Illumina测序基础知识

1、第一个要给大家讲的，是它这个flowcell 。 Flowcell 翻成中文，就叫 “流动池”。我们来看这个图片。图片当中，我们看到一个象载玻片大小的芯片。这个芯片里面，是做了8 条通道。 在这个通道的内表面，是做了专门的化学修饰。它的化学修饰，主要是用2 种 DNA 引物，把它（2 种 DNA 引物）种在玻璃表面。这两种（DNA 引物的）序列是和接下来要测序的DNA 文库的接头序列相互补的。而且这2 种引物是通过共价键，连到Flowcell 上去。之所以要用共价键连到 Flowcell 上去，是因为接下来有大量的液体要流过这个Flowcell ，只有有共价键连接的这些DNA，才不会被冲掉。这

2、就是Flowcell 。文库制作再接下来，讲一下文库、和文库的制作（过程）所谓的 DNA 文库，实际上是许多个DNA 片段，在两头接上了特定的DNA 接头，型成的DNA 混合物。文库有 2 个特点，第1 个特点，是当中这一段插入的DNA ，它的序列是各种各样的。 第 2 个特点， 它的两头的接头序列，是已知的，而且是人工特地加上去的。要做这个文库，首先是把基因组DNA ，用超声波打断。然后打断之后，两头用酶把它补平，再用Klenow 酶在 3 端加上一个A碱基。然后，再用连接酶把这个接头给连上去。连好了接头的DNA 混合物， 我们就称为一个 “文库” 。 英文也称作“ library ” 。桥

3、式 PCR做好了 Library 之后，就要做桥式PCR了。桥式PCR，实际上是把文库种到芯片上去，然后进行扩增，这样的一个过程。这个过程，首先是把文库加入到芯片上，因为文库两头的DNA 序列，和芯片上引物是互补的，所以，就会产生互补杂交。杂交完了之后，我们在这里面加入dNP 和聚合酶。聚合酶会从引物开始，延着模板合成出一条全新的DNA 链来。新的这条链，和原来的序列是完全互补的。接下来，我们再加入NaOH 碱溶液。 DNA 双链在 NaOH 碱溶液存在下，就解链了。而且被液流一冲，原来的那个（模板）链，也就是没有和芯片共价连接的链，就被冲走了。而和芯片共价连接的链，就被保留下来。然后， 我们

4、再在液流池里加入中性液体，主要是为了中和这个碱液，在加入中和液之后，整个环境变成中性了。这时侯，DNA 链上的另外一端，就会和玻璃板上的第二种引物，发生互补杂交。接下来，我们加入酶和dNTP ，聚合酶就延着第二个引物，合成出一条新链来；然后， 我们再加碱，把 2 条链解链解开；然后， 我们再加中和液，这时侯， DNA链会和新的引物杂交。再加酶，再加dNTP ，又从新引物合成出新的链来。连续重复这一过程，DNA 链的数量，就会以指数方式增长。制备单链在桥式 PCR完成之后，接下来要做的工作，就是要把合成的双链，变成可以测序的单链。办法是通过一个化学反应，把其中一个引物上的一个特定的基团给切断掉。

5、然后，再用碱溶液来洗这个芯片。这时侯，碱让DNA 的双链解链，那根被切断了根的 DNA 链就被水冲掉了。留下那根共价键连在（芯片）上面的链。接下来，再加入中性溶液，然后在这个中性溶液里面加入测序引物。正式测序好，接下来正式的测序工作就开始了。那么，在测序的时侯，加入进去的，最主要是2 个东西：一个是带荧光标记的dNTP 。 而这个 dNTP ， 它还有一个特点，它的 3 末端是被一个叠氮基堵住的。然后，再加一个聚合酶，聚合酶就会选择：哪一个dNTP 是和原来位置上的那个碱基是互补的，根据互补性原理，把这个 dNTP 合成到新的这个DNA 链上去。因为这个dNTP 的 3 端是被一个叠氮基团堵住

