病理HE制片中易出现问题的解决方略

1、病理HE制片中易出现问题的解决方略发表时间：2011-7-1516:40:24来源：创新医学网医学编辑部高静娜，王银萍，郑彦（吉林大学白求恩第一医院病理诊断中心，吉林长春130021）胃关键词病理制片;切片;染色病理检查已大量应用于临床工作及科学研究中。病理学技术是病理学的重要组成部分，病理制片的质量直接影响着病理诊断的准确性1。在病理诊断中HE切片是最基础也是最重要的。同一组织优劣不同的切片，镜下形态却是千差万别，甚至会出现相对立的图像。所以高质量的HE切片是病理技术员一直以来的追求，是做特殊染色、免疫组化等其他工作的前提条件，是病理医生对疾病做出准确病理诊断的必要条件2。为病理诊断提供优质

2、的切片并非一日之功，需要技术人员在日常的工作中不断积累熟练的技巧和实践的经验。为了确保病理诊断的正确率，下面探讨一下病理HE制片中易出现的问题及解决方略。1石蜡切片中易出现的问题及解决方略'1.1切片脱落和部分脱落是最常见的问题這1.1.1原因：组织中富含血液成分，如脾、肺、肝、宫内膜组织、异位妊娠破裂组织、凝血等;组织中富含脂肪成分，如脂肪组织、畸胎瘤、皮脂腺囊肿等;组织中富含胶质成分，如甲状腺组织等。组织较硬，如干涸、坏死或骨组织等均易脱片而导致无法诊断。组织取材太大太厚，组织脱水透明不彻底，组织与石蜡不能很好的结合，切片时组织中间有'白心”，不能切出薄而平的切片，勉强切出

3、的切片厚且经脱蜡、脱水、染色等步骤后容易脱片。脱水过程中无水乙醇和二甲苯时间过长。浸蜡的温度太低，石蜡不能完全溶解而影响石蜡的浸入;浸蜡时间过长、温度过高或石蜡长时间未更换，二甲苯含量增加等因素引起组织收缩过大、变脆变硬，易引起脱片。切片刀钝时，切片厚;切片刀有缺口时，易造成切片断裂破碎和不完整。展片水温低、切片褶皱未能充分伸展等原因造成与载玻片附贴不牢，或附贴时切片下气泡过多，切片石蜡未完全干燥就烘片均易造成组织脱落。烤片温度过低、烤片时间过短或温度高、时间长。载玻片不清洁。水洗时水流速度过快或水直接冲洗在切片上以及振荡剧烈。B11总染液的酸碱度不适宜，盐酸酒精或氨水浓度过大或停留时间较久等

4、引起组织脱落。這1.1.2处理：捞取含血成分多、脂肪多、胶质多的组织、骨组织以及较厚的切片时，可先在干净的载玻片上涂少许蛋白甘油再贴片。取材不能太大太厚，一般1.5cmx1.5cmx（0.20.3）cm为宜。脱水机内的脱水、透明液必须保持一定浓度。脱水机液体的更换视标本量的大小而定。在切片时应及时更换锋利的切片刀。展片温度要适宜，一般要低于石蜡熔点48°C。贴片时可在展片水浴中加适量乙醇，有助于组织展开，减少褶皱产生。烤片温度一般要高于石蜡熔点的1520C，时间3060min。染色时水流不能过急过大，要轻微振荡，不能过于剧烈。切片不能直接放于水流下冲洗。脱石蜡的各级乙醇以及脱水的各级

5、乙醇浓度要梯度递减或递增。染液及分化液酸碱度要适宜。善1.2切片不完整：切面为组织最大面的一部分。原因：组织包埋时，组织块平面与包埋盒底面呈一定角度。处理：切片时调节组织块夹头的角度，深切即可解决，或重新包埋组织，将组织面压平，再次切片。切片中间小孔密布（图1）。原因：修组织块时没有将切面修平。处理：粗修时进刀不能过快，然后细修，将组织面修平后再切片。善1.3切片薄厚不均（图2）：原因：切片机使用过程中发生磨损或故障。组织块夹头或刀架的固定螺丝未拧紧，导致切片刀和组织块未固定牢固。处理：查明磨损或故障原因后进行修理。切片前检查切片机的各有关螺旋是否旋紧，检查切片刀和组织块、石蜡和包埋盒是否固定

6、良好。潘1.4切片中细胞挤压：镜下细胞核呈狭长细丝状，深染，细胞浆不明显，细胞无完整结构，这种情况多见于细小活检组织、多次切片后仍如此。原因：医师取材时，组织受镊子等器械的机械性挤压造成的。处理：病理医师在取材时对于细小组织切忌挤压，对于大块组织应使用锋利刀具，下刀轻快，一次切成，不可拉锯样取材和强力挤压，避免使用有齿镊。這1.5切片压缩引起皱褶：原因：切片刀不够锋利，切片易压缩、皱褶，切片时切片刀角度过大，使切片蜷缩，展片时不易展平，造成皱褶;展片动作较慢，造成可展开的皱褶成为“死褶”（图3）;石蜡熔点低，室温高;由于组织本身层次较多，各层致密度不同，如皮肤组织、食管、胃、肠、胆囊、阑尾经固

