PCR检测常见问题与解决途径

1、PCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性

2、结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。（二）造成假阳性的原因1 .样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2 .PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。3 .PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大（一般为1013拷贝/ml）,远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污

3、染，就可形成假阳性。4 .气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。5 .实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见。（三）假阳性问题的试验控制在每次PCR检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对

4、照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA提取（RNA提取、RNA反转录）、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。试验对照包括:1、DNA阳性对照：以含有目的片段的DNA（或质粒）作为模板进行扩增，证明PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。（注意：阳性样品扩增效率高，应严格控制，避免其成为潜在的污染源）。2、DNA阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进

5、行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。3、空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。4、PCR抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样品DNA,如果未扩增出目的片段，证明此待测样品DNA中存在PCR抑制物。5、空白提取对照：空白提取对照扩增结果为阳性，说明DNA提取试剂可能受到污染。6、阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。如果DNA阳性对照扩增结果为阴性，或者DNA阴性对照和空白对照扩增结果为阳性，则说明PCR试剂或扩增过程存在问题。（四）假阳性解决途径由于PCR的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管

6、即可出现假阳性。尤其是PCR扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染，导致假阳性现象发生。1、规范实验室设计实验室设置上分配液区、DNA提取区、扩增区、电泳区。物流应按分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区顺序，严禁倒流。在连续而独立的空间中完成不同实验步骤。不同工作区域相互隔离，通过传递仓传递。PCR前处理区（样品制备室、DNA提取室）和PCR准备室设置正压通风系统，并设置通风柜或生物反应柜造成局部负压；后PCR室（PCR室及电泳室为高度污染区）设置负压通风系统，防止大量游离分子及气溶胶，对其它区域造成环境污染。配制PCR反应体系（配备冰箱及生物安全小I,此实验室要求无模板DNA存在）和向PC

7、R反应体系中加入模板DNA（配备生物安全柜及冰箱）要求在不同区域进行。2、规范试剂耗材管理1）验证：新购买的试剂需进行实验前验证；2）分装：双蒸水、引物和dNTP均应分装储存，并标明日期，以防污染；试剂的分装应在装有紫外灯的超净工作台上进行；试剂分装成小份一次使用后弃去。3）消毒：除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。必要时，在加样本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。3、规范实验室操作1）控制污染源：PCR产物和质粒操作空间是最大的污染源，应严格防止将这个空间的物品带出；2）一次性用具：使用实验服和一次性手套，使用带有滤膜的移液器枪头，一次性反应管和离心管；3）定

8、期消毒：定期对实验室进行紫外照射，用10%漂白剂、3%双氧水或专用商业产品清理实验室台面及死角。4）定期通风：对实验室定期进行正压、负压通风处理；5）小心操作：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；加样时，最后加阳性对照。4、技术处理1）在DNA模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR产物。一般选用波长254nm照射30min（Nature,1990,34:27）;2）PCR实验中使用dUTP，而不用dTTP。在扩增前使用UraciIN-g1ycosylase（尿喀咤糖基化酶）处理可降解交叉污染的PCR产物，而不降解基困组DNA模板，然后热灭活此酶，再进

9、行扩增反应（Gene,1990,93:125）。美国PE公司提供此类试剂盒；3）在PCR反应前加入一种光化学试剂，反应完成后激活该试剂，光化学试剂可交联DNA链，使之不能再扩增（NucleicAcidsRes,1991,19:99）。二、假阴性（一）假阴性现象与判断方法如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。但这里应注意，许多国产PCR试剂盒中阳性对照采用质粒DNA,和标本相比来说，不需纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可能有假阴性。设置内标准基因对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中同时对

10、内标准基因对照进行扩增，若内标准基因对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。（二）造成假阴性的原因1 .仪器因素PCR实验对仪器的依赖性是很高的，离心机、扩增仪都是造成PCR假阴性的因素。扩增仪的主要问题是孔间差，引起扩增失败或扩增效率降低。而离心机的影响则更容易被忽视。国内使用离心机很少使用离心加速度（XXXg）作为参数指标，而常使用转数作为参数指标，这里就存在着一个问题，由于离心机的大小不同，有效跳心半径也不相同，因此同样的转速所产生的离心力相差很大（有的在数倍以上），所以在相同的离心时间下，有可能模板并没有离心下来，造成PCR假阴性。这个问题在其他实验也有，但因其他实验都是测定大

11、分子蛋白沉淀，对离心的速度要求较低所以不太明显。建议使用小型台式离心机的实验要注意一下这个问题。2 .试剂质量问题PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要，试剂的质量问题涉及多个方面：细胞的裂解；模板的抽提；引物位点的选择；Taq酶的活性等等。其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。这些都是试剂质量的问题，因此选用高质量的PCR试剂非常重要。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或澳乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两

12、条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。3 .核酸模板问题1）模板中含有杂蛋白质；2）模板中含有Taq酶抑制剂；3）模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；4）在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；5）模板核酸

13、变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。4、物理原因：PCR仪控温不准，也是PCR失败的原因之一。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪内的变性、退火和延伸温度。5、靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。6.操作人员素质问题PCR实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误等等都能造成结果的假阴性。（三）假阴性问题的试验控制在每