6、了，所以，它一个循环只能延长一个碱基。然后，它就停在那儿了。合成完了之后，就用水把多余的dNTP 和酶给冲掉。冲掉之后，就放到显微镜下，去进行激光扫描。根据发出来的荧光来判断它是哪个碱基。因为 4 种 dNTP ， 它每一种dNTP 上面标的荧光素都不一样，根据红、 黄、 蓝、绿，它出来的哪种颜色，那么，就可以倒过来推出来，这个新合成上去的碱基，是哪种碱基。因为新合成的碱基，是和原来位置（的碱基）是互补的，所以，又推出模板上那个碱基是哪个。这一个循环完成之后，就加入一些化学试剂，把叠氮基团和旁边标记的荧光基团切掉。切完了之后，3 端的羟基就暴露出来。再接下来，加入新的dNTP 和新的酶，然后，

7、又延长一个碱基。新延长完一个碱基之后，把多余的酶和dNTP 冲掉，再进行一轮显微的激光扫描，再读一下这个碱基是什么。不断重复这个过程，可以重复上百次，到几百次，就可以把上百个碱基，甚至更多碱基的序列读出来。读 Index那么，什么是Index 哪？是因为Illumina 的评委会个测序量很大，往往一个样本，用不了那么几亿条DNA 。所以，科学家就想了一个办法。在文库的接头上做了一些标记，每一个样本，它有一个特定的接头，每个接头里面，它有一段特定的序列。这段特定的序列，我们就称为Index 。也有人把它叫做Barcode ，反正，表达的是一个意思：这么一段特定的序列，标记了样本的来源。那么，要读

8、这个Index 的序列，先用碱把上面这根测完“Read 1 ”的序列，把上面这根DNA 链给解链掉。解链掉之后，再加入中性液，然后，加入“Read 2 ”这个测序引物。 Read 2 测序引物结合的位点，正好，就在这个Index 序列的旁边。接下来，就进行第2 轮测序，一般来说，是读6 到 8 个碱基。把这6 到 8 个碱基读下来，我们就可以知道，这某一个具体的一段DNA ，它来自于原始的哪个样本。双端测序这是 Illumina 的最核心的另外一个技术，就是双端测序。那么双端测序，就是说，一根DNA 链，除了从正向读一遍，还可以从DNA 的负向，再读一遍。这一下子就把Illumina 测序的有

9、效长度加了一倍。这是非常有实际用途的。那么这个倒链的过程，是这样，先让这个DNA 先合成，合成出来这根互补链。有了这个互补链之后，用一个化学试剂 ，在原来这根链的根上切一下。切一下，原来这根模板链就掉了，剩下那根互补链。再接下来，就进行第2 端的测序。第2 端的测序原理，和第一端的测序原理是一样的。加上了“ Read 3 ”的这个引物，依次往下，一个一个碱基地往下读。大规模平行测序那么最重要的事情是什么呢？一个点，经过几百个循环，就读出了几百个碱基。但实际上，这个芯片上可以有上亿个点，上亿个“cluster ”，也就是“簇”。那么上亿个“cluster ”，每个循环，它都可以读出地么多序列，这

10、是 Illumina测序非常强大的原因。因为是成千上万，准确说是上亿上链都在合成，这个就得到了很大的一个测序数据量。Illumina HiSeq 测序仪的工作原理。也就是芯片上发生了这么多变化，HiSeq 是如何把这些信息给读出来，并且把扫描出来的荧光信号，又通过怎样一系列的加工，变成可以识别的“ A、 C、 G、 T”的碱基序列的。HiSeq 首先是一台高精度的显微光学扫描仪。然后再配上了一整套的液流系统，和计算机软硬件，再加温控系统，组成这样一台测序仪。其中最核心，也是结构最复杂的，是它的光学系统。前一期，我们讲了，Illumina 测序仪主要是靠4 种 dNTP 分别带有不同的荧光基团，

11、在被激光照了之后，发出不同颜色的荧光。再通过对光的颜色的分辩，可以判断出到底是哪个碱基。光路结构这里，我们要说明一下：感光元件CCD，它本身是色盲。所以，它一定要配合滤光片，才能分辩出颜色来。那我们先来看一下，HiSeq 的光路图。左边这两个元器件，就是激光器。一个发出红色激光，另一个发出绿色激光。其中红色激光主要是激发A 和 C，这两种碱基上的荧光基团；而绿色激光主要是激发 G 和 T，这两种碱基上的荧光基团。红色和绿色这两束光，通过一面半透半反镜，组成一道激光。这道激光打在Flowcell 上。那么请注意，Flowcell 就放在这个位置。在 Flowcell 里面， 结合在 DNA 上的