7、定、脱水、浸蜡后各层收缩不一致，尤其是横断面取材，切片时易出现皱褶。处理：更换锋利刀片;调整刀的角度;切片时同时用毛笔卷片，由于外力牵引褶皱可改善;展片时水浴锅的温度要求在4050°C左右，必要时在展片水浴中加适量乙醇，有助组织展开，减少皱褶产生;降低蜡块温度，更换高熔点石蜡重新包埋。切片时组织质地较硬的部分朝上，如皮肤组织表皮朝上，消化道黏膜带肌组织要肌层朝上。怎1.6组织破碎松散（图4）：原因：展片温度过高;二甲苯透明的组织容易发脆发硬，对于含胶原丰富的组织脆硬较明显，切片时组织易出现破碎松散;脂肪组织及含脂肪丰富的组织因脱脂不净，浸蜡困难，切片时常产生破碎;含手术丝线等异物的组

8、织也会出现切片时组织分散、破碎的现象。处理：展片时应调整温度，不可过高，避免弥散;建议改二甲苯透明剂为硬脂酸石蜡混合液，组织经此液处理后软硬度适中，易于切出完整切片;对于脂肪组织及含脂肪丰富的组织可适当的延长脱水及透明时间;取材时尽量除去线头等异物，以利切片。善1.7切片污染左1.7.1组织污染：镜下见不同的组织混在了一起，而且没有移行连续性。若重新制片没有此现象，且污染的组织在蜡块中没有对应位置，则说明是捞片时水面不够洁净产生的污染，需重新切片。若重新制片仍有此现象，且污染组织在蜡块中找到对应的位置，则是由于在取材时切板不够洁净所致或包埋时产生的污染。这提醒我们在病理制片的每一个环节都要防止

9、污染，切片时及时清除水浴锅水面上的污染物。取材时每切一例标本，要注意刀、剪、镊子及切板的清洁。总之，在整个制片过程中，应避免将一种组织混入到另一种组织中去，以免造成不应有的差错甚至事故。1.7.2染液污染：染液中的色素颗粒及试剂的沉渣或污物，在染色时均可致切片被污染oHarris苏木精常在液面形成一层氧化膜而污染切片。镜下可见一处或多处出现棕褐色或乌蓝色不规则的污斑。为了预防这种情况，定期用滤纸过滤陈旧性苏木精染液，苏木精染色前注意去除其表面上形成的氧化膜或用不易产生氧化的Gill苏木精染液代替。這以上是在石蜡切片时常出现的问题。在每一例切片染色完成以后，技术人员都应与相应的蜡块进行比对，如果

10、出现差异，就应找出原因，必要时重新切片，这样才能保证切片中的组织和蜡块中组织的一致性。童憲2冷冻切片中易出现的问题及解决方略左冷冻切片是一种在低温的条件下，使组织迅速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。冷冻切片技术主要用于手术中快速病理诊断，其重要性和责任性都很大。影响冷冻切片质量的因素有很多，归结起来有以下几个方面：善2.1切片不完整：原因：组织内含过多的脂肪或坏死组织;组织块冷冻过度易致切片破碎或成粉末状，不能制作一张完整的切片;冷冻头的温度不足，组织会很快变软，也不能保证切片的完整性;组织块过大，不能切全。处理：应注意避免组织内含过多的脂肪（脂肪组织除外）及坏死组织;组织大小要适中

11、。一般情况下，制作冷冻切片的组织大小为施1cmx三1cmx0.3cm;根据组织块的大小、性质，确定冷冻时间。一般认为组织块较大或脂肪组织，冷冻时间可适当长些，甲状腺及脑组织和淋巴结等组织冷冻时间相对短些。每次做完冷冻切片应关好冷冻箱的盖子，以保持冷冻箱温度的恒定。憩2.2切片皱缩或卷曲：原因：切片刀钝;防卷板黏有异物，切片时组织会挤压在一起;防卷板与刀锋的位置不平行、不协调。处理：及时更换刀片;每做一例冷冻切片，均应将刀口和防卷板擦拭干净，保持防卷板的清洁;调整刀与防卷板的位置，保持两者平行，且防卷板比刀锋前0.2mm左右。用2.3切片脱落：原因：组织内含过多的坏死成分，组织细胞坏死崩解后局部

