华大基因讲座

1、基于新一代测序技术的基于新一代测序技术的基因组学研究和系统基因组学研究和系统育种策略育种策略许姣卉 博士华大基因研究院 科研合作总监技术是科学发现与产业发展的源动力技术是科学发现与产业发展的源动力1950196019701980199020002010测序技术的跨跃式发展进程测序技术的跨跃式发展进程 Discovery of DNA structure(1953)Development of Sanger Sequencing(1977)Invention of Automated FluorescentSequencer(1985)Invention of CapillarySequence

2、r(1996)Invention of Applied BiosystemsSolid System(2007)Invention of Illumina Genome Analyzer System(2006)Invention of 454 GS 20 Sequencer(2005)Illumina Solexa FlowcellFlowcellA flowcell contains eight lanes Lane 1Lane 8Each lane contains multiple tiles total 100Each tile is imaged four times per cy

3、cle one image per baseImage from 1 tile焦磷酸测序焦磷酸测序边合成边测序边合成边测序边连接边测序边连接边测序1999200020012001200220082010CPU速度（每秒）十亿次百亿次千亿次千亿次七千亿次十万亿次存储能力8G1T3T10T30T670T1P百万亿次日新月异的生物信息日新月异的生物信息技术技术 碱基产量和测序成本反向曲线碱基产量和测序成本反向曲线项目项目基因组大小基因组大小 花费时间花费时间 总体费用总体费用 单碱基费用单碱基费用 测序策略测序策略测序技术测序技术人类基因组3G10年30亿美元1美元BTBSanger水稻基因组400

4、M2年4000万RMB0.1元RMBWGSSanger家蚕基因组400M2年4000万RMB0.1元RMBWGSSanger黄瓜基因组360M18个月1500万RMB 0.04元RMBWGSSolexa+Sanger藻苔基因组900M6个月1800万RMB 0.02元RMBWGSSolexa+Sanger测序时间、费用的变化测序时间、费用的变化NCBI数据的变化新一代测序技术正在形成新的产业革命新一代测序技术正在形成新的产业革命传统分子育种的两条思路传统分子育种的两条思路种质资源基因工程育种分子标记辅助育种寻找分子标记寻找功能基因新的系统育种策略新的系统育种策略种质资源重测序种质资源重测序数字

5、表达谱数字表达谱比较基因组学比较基因组学连锁不平衡做图连锁不平衡做图连锁分析连锁分析突变体库突变体库遗传转化遗传转化核心核心gene set100-1000基因组测序基因组测序新品种新品种种质资源种质资源Gene Test Kits选择效率 1000 x育种时间 1/2-1/3 Traditional finding method The method on re-sequencing部分案例中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural SciencesWork Plan151

6、 全基因组从头测序的应用全基因组从头测序的应用How? BAC to BAC WGS组装质量组装质量? 测序序列长度测序序列长度 构建片段长度构建片段长度 测序深度测序深度三个阶段三个阶段 基因组调查基因组调查 (repeats, GC%, gene distributions) 框架图框架图 (contig 5kb, scaffold 20Kb, single base error rate 20Kb, scaffold 300Kb,single base error rate 1 Kb)De NovoRNA-seq 快速获得参考基因库快速获得参考基因库Example IIInsect Ge

7、nome Size 16G or 6G without ReferenceSequence Data: 10G raw dataAssembly Results:More than 15,000 Scaffolds (L1k) ( more than 15,000 genes identified)De Novo更多深层次的应用领域更多深层次的应用领域转录本结构研究转录本结构研究 UTR鉴定；Intron边界鉴定；可变剪接研究；Start codon鉴定；RNA编辑研究；基因融合的发现等；非编码区域研究非编码区域研究基因转录水平研究基因转录水平研究 基因表达差异；进化分析等全新转录区域研究全新

8、转录区域研究In referenceExample IRice TranscriptomeGenome Size 400 Mb with ReferenceData：10Gb/sample（two samples）Result:For 27,655 high covered genes, 8923 genes re-defined , include 11,208 new exons,9,784 introns and 3,186 exon skipping events.A schematic representation of cancer-specific alternative gen

9、e splicing. PLoS ONE. 2009; 4(3): e4732. 应用举例应用举例Transcriptome size estimation on rice4 数字表达谱（数字表达谱（DGE）用测序取代芯片的技术革命用测序取代芯片的技术革命基因表达研究进入数字时代基因表达研究进入数字时代mRNA产生标签产生标签CATGGCTGAAGTCAAGGATGTCATGGAAGGCAATCCCACATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGGTTGAATCTGAAACCCTCATGGTTGAATCTGAAACCCTCATGGCTGAA