12、那个荧光基团在激光的照射下，就发出荧光。荧光通过3 面半透半反镜，和1 面全反镜，被分成4 条光路，这4 道光线，分别通过一道滤光片，这4 张滤光片的滤过波长不一样。这样，这4 道光在经过了滤光片之后，就变成了4 种颜色不同的光线。然后， 这 4 条颜色不同的光线，各自照在一面反射镜上，通过反射镜进入到CCD。这 4 个 CCD 就记录到不同颜色的光线。TDI 线扫描HiSeq 的光线扫描是“线扫描”，和传统的相机不一样，传统的相机是面扫描。HiSeq 采取了一种特定的叫“ TDI ” 线扫描方式，TDI 是 Time delayintegration的缩写。在 HiSeq 上之所以采取TDI

13、 扫描方式，因为它有非常明显的优点。第一个优点，就是它的扫描速度非常快，在HiSeq 2500 上，从 Flowcell 的一个 Lane 的一头扫到另外一头，也就是一个“ Swath ”的扫描时间，大概只有 20秒种不到。第二个好处，就是它的扫描精度非常高。在最新的HiSeq V4 版试剂上，它的光点密度，大概可以达到每平方毫米90 万个点，要扫描清楚这么高密度的光点，扫描仪的扫描精度是可想而知的。TDI 扫描的第三个好处，是这种方式，可以把Flowcell 的上表面、和下表面都扫描到。Flowcell （测序芯片）接下来，我们再要详细介绍这张Flowcell 。那么，先来看一下，这张flo

14、wcell 有点象一张载玻片，在这一张片子里面，我们可以看到，它做了8 条通道。每条通道，我们称为一个Lane 。这 8 个 Lane 之间，相互是隔绝的。每个Lane 的两端各有一个小孔。这两个小也孔，就是液流流进、流出的地方。每个Lane 的上表面和下表面，都分别以共价键的方式，种了2 种 DNA 引物。这两种 DNA 引物，是与文库接头的两头序列相互补的。上一期（节目）我们已经说明了这一点。一个 Lane 里面，分成2 个面，上表面、和下表面。上表面和下表面，都种了DNA 引物，也都是可以产生测序数据的。在每一条Lane 的每一个面，又被分成了3 个扫描通道，每个道被称为一个“ swat

15、h ”。每条 Swath 是从头到底被连续扫描的。但是它的数据，在进行数据分析的时侯，是被分割成16 个小方块。这每一个小方块，被称为一个“ tile ” 。这样一张Flowcell ，总共就是768 个 Tile。每个 Tile 在扫描的时侯，会根据4种颜色，产生4 张照片。图像处理扫描完了之后，就要进行图像处理。扫描出来的最原始的文件，它的格式是“ .tiff ”文件。 Tiff 文件记录了每个像素点上采集到的光强度。Tiff 文件的优点是它是完全无损， 保留了所有的原始信息。但它也有它的不足之处。它的不足之处就是它的这个文件太大了。它的数据量很大，既不便于数据的传输，也不便于数据的存储。

16、接下来，计算机软件就把图像文件转化成光点文件。光点文件叫“.BCL”文件。也就是“ Base calling ”的英文缩写。要把图像文件，转化成 BCL 文件，就是把4 种颜色的4 张照片，组合在一起，变成一张有4 种颜色的彩色照片。这其中首先要解决的，是4 张照片在空间位置上的匹配问题，因为4 张照片是通过 4 个 CCD 分别拍下来的，所以，会有一定的空间上的偏差。软件要通过对4 张照片上，亮点相互比对，找到最合适的、匹配的位置。这里， 我们要说明一下，如果被测的文库是碱基不平衡的文库，在这个空间匹配上就会遇到问题。什么叫碱基平衡呢？也就是说，在测序过程当中，每个循环，A、 C、 G、 T