12、的渗透压升高吸收水分，切片一经固定，水分逸出，坏死组织失去支撑作用，染色时易脱离;固定液浓度过低水分大;载玻片不干净;切片太厚;染色时水流过急，冲坏组织完整性甚至脱落。处理：避免组织内带有坏死组织;选择最佳固定剂-AAF固定液（由乙醇、甲醛及醋酸组成），另外，及时将盛有固定液的瓶盖盖好，防止固定液的挥发而降低其浓度，定期更换固定液;保持载玻片干净;切片的厚度以5：7gm较为合适（脂肪组织可稍微厚些）切片尽量薄。:2.4“冰晶”现象：“冰晶”现象（图5）由于组织细胞在冷冻过程中，冷冻时间过长，蛋白质与水形成的胶体状态受到破坏，水从胶体状态的蛋白质中分离所造成。为防止这一现象的发生，应做到:送检标

13、本不要用生理盐水浸泡或用湿纱布包裹组织。要在取材时用纱布吸干组织上多余的水分;冷冻切片组织黏附剂的选择以不含水分的黏附剂为最佳;保持恒冷箱切片机箱内温度在-1820°C之间，组织固着器不要离开速冻台，充分利用恒冷箱切片机急冻装置使组织迅速达到比较低的温度。于组织固着器上挤上适量包埋剂，略凝固时放上组织，然后组织周边再覆上一层包埋剂，用悬空的冷冻锤压在组织上加速冷却。操作者的动作应迅速，动作越迅速，冰晶现象的发生越少。因为细胞内的冰晶与制冷的时间有密切关系，制冷的时间越长，细胞的形成改变越大。3HE染色中易出现问题的解决方略誉3.1切片染色不均：原因：组织取材过大或过厚，组织固定不完全

14、，染色后，出现切片外周固定好的部位，细胞着色清晰，但中间或未固定好的组织，细胞着色模糊，从而造成染色不均；切片薄厚不均或有横纹的（图6），引起染色不均;组织切片脱蜡不彻底（图7）。如二甲苯及乙醇不纯或使用时间过久，或室温低时，组织切片上的石蜡没有全部除掉时，含蜡部分不着色或着色较浅，而无蜡部分着色较深;染液或试剂量少，组织切片没被全部浸染到，亦可出现染色不均;分化液浓度过大，分化力过强，分化后没有迅速入水终止分化，亦可造成染色过淡、过深或染色不均等现象;如果组织切片上有气泡（图8）,在染色或分化时，则气泡内的组织可能染不上色或分化不到，以致镜下出现染色不均的现象。处理：取材要规范，一般1.5c

15、mxl.5cmx（0.20.3）cm为宜；切片薄厚一致;烤片要充分，组织周围的石蜡要完全熔化，及时更换脱蜡用二甲苯及乙醇，保证脱蜡彻底;保证染液及试剂量充足，组织切片要全部浸染到;分化液浓度要适当，并控制好分化时间。贴片前及时除去组织上的气泡。'3.2切片染色模糊不清（灰染）：原因：在取材时组织标本已经发生自溶或取材后没能及时固定或固定液浓度不够，必然造成组织结构模糊不清。另外，固定前已干枯的标本，切片经染色后，在干枯区域内出现成片的灰染现象;固定是制作生物组织标本的关键，组织固定不良是造成切片染色模糊不清的主要原因。固定液浓度不宜过高或过低。如用酒精固定的标本，切片核染色不良，胞浆染

16、色也较差，切片出现模糊不清现象。淋巴组织由于其细胞密集、结构复杂，导致固定液较难渗透到组织深部，从而造成组织中央固定不佳，结果染色不良，而出现切片发灰现象。组织浸蜡、包埋时如果温度过高或切片后烤片温度过高，均会使组织蛋白质发生质变，对染料可能发生拒染，造成切片染色模糊不清。切片脱蜡不彻底，造成染不上色或着色很淡，镜检时切片呈现模糊不清。染料质量差或染液配制失当，导致切片着色不良，切片模糊不清。分化过度，胞核、胞浆着色较淡，致切片模糊难辨。染色后脱水、透明不彻底。封片时因呼出的气体中含有水分，致使切片呈云雾状甚至模糊不清。处理：组织离体后，首先采用10%中性福尔马林固定组织，固定液量应为被固定标本体积的510倍。病理医师取材后也应放入10%中性福尔马林液中，不要让取好的组织晾干，以免影响制片质量。最后在脱水机中固定，脱水机中第一缸为10%中性福尔马林液，这是一次补充固定。控制好浸蜡、包埋及烤片等各环节的温度。脱蜡要彻底。保证染料的质量及染液的配制，控制好染色及分化的时间。染色后脱水、透明要彻底，及时更换液体。封片时，要注意避免口、鼻呼出的气体接触组织切片上的封固剂，同理，在潮湿（阴雨天）的环境里封片动作必须迅速敏捷，以避免