(完整word版)土壤酶活性测定方法

1、土壤酶活性测定方法土壤麻酶的测定方法（苯酚钠一次氯酸钠比色法）一、原理腺酶存在于人多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤腺酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含屋、全氮和速效磷含屋呈正相关。根际土壤腺酶活性较高，中性土壤腺酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤聯酶活性表征土壤的氮素状况。土壤中服酶活性的测定是以腺素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚一次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析腺酶活性。二、试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至l

2、OOmL3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸懈水。将两溶液合并，用Imol/LNaOH将PH调至6.7,用水桶释定容至1000mlo4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇,加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇桶释至100ml（A液），存于冰箱中：27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馆水桥释至lOOmL5）次氯酸钠溶液：用水桶释试剂，至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸饌溶于水并桶释至1000ml,得到1ml

3、含有O.lmg氮的标准液：再将此液棉释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）o三、操作步骤称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加lOrnllO%尿素溶液和20mlPH6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37°C恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。lh内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在lh内保持稳定）。标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮

4、工作液,移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馆!水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。lh内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。注意事项：1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸饰水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样四、结果计算：以24小时后lg土壤中NH3N的亳克数表示土壤腺

5、酶活性（Ure）。Ure=（a样品一a无土一a无基质）XVXn/m式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3N亳克数；a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3N亳克数；a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3N亳克数；V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积/吸取滤液体积；m表示烘干土重土壤磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠比色法）一、原理测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。前一种通常称为有有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法，后一种称为无机磷含屋法。研究证明：磷酸酶有三种最适PH值:45、67、810o因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要

6、提供相应的PH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最人活性。测定磷酸酶常用的PH缓冲体系有乙酸盐缓冲液（PH5.05.4）、柠檬酸盐缓冲液（PH7.0）、三疑甲基氨基甲烷缓冲液（PH7.08.5）、和硼酸缓冲液（PH9V0）。磷酸酶测定时常用基质有磷酸苯二钠、酚酿磷酸钠、甘油磷酸钠、a-或者B-蔡酚磷酸钠等。现介绍磷酸苯二钠比色法。二、试剂1）缓冲液：（1）醋酸盐缓冲液（PH5.0）O.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L.O.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27gC2H3O2Na.3H2O溶至IL.取14.8mlO.2mol/L醋酸溶液和35.2mlO.2mol/

7、L醋酸钠溶液桶释至1L.（2）柠檬酸盐缓冲液（PH7.0）O.lmol/L柠檬酸溶液19.2gC6H7O8溶至1L.0.2mol/L磷酸氢二钠溶液53.63gNa2HPO4.7H2O或者71.7gNa2HPO4.12H2O溶至IL.取6.4mlO.lmol/L柠檬酸溶液加43.6ml0.2mol/L磷酸氢二钠溶液桥释至100ml.（3）硼酸盐缓冲液（PH9.6）0.05mol/L硼砂溶液19.05g硼砂溶至1L.0.2mol/LNaOH溶液8gNaOH溶至IL.取50ml0.05mol/L硼砂溶液加23ml0.2mol/LNaOH溶液桶释至200ml.2）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）3）

8、氯代二漠对苯醍亚胺试剂：称取0.125g氯代二澳对苯醍亚胺，用10ml96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。4）甲苯5）0.3%硫酸铝溶液6）酚标准溶液酚原液：取lg重蒸酚溶于蒸馆水中，桶释至1L,存于棕色瓶中。酚工作液（0.01mg/ml）：取10ml酚原液桥释至1L。三、操作步骤称5g土样置于200ml三角瓶中,加2.5ml甲苯,轻摇15min后，加入20ml0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用乙酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液;碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液）,仔细摇匀后放入恒温箱，37°C下培养24h。然后在培养液加入100ml0.3%硫

9、酸铝溶液并过滤。吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，于分光光度计上660nm处比色。标准曲线绘制：取0、1、3、5、7、9、11.13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml硼酸缓冲液和4滴氯代二澳对苯匪亚胺试剂，显色后桶释至刻度，30min后，在分光光度计上660nm处比色。以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。注意事项：1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸饰水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验