14、次PCR检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA提取（RNA提取、RNA反转录）、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。试验对照包括：1、DNA阳性对照：以含有目的片段的DNA（或质粒）作为模板进行扩增，证明PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。（注意：阳性样品扩增效率高，应严格控制，避免其成为潜在的污染源）。2、DNA阴性对照：以不含有目的片段的阴性样

15、品作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。3、空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。4、PCR抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样品DNA,如果未扩增出目的片段，证明此待测样品DNA中存在PCR抑制物。5、空白提取对照：空白提取对照扩增结果为阳性，说明DNA提取试剂可能受到污染。6、阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。如果DNA阳性对照扩增结果为阴性，或者DNA阴性对照和空白对照扩增结果为阳性，则说明PCR试剂或扩增过程存在问题。（四）假阴性解决方案1 .反应体系不灵敏：1）检查PCR试剂是否失效；2）

16、检验引物是否降解：3）优化PCR扩增体系与程序。2、PCR反应存在抑制物：（1）稀释*II板DNA,进行扩增分析；（2）纯化模板DNA,除去蛋白质、多酚、多糖等抑制物；（3）检测PCR体系中是否含有扩增抑制物。3、DNA提取失败：1）选择与优化样品DNA提取方法；2）验证DNA提取试剂是否失效。三.非特异扩增（一）现象PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，（二）原因：1 .引物设计与浓度问题引物设计：引物碱基的G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5

17、个以上的喋吟或喀咤核甘酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物浓度：每条引物的浓度0.11umol或10100Pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。2 .Mg2+离子浓度过高：在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.52.0mmo

18、l/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。3 .退火温度过低：变性后温度快速冷却至40c60C,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核甘酸，G+C含量约50%的引物，55c为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(510C)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温

19、度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec,足以使引物与模板之间完全结合。4 .PCR循环次数过多：当其它参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后，反应中TaqDNA聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增水平可达109-1010。扩增产物的量还与扩增效率有关，扩增产物的量可用下列公式表示：C=Co(1+P)n。

20、其中：C为扩增产物量,C0为起始DNA量，P为增效率，n为循环次数。在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。5.酶的质和量，催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。四.PCR扩增出现涂抹带dNTP浓度过高，Mg2+浓度

21、过高，退火1、原因：往往由于酶量过多或酶的质量差,温度过低，循环次数过多引起。2、对策：1)减少酶量，或调换另一来源的酶；2)减少dNTP的浓度；3)适当降低Mg2+浓度；4)增加模板量，减少循环次数。五、标准问题转基因成分检测一般按照标准方法进行，引物和PCR反应体系一般都经过了严格的循环验证。有时标准方法可能存在问题，导致假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的产生。标准方法可能存在的问题有：1 .引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。2 .Mg2+浓度不合理：Mg2+离子浓度

22、对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。3 .反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,应用多大体积进行PCR扩增，是根据检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。4 .PCR温度设置不合理：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。六、检测极限问题当样品中转基因成分很低时，反应体系

23、内可能不含有扩增模版，因而容易造成假阴性结果。PCR理论检测极限是在反应体系中存在一个拷贝的目标DNA分子，由于人的判读能力限制和PCR效率等原因，定性检测实际极限值一般是理论检测极限值的10-30倍。也就是说，如果转基因成分低到检测极限时，检测不到转基因成分的可能性会很大，或者说出现假阴性的概率很大。出现假阴性的原因是由于抽样误差，反应体系中不存在有效扩增的模版分子。此时是不适合做PCR检测的。根据作物基因组的大小，可以计算出不同作物的理论检测极限并估计出实际检测极限。例如在100微升的反应体系中，小麦基因组有0.58万个拷贝，一个转基因拷贝的重量比（理论检测极限）是0.0174%,玉米的理

24、论检测极限是0.003,其他作物的理论检测极限一般在0.001%-0.01%。如果反应体系是20微升，理论检测极限值将提高5倍，小麦为0.085%,玉米为0.015%,其他作物将在0.005-0.05%之间。反应体系是20微升的定性检测实际极限值一般是在0.05-0.5%。低于这个含量时，反应体系中有时不含扩增模版DNA,因此很难得到正确的检测结果。七.怎样查找污染源如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。（一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源

25、。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA,这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。（二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不

26、久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。环境污染中常见的污染源主要有：1 .模板提取时真空抽干装置；2.凝胶电泳加样器；3.电泳装置；4.紫外分析仪；5.切胶用刀或手术刀片；6.离心机；7.冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；此时可用擦拭实验来查找可疑污染源：1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。8.气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。八.污染处理

27、（一）环境污染1 .稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱喋吟；2 .紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中喀咤碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有喀咤均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，喀咤二聚体的类型及与二聚体位点相邻核甘酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量

28、少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型喀咤复合体，胸腺喀咤乙二醇，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止TaqDNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。（二）反应液污染可采用下列方法之一处理：1 .DNaseI法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UD

29、NaseI,室温反应30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；2 .内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如MspI和TaqI等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h后加热灭活进行PCR;3 .紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法；4 .g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA,2.0kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0kGy仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR,g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。（三）尿喀咤糖昔酶（UNG）法由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。1,原理：在PCR产物或引物中用dU代替dTo这种dU化白PPCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿喀咤碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿喀咤，而对RNA中的尿喀咤和单一尿喀咤分子则无任何作用。,dUTP