17、四种碱基，都是比较均匀在存在的。最典型是人全基因组文库，这是一个典型的碱基平衡文库。那什么是碱基不平衡文库呢？最典型的，就是PCR 扩增子产生的文库。PCR 扩增子的特点：PCR 是有特定的起始位点的，一个特定的测序循环中，几乎所有的片段都是同一种碱基，而剩下的3 种碱基，就特别少。这在反映到照片上去的时侯，就变成：一张照片特别亮，光点很多。而其它的三张照片就特别暗，上面的光点就很少。这时侯， 要软件做空间上的比对，软件就会觉得困难，因为对于那几张暗的照片，软件很难判断上面的光点，是否与那张亮的照片上的光点真正对得上。结果， 就是判断出来的可靠性变差。最后， 就是测序的数据质量变差，有效数据量

18、也会变少。要解决这个问题，办法是在测序过程中掺入一些碱基平衡的文库。例如掺人全基因组文库。或者也可以掺Illumina 提供的标准的PhiX 文库， 这些都是碱基平衡文库。它的作用，是在每个循环当中，为每一种颜色的照片，都提供足够多的亮点。这样，它可以弥补那些不平衡的文库当中缺亮点的问题。BCL 文件当把 4 种颜色的光点组成一个文件之后，软件就会生成一个“.BCL”文件。“ .BCL”文件就是光点文件，它对每个光点，记录了以下的内容。首先一个光点处在哪个Lane 里面。其次，这个光点在这个Lane 的哪个 Tile 里面。第 3， 就是这个亮点在这个Tile 的 X轴和 Y轴的座标位置。第4

19、，是记录了这个光点当中“红、黄、蓝、绿”四种光的对应的光强。这个图是 BCL 文件的一个示意图。实际上，BCL 文件是二进制文件，无法拿来直接阅读。也正是因为BCL 文件难于阅读，并且很难改动，所以，BCL 文件几乎不存在做假的可能。在测序过程当中，有许多客户会要求测序公司提供原始的测序数据，如果客户是包 Lane、或者包Flowcell 的，一般测序公司是可以提供BCL 文件的。客户在拿到BCL 文件之后，可以用“BCL2FASTQ”这个软件，把 BCL 文件转化成 FASTQ 序列语文件。以此，客户可以来验证，测序公司提供的数据是否是原始的，是否是真实的。再说一下最初生成的那个tiff 文

20、件。 tiff 文件实在太大了，所以，测序仪在测序过程中，只把tiff 文件作为中间文件。最后是把这个tiff 文件删掉的。如果客户想要原始的图像文件，在 HiSeq V4 之前， 可以让测序公司保留“ .CIF”文件。 CIF 文件是一种彩色图案的向量文件，它的优点是比tiff 文件的数据量小很多。测序公司把CIF文件给客户之后，客户就可以看到原始的图像文件了。但是， 请注意： 在 HiSeq 升级到 V4 之后， 保留 CIF 文件的这个选项是被取消掉V4 Lane 的客户来说，是拿不到CIF文件了。碱基识别接下来，我们讲一下碱基识别。我们之前讲：4 种 dNTP ，各标一种荧光基团，红、

21、黄、蓝、绿，四种颜色，根据颜色来判断碱基种类。这个实际上是一种简化了的说法。实际情况，要比这个复杂得多。来看这个图，这是 2 种荧素的荧光的波长图。我们会发觉，这两种荧光色，它发出来的发射光，它在波长上是有交叠的。在X的这个位置，主要是绿色荧光素的贡献，但是蓝色荧光素，也有少许贡献。而在 Y这个波长位置，蓝色荧光素是做了主要贡献，但是绿色荧光素，也有少量供献。在实际测序过程中，是4 种荧光素发出的亮，相互有交叠，相互之间的交系，变得更加复杂。那么，现在我们要做的事情，是把A、 C、 G、 T， 4 种荧光素的贡献给拆开。首先， 我们就要确定4 种荧光素在4 个被测波长处的贡献率。我们可以看一下

