，造成污染。1.2 灭菌条件121c湿热高压灭菌20分钟。1.3 保存条件低温保存2、UB幅养基2.1 配制方法称取62克（当瓶身标签上的定量与之有出入时，按照标签上所规定的量配制）UBA粉末培养基加入750ml蒸储水，边加热边搅动，使培养基全部溶解，待培养基沸腾后加入250ml未除气的啤酒混匀，分装入干燥洁净的三角瓶，装入三角瓶的培养基的量一般为三角瓶容积的1/31/2。在分装时应注意不得使培养基沾污瓶口，以免浸湿棉塞，造成污染。2.2 灭菌条件121c湿热高压灭

25、菌15分钟（当瓶身标签上的规定与之有出入时，按照标签上的规定灭菌）。2.3 保存条件低温保存3、NB酹养基3.1 配制方法称取66.3克NBB粉末培养基加入500ml蒸储水及500ml已除气的啤酒，边加热边搅动，煮沸后维持沸腾状态1分钟使培养基全部溶解。分装入干燥洁净的三角瓶，装入三角瓶的培养基的量一般为三角瓶容积的1/31/2。在分装时应注意不得使培养基沾污瓶口，以免浸湿棉塞，造成污染。3.2 灭菌条件121c湿热高压灭菌15分钟。3.3 保存条件低温保存4、1000PPM线菌酮溶液4.1 配制方法精确称取0.5g放线菌酮溶于500ml蒸储水，分装于三角瓶。4.2 灭菌条件115c湿热高压灭

26、菌15分钟。4.3 保存条件密封保存5、UBAD（或NBBD培养基无菌操作每100ml已灭菌的UBA（或NBB培养基中加入1ml1000PPM勺放线菌酮溶液，重新煮沸以混合均匀。6、麦汁培养基6.1 配制方法每1000mL已煮沸的麦汁缓慢加入已充分搅拌的蛋清2个，边加边搅拌，持续沸腾30-40分钟（加热过程要不断搅拌），待麦汁冷却后过滤，加蒸储水调整糖度为11勃力克司，然后加入1.7%1.8%琼脂，继续加热使琼脂全部溶解后过滤分装入干净三角瓶。6.2 灭菌条件115c湿热高压灭菌25分钟。6.3 保存条件低温保存7、乳糖胆盐发酯管（初发酯用）7.1 配制方法称取66克（当瓶身标签上的定量与之有

27、出入时，按照标签上所规定的量配制）乳糖胆盐发酵培养基溶入1000ml蒸储水（如配单料，蒸储水量加倍），加热至沸，分装入10ml的试管，装入培养基的量为3-4ml。在分装时应注意不得使培养基沾污试管口。7.2 灭菌条件115c湿热高压杀菌15分钟。7.3 贮存条件低温保存8、乳糖发酯管（复发酯用）8.1 成分蛋白月东20g乳糖10g0.04%澳甲酚紫水溶液25ml蒸储水1000mlpH7.48.2 配制方法将蛋白月东及乳糖溶于水中，校正pH,加入指示剂，按检验要求分装，方法同7.1。（双料乳糖发酵管除蒸储水外，其他成份加倍）8.3 灭菌条件同7.28.4 贮存条件同7.39、伊红美蓝琼脂平板9.

28、1配制方法称取伊红美蓝琼脂31g（当瓶身标签上的定量与之有出入时，按照标签上所规定的量配制）加入1000ml冷蒸储水，微火加热至溶解，115c高压灭菌15min,冷至56c左右倾注无菌平皿备用。平皿即制即用。10、革兰氏染色法10.1 结晶紫染色液（1:100）配制方法：a、准确称取1.000g结晶紫b、准确称取1.000g草酸镂溶于50ml蒸储水，再加水定容至100ml将结晶紫溶解于20ml95%的乙醇中，然后与80ml1%的草酸镂溶液混合至100ml。保存方法：密封保存保存期：3个月10.2 革兰氏碘液（1:300）配制方法：碘1g碘化钾2g蒸储水300ml将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸储

29、水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸储水至300ml。保存方法：密封避光保存保存期：3个月。10.3 复红染色液（1:400）配制方法：称取0.2500g碱性复红（或品红）溶于10ml无水乙醇，再加水稀释至100量升。保存方法：密封保存有效期：六个月10.4 染色法10.4.1 将涂片在火焰上干燥固定，滴加结晶紫染色液，染1分钟，水洗。10.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1分钟，水洗。10.4.3 滴加95%乙醇脱色，约30s;或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。10.4.4 水洗，滴加复红染色液，复染1分钟。水洗，待干，镜检。10.4.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。11、美蓝染色液（比例：1:5000）11.1配制方法：a、准确称取0.1000g亚甲基蓝溶于100ml蒸储水，再加水稀释至500mlb、准确称取5.4436g磷酸二氢钾溶于