10、TCTGAGGCTCTCATGGCTGAATCTGAGGCTCTCATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGCTGAAGTCAAGGATGTCATGGCTGAAGTCAAGGATGT测序测序CATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGGTTGAATCTGAAACCCT CATGGTTGAATCTGAAACCCTCATGGAAGGCA

11、ATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATA表达量检测表达量检测geneAgeneBgeneCgeneD4280geneAgeneBgeneCgeneD比对比对DGE的基本原理的基本原理通量高通量高1 1次实验即可得到足够数据次实验即可得到足够数据Total Tag Number% of genes identified2M4M

12、6M8M0100604080020基本特点数字信号数字信号CATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGGTTGAATCTGAAACCCT CATGGTTGAATCTGAAACCCTCATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCAC

13、ATACATGGAAGGCAATCCCACATA428Tags表达量表达量可重复性高可重复性高Gene Expression (vec_2)020000400006000080000600004000080000200000Gene Expression (vec_1)Spearman r=0.99 pearson r=1100000100000基本特点测量准确度高测量准确度高Solexa analysisReal time qPCR analysis独特优势检测低丰度基因检测低丰度基因t Hoen, P.A.C. et al. Nucl. Acids Res. 2008.36:e141Med

14、ian expression levelOnly detectedby DGEDetected byDGE and array低丰度基因具有重要生物学功能低丰度基因具有重要生物学功能独特优势检测新转录本检测新转录本100K200K300K400K500K600K700KChromosome 9独特优势检测反义链转录本检测反义链转录本人人小鼠小鼠sense-antisenseonly sensesense-antisenseonly sense独特优势 特特 点点数字表达数字表达谱谱芯芯 片片数字化信号数字化信号高通量高通量可重复性可重复性检测检测低丰度基因低丰度基因检测检测新新转录转录本本检测

15、检测反反义链转录义链转录本本实时实时更新性更新性数字表达谱与芯片的比较数字表达谱与芯片的比较分析内容分析内容差异表达基因筛选差异表达基因筛选PathwayPathway显著性富集分析显著性富集分析Clean TagClean Tag数据数据GOGO功能显著性富集分析功能显著性富集分析测序饱和度分析测序饱和度分析表达模式聚类分析表达模式聚类分析基因注释、标准化基因注释、标准化反义链的转录分析反义链的转录分析原始序列数据原始序列数据共有、特有共有、特有TagTag分析分析表达量及分布分析表达量及分布分析实验重复性分析实验重复性分析新转录本检测新转录本检测蛋白互作网络分析蛋白互作网络分析表达模式聚类

16、分析表达模式聚类分析相互作用网络分析相互作用网络分析Pathway分析分析GO功能分析功能分析应用DGE发表的部分文章l The digital generation. Nature, 2009, March, Vol 458: 239-240. l Morrissy AS, et al. Next-generation tag sequencing for cancer gene expression profiling. Genome Res. 2009 July, Vol.19, No. 8.l Hegeds Z, et al. Deep sequencing of the zebraf

17、ish transcriptome response to mycobacterium infection. Mol Immunol, 2009 September, Vol.46, No. 15: 2918-30.l Peter A. C. t Hoen et al. Deep sequencing-based expression analysis shows major advances in robustness, resolution and inter-lab portability over five microarray platforms. Nucleic Acids Res

18、earch, 2008, October, Vol. 36, No. 21.我们已完成的DGE项目5 小RNA测序分析三种主要的小分子RNASmall RNA: a hotpotPublication: ( 1991 May 1st, 2008)siRNA : 15,842 miRNA: 2,641技术路线De Novo In reference分析内容sRNA 与参考序列比与参考序列比对对sRNA 与与rRNAetc 的比的比对对 包括rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA 等non-coding RNAsRNA 与与repeat 的比的比较较 sRNA 与与mRNA/exon/intron 的比的比较较预测预测新的新的miRNAmiRNA差异表达分析差异表达分析 靶基因靶基因预测预测成功案例Analyze expression profile of paralleled samplesIdentify miRNA marker in the diagnosis of some diseaseSample 1(case)Sample 2(control)Sample Solexa SequencingmiRNA expression profile in different samples元基因组研究（元基因组研究（Metagenomics）www.icugi.o