22、，这个表， 就是 4 种荧光素，在 4 个波长分别有不同的贡献率。这样就组成一个4X4 的贡献率表格。我们在实际的分析当中，等于解一个4 元1 次、 4 联方程。 因为是 4 个未知数，又是 4 个方程， 所以肯定是可以解出来的。说解方程，有点复杂。那么我们来打一个比方。让大家来理解这个事情。假设有一家饭店，它有4 个熟客：甲、乙、丙、丁。它日常又提供4 道菜：猪肉、白菜、黄瓜、花生。大厨知道：甲最爱吃猪肉、乙最爱吃白菜、丙最爱吃黄瓜、丁最爱吃花生，每个人来了饭店之后，主要吃自己最爱吃的，也会吃些别的菜，但别的菜都吃得不是太多。那么这个大厨不到前台，看不到今天来的客人。如果， 这个大厨想要知道

23、今天来的客人是谁，他有什么办法呢？看今天哪个菜被吃掉得最多。如果今天的菜被吃掉的最多的是猪肉，那他可以大致地判断，今天是甲来过了；如果他看到今天被吃掉的菜，最多的是白菜，很可能是乙来过了；那么其它的，道理也是一样的。希望这个例子可以帮大家来理解一下，这4 个荧光和4 种碱基的判读的关系。Phasing 和 Prephasing接下来，我们再讲一下，Phasing 和 Prephasing 。在 Illumina 的测序过程当中，一个簇，大概有5 千个到 1 万个分子。但是在边合成、边测序的过程当中，每一步酶反应，理想情况下，应该这 5 千个分子都延长 1 个碱基。但实际情况，总有少量分子没有完

24、成延长反应。也就是说，总有少量的分子会掉队，我们称这种掉队的现象叫“phasing ”。 Phasing 主要是由于酶活性不足，所引起的。如图所示，掉队的这个分子，它所发出的荧光信号，和大部队所发出的荧光信号是不一样的。这个循环的次数越多，掉队的分子就越多。所以，测序越到后面，它 Phasing 的分子数就越多。最后，信号的可靠性就越差。除了掉队的分子，还会有一部分分子，会跑得超前，也就是在一个循环中，它延长了 2 个碱基。在一个循环中延长了2 个碱基的最主要的原因，是dNTP 上标记的那个叠氮基团(N 3)掉了。我们知道，叠氮基团是非常容易从有机化合物上掉落的。当叠氮基团掉落之后，dNTP

25、的 3 端的羟基就暴露出来了。当丢失了叠氮基团的dNTP 加到(合成链的) 3 端之后，它的聚合反应不会终止，而是会继续往前走。当再加上了一个带叠氮基团的dNTP 之后，这个聚合反应才停下来。这样的后果，就是一个循环，某些分子，会合成了2 个碱基。也就是说比大部队多走了一步。那么这个多走了一步的碱基，它所发出来的荧光颜色，也是和大部队不一样的。在 Illumina 测序过程当中，Phasing 和 Prephasing 是限制测长的最主要原因。也就是说，随着循环不断进行，越来越多的分子掉队，还有越来越多的分子超前。然后， 它们所产生的噪音，掩盖了大部队的信号的时侯，也就是测序开始测不准的时侯。

26、在 HiSeq 测序当中，从第12 个循环开始，在计算某个光点是哪种碱基的时侯，就要把 Phasing 和 Prephasing 的影响，纳入考虑。Chastity和 Pass filter为了对光点当中荧光素的纯粹程度进行描述，Illumina 公司定义了个标准，叫“ chastity ”， Chastity 的定义，就是浓度最高的那个荧光素的量，去除以“它自己 + 排名第二的荧光素的量的和”。大于 0.6 是一个好碱基。用更加通俗的话来说，也就是“老大”比 “老二”，如果大于、 等于“ 1.5 倍”，这就是个“好”碱基。如果“老大”比“老二”不足“1.5 倍”，这就是个“坏碱基”。Illu