10、试剂纯度和基质自身分解。3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样四、结果计算以24h后辽土壤中释放岀的酚的质量（mg）表示磷酸酶活性。磷酸酶活性二（a样品一a无土一a无基质）XVXn/m式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚亳克数；a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚亳克数；a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚亳克数；V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积/吸取滤液体积；m表示烘干土重土壤蔗糖酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）一、原理蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况卞，土壤肥力

11、越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。二、试剂1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.876gNa2HPO42H2O溶于1L蒸馅水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸懈水中）9.5ml即成，甲苯2）葡萄糖标准液（lmg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80°C烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馆水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4°C

12、保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现彖，则应弃之，重新配制。3）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/LNaOH和50ml水中,再加30g酒石酸钾钠,用水桥释定容至100ml（保存期不过7天）。三、操作步骤（1）标准曲线绘制分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馆水至ImL,加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。（2）土壤

13、蔗糖酶测定称取5g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml8%蔗糖溶液，5mlpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37°C下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液lml,注入50ml容量瓶中，加3mlDNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min,随即将容量瓶移至自来水流2令却3mino溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馆水桥释至50ml,并在分光光度计上于508nm处进行比色。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照：如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样

14、。）四、结果计算：蔗糖酶活性以24h,lg干土生成葡萄糖亳克数表示。蔗糖酶活性二（a样品一a无土一a无基质）Xn/ma样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖亳克数；n为分取倍数；m表示烘干土重土壤纤维素酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）一、原理纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用卞，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。二、

15、试剂1）甲苯2）1%竣甲基纤维素溶液：辽竣甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至lOOmL3）pH5.5醋酸盐缓冲液：0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L.0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至IL.取Ilml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀即成PH5.5醋酸盐缓冲液.4）3,5二硝基水杨酸溶液:称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml2mol/LNaOH和125ml水中,再加75g酒石酸钾钠，用水桶释至250ml（保存期不过7天），5）葡萄糖标准液（lmg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80&

16、#176;C烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馆水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4°C保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现彖，则应弃之，重新配制。三、操作步骤葡萄糖标准曲线:分别吸lmg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于试管中，再补加蒸馆水至lmL,加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min,取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min,再加5ml1

17、%竣甲基纤维素溶液和5mlpH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37°C恒温箱中培养72h°培养结束后，过滤并取lml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照：如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。）四、结果计算纤维素酶活性以72h,lg干土生成葡萄糖亳克数表示。纤维素酶活性=（a样品一a无土一a无基质）Xn/ma样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖亳克数；n为分取倍数；m表示烘干土重过氧化氢酶活性测定（高镭酸钾滴定法）一、原理过氧化氢广

18、泛存在于生物体和土壤中，是由生物呼吸过程和有机物的生物化学氧化反应的结果产生的，这些过氧化氢对生物和土壤具有毒害作用。与此同时，在生物体和土壤中存有过氧化氢酶，能促进过氧化氢分解为水和氧的反应（H2O2-H2O+O2）,从而降低了过氧化氢的毒害作用。土壤中过氧化氢酶的测定便是根据土壤（含有过氧化氢酶）和过氧化氢作用析出的氧气体积或过氧化氢的消耗量，测定过氧化氢的分解速度，以此代表过氧化氢酶的活性。测定过氧化氢酶的具体方法比较多，如气量法：根据析出的氧气体积来计算过氧化氢酶的活性；比色法:根据过氧化氢与硫酸铜产生黄色或橙黄色络合物的量来表征过氧化氢酶的活性;滴定法：用高怯酸钾溶液滴定过氧化氢分解

19、反应剩余过氧化氢的量，表示出过氧化氢酶的活性。本实验重点采用高镒酸钾滴定法。二、试剂2mol/LH2SO4溶液:量取5.43ml的浓硫酸稲释至500ml,置于冰箱贮存；0.02mol/L高猛酸钾溶液:称取1.7g高锈酸钾,加入400mL水中，缓缓煮沸15min,冷却后定容至500mL,避光保存，用时用0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/L草酸溶液：称取优级纯H2C2O4-2H2O3.334g/用蒸馆水溶解后，定容至250ml；3%的H2O2水溶液：取30%H2O2溶液25ml,定容至250ml,置于冰箱贮存，用时用0.1mol/LKmnO4溶液标定。三、操作步骤分别取5g土壤样品于具塞三角瓶中（用不加土