27、mina 对每个 read 的质量都要做一个检验，这个检验就叫“pass filter ”检验。 检验的标准，是看前 25 个碱基当中，有几个是 “坏碱基”。 如果只有一个、或者没有坏碱基，则Pass filter 就通过；如果有超过一个以上的坏碱基，Passfilter 就不能通过。那我们平时说，测序服务保证多少“PF data ”，指的就是 Pass Filter(PF) 的数据。Pass Filter 最主要的作用，就是把那些一个光点当中，含了几个cluster 的那些点， 给去掉。 只剩下那些纯粹的单克隆的read ， 作为合格的数据，提交给客户。我们平时说“ PF 率” ， 指的就是

28、Pass Filter 的 Reads 数， 占总的、 测到的 Reads数的比例。PF 率可以从一个侧面反映测序的质量。一般来说，如果上样密度过高，PF 率就可能会下降。Quality Score ， Q 值一个碱基的Quality Score ，也就是这个碱基的质量分数（Q 值）。这个是通过这个碱基被误判的可能性，换算出以10 为底的对数，再乘以“-10 ”得到的这样一个数字。这个 Q 值，有点象我们说黄金的纯度，我们说“三九金”，或者说“四九金”，就是指 99.9%的纯度的金子，或者是99.99% 的纯度的金子。我们平时说Q30 ，就是指一个碱基的可靠性达到99.9% 。或者说，它的出错

29、的可能性小于千分之一。同样道理，我们说Q40 ，就是指一个碱基的可靠性是99.99% 。或者说，它的出错的可能性是万分之一。那么， 我们经常说Q30 比例， 所谓的 “ Q30 比例” ， 就是在全部PF 数据当中，达到、或者超过Q30 质量标准以上的数据，占所有PF 数据的比例，叫Q30 比例。Q30 比例，可以表征一个测序过程的质量的好坏。一个碱基的质量分数，不是以数字方式，直接记录到最后的Fastq 文件的。而是把它的Q 值，加上33，再用 ASCII 码表转换成一个字母，把这个字母录入Fastq 文件。这样做，有2 个好处。如果我记2 位数字，那么就占2 个字节，现在用一个字母来记录，

30、只占一个字节。那（数据存储）空间就节省了很多。第二个好处，用ASCII 码字母表，一个碱基，只对应一个字母；如果是用2 位数字来记录，就有可能发生移码错误。而用ASCII 码，一个字母来记录，就不太容易发生移码错误。Fastq 文件在软件做完上述所有的数据处理之后，就会生成一个Fastq 文件。Fastq 文件里，主要包含了3 部分内容。第一个部分，是每个Read 的目录信息。也就是这个Read 来自于哪台HiSeq 、第几个 run 、第几个Lane、和第几个Tile，以及在这个Tile 的 X、 Y的什么位置。接下来，就是所测到的碱基的序列。最后，是这些碱基序列对应的质量分数信息。这个，就

31、是Fastq 文件。到 Fastq 文件之后，测序仪所要完成的工作，就完全完成了。Pacbio 是目前读长最长的测序技术公司。它的读长，最长可以达到2 万到 3 万个碱基，平均可以达到8 千多个碱基。相比于llumina 和 Ion Torrent 的几百个碱基的读长来说，有着明显的优势。PacBio 测序过程PacBio 的测序原理，和别的高通量测序的原理，基本上也是一样的。也是边合成，边测序。首先， 这个聚合酶是固定在测序小孔的玻璃底板上。这个聚合酶又和DNA 模板、测序引物是结合在一起的。然后加入带4 色荧光的dNTP 底物，这些dNTP 都在其磷酸基团上被标上了荧光基团，四种碱基、各标

32、一种颜色。当一种与聚合酶正要合成的碱基一致的dNTP 被酶抓住的时候，酶就会长时间地抓住这个dNTP, 不让这个dNTP 漂走。这时侯，激发光从小孔的底部照进来，打在这个被抓住的dNTP 上，就会在较长时间内发出荧光。仪器根据所拍到的荧光的颜色，就可以来判断，这个碱基是哪种碱基。一个循环的聚合反应发生完毕之后，焦磷酸基团就从原来的dNTP 上掉下来，因为荧光基团是连到这个焦磷酸上的，所以这个荧光基团也就一起掉下来了，在溶液中就会漂走。接下来，进行第二、第三个循环，一直进行下去。一张芯片上有几万个孔，同时进行测序，这样一次就可以得到几亿个碱基的序列。接下来，分几个要点，来说明这个测序的过程。化学

33、方法和 Illumina 一样， PacBio 也采用了4 色荧光基团来标记dNTP ，但是 PacBio的标记和Illumina 的标记有所不同，PacBio 的荧光基团直接是标在dNTP 的3端的磷酸基团的末端的。这样标记的好处是：当一个聚合反应的循环完成的时侯，dNTP 上的那两个磷酸基团就掉下，连在这个磷酸基团上的荧光基团也随一块儿掉下来。它掉下来之后，就在溶液中漂走，不会影响接下来的测序过程了。测序微孔然后，我们说一下这个测序小孔的设计。这个测序小孔叫Zero ModelWaveguide ，简称 ZMW 。小孔的直径很小，光只能在小孔中传输很短的距离。这个特点对PacBio 的测序

34、很重要。因为酶是被固定在玻璃底板上的，所以，只有互补的dNTP 被酶抓到的时侯，这个dNTP 才会较长时间地停留在离玻璃底板很近的位置。也只有这样，才会被激发光照到，并且发出它的荧光。PacBio 的光学设计中，入射光是几百纳米波长的可见光,光从小孔的底部的玻璃处照到小孔中来。这个，只有70 纳米。其它游离的dNTP ，只会非常短暂地进入小孔，又很快漂走。所以，这些游离dNTP 带来的的噪音（信号），就被抑制在很低的水平。哑铃状的文库接下来，我们说一下PacBio 的建库。 PacBio 的建库是比较特别的。它的库是在 DNA 片段的两段各接一下发夹型的接头。接好了发夹形的接头之后，形成的文库

35、是一个哑铃形的文库。这种哑铃形状的文库有个好处，那它整个分子实际上是一个圆环。在测序的过程PacBio 的长读长的优势是很有益处单分子测序接下来，我们说一下PacBio 它测序长度优势的来源。这个来源，是因为它测的是个单个分子。相比之下，Illumina 或者 Ion Torrent 测的都是一簇分子。或者说它们测的都是一大堆分子。当它测一大堆分子的时侯，每个循环，多多少少，总有一些分子落后；也多多少少，有些分子超前。这些落后、或者超前的分子，在每个循环里面就会给出噪音。而且，随着循环次数越来越多，落后、和超前的分子也会越来越多，达到一定程度的时侯，噪音就会很大，大到会掩盖掉信号。当噪音大到掩

36、盖掉信号的时侯，实际上测序就测不准了。相比之下，PacBio 它只有一个分子，所以，它不存在同步问题。这就让它可以测到几千、基至上万个BP 都可以达成。碱基判读准确率：87.5%接下来，我们要说一下PacBio 测序的缺点。最大的缺点是对碱基的判读不准。它的错误率是12.5% 。也就是说，它每读8个碱基，就有一个是读错的。那么它主要的错误类型是插入 。也就是说，它会多读一个碱基。好在，它的这种错误是随机的。也就是说，你在这个地方再读一遍，它不一定会发生同样的错误。那么，对于同一个序列，多测几遍之后，这些偶然误差，可以被校正过来。读长限制因素接下来，我们说一下限制PacBio 读长的因素。第一个

37、因素，就是DNA 链上出现了缺口。测序过程中是用激光照射来发出荧光的，所以当强光长时间照射DNA 链的时侯，DNA 链就有可能被照断掉，出现缺口。当酶读到这个缺口的时侯，酶就从模板链上掉下来。这时侯，测序就终止了。这是第一种可能。第二种可能，是光线照射情况下，酶有可能会变性，当酶发生了变性之后，失去了聚合酶的功能，这时侯，测序也会终止。第三个限制因素，是文库本身的长度。因为要做片段长度大于2030K 的文库，是有相当大的困难的，所以， 文库本身的质量，在一定程度上，也限制了PacBio的读长。数据通量在高通量测序当中，测序的通量，是一个很重要的技术指标。那PacBio 大根一张芯片一次可以测到0.30.4G 的数据。在PacBio 测序中，芯片上的小孔数是第一个绝对的、限制性的因素。目前的芯片，是有15 万个小孔。但这 15 万个小孔中，并不是每一个都