食品微生物检测质量控制

1、1、ISO/IEC 17025:2005(GB/T 27025-2008) 检测和校准实验室能力的通用要求2、实验室资质认定评审准则3、GB/T 27405 实验室质量控制规范-食品 微生物检验4、GB 4789.1-2010 食品安全国家标准 食 品微生物学检验5、卫监督发201029号附件2食品检验工作规范6、相关标准、规范、管理规定vGB/T27405 实验室资质认定评审准则v4.1组织 4.1 组织v4.2管理体系 4.2 管理体系v4.3文件控制 4.3 文件控制v4.4 质量及技术记录 4.9 记录v4.5 服务客户v4.6 投诉处理 4.7 申诉和投诉v4.7 不符合工作控制 4

2、.8 纠正措施、预防措施及改进v4.8 纠正措施 v4.9 预防措施 v4.10 内部审核 4.10内部审核v4.11 管理评审 4.11管理评审v4.12 持续改进 vGB/T 27405 实验室资质认定评审准则v5.1 人员 5.1 人员v5.2 设施和环境条件 5.2 设施和环境条件v5.3 设备 5.4 设备和标准物质v5.4 试剂和培养基 4.5 服务和供应品的采购v5.5 标准物质和标准培养物 5.5 量值溯源 在实验室中,仪器设备和消耗性材料的采购、样品和仪器设备的运输、仪器设备的校准提供、标准物质和参考物质的提供、培训提供属支持服务工作。v GB/T 27405 资质认定评审准

3、则v6.1 合同评审 4.6 合同评审v6.2 分包 4.4 检测和/或校准分包v6.3 检测方法的确认和验证 5.3 检测和校准方法v6.4 测量不确定度 v6.5 取样 5.6 抽样和样品处置 v6.6 样品处置和确认 5.6 抽样和样品处置 v6.7 污染废物的处理 5.2设施和环境条件v6.8 检测报告 5.8 结果报告1、合同评审记录：检验申请表、委托书，与客户 进行讨论的有关记录。2、所有分包方的注册资料，及其符合性证明。3、服务和供应品采购的符合性检查活动记录。4、供应商评价的记录和合格供应商名录。5、投诉及其调查、纠正措施记录。6、审核发现及纠正措施、跟踪验证及有效性评价 记录

4、。7、质量监督记录。8、预防措施记录。常用的质量记录与技术记录常用的质量记录与技术记录9、管理评审发现及纠正措施、跟踪验证记录。10、人员授权、能力、教育、专业资格、培训、 技能和经验记录。11、环境条件的监测、控制记录。12、方法确认结果记录。13、对检测具有重要影响的设备及其软件的记录，包括检定、校准、维护、保养、维修记录。14、客户对抽样有偏离、添加或删节的要求记录及采样记录。常用的质量记录与技术记录常用的质量记录与技术记录15、样品接收记录（样品有关传递信息、状态等）。16、检验结果和报告。17、原始工作记录，仪器打印出的结果，试验数据统计记录。18、试验计划，包括指令性工作计划。19

5、、内部质量控制计划及其实施记录。20、能力验证或实验室间的比对计划及实施记录。 21、差错或事故记录及应对措施。常用的质量记录与技术记录常用的质量记录与技术记录v质量手册、程序文件、作业指导书、记录表格v写你所做的，做你所写的，记你所做的v质量手册 是规定实验室管理体系的文件。要求能覆盖认可准则相关内容。v程序文件、作业指导书 目的（为什么做）？ 做什么？ 由谁做？ 何时、何地、如何做？ 应使用什么材料、设备、文件？ 如何对活动进行控制和记录？ 目的：防止误用无效和/或作废的文件。 哪些是应该控制的文件？ 1、实验室内部制订的文件：质量手册、检 测和/或校准计划、程序文件、作业指导书、记录、表

6、格。 2、外部文件：法律、法规、规章、标准、规范、检测和/或校准方法、图样、软件、参考数据手册。问题： 1、放置于设备旁的操作规程 2、张贴于墙上的管理制度 3、原始记录及检验报告 4、体系文件有修改，但持有人手上 文件未及时更新 GB/T 27405 技术要求及过程要求实际上也是GB/T 27025-2008（等同ISO/IEC 17025：2005）技术要素，构成了实验室内部质量控制要素，由实验室根据自身的实际情况制定并实施的，它包括对环境设施、培养基、试剂、仪器、方法（实验步骤）和实验人员的监控。室内质量控制是产生精确和可靠结果的基础和核心。v查什么？如何查？ 实验室认可准则在微生物检测

7、实验室中的应用说明CL09.doc 核查内容：影响实验室获得可靠检测结果各要素。 v（一）人员v（二）方法v（三）培养基、试剂的控制。v（四）仪器的控制。v（五）环境的控制。v（六）样品的管理v（七）标准培养物的保存与使用。v（八）检测结果的质量保证。v（九）相关记录。v培训及能力确认 专业知识 消毒知识 生物安全操作知识 质量控制相关知识 微生物常规仪器设备应用、清洁、维护的培训 通过内部质量控制、能力验证、室间质控考核、使用标准菌株加标检测等客观评估人员的能力。 在使用一种非经常使用方法或技术时，在检测前确认微生物检测人员的操作技能是非常有必要的。 培训应有计划并有评估。v实验室人员是否熟

8、悉生物检测安全操作知识和消毒知识？ v实验室是否对在培人员实施有效监督？ v实验室是否对新员工进行检测技能的培训？v 培训是否有计划并且对培训效果进行评估？（食品检验工作规范）v实验室是否对新员工的检测技能进行确认？ v常见问题1、不知道如何对人员进行有效监督 监督记录表.doc应安排对人的监督，重点是新上岗人员、易出问题的检验人员，监督员应考虑被监督人是谁？应该监督的项目、方法。2、培训没有计划性，没有进行培训效果评估。3、未对新员工的检测技能进行确认。4、压力容器操作人员无特殊压力容器操作上岗证。5、微生物上岗操作考核未考专业知识及生物安全操作知识。6、不能提供人员参加安全培训的证明材料。

9、 GB 4789.1 -2010规定：v应选择现行有效的国家标准方法。v食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定性检验方法时，应以常规培养方法为基准方法。v食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定量检验方法时，应以平板计数法为基准方法。v实验室在采用新的方法进行检测前，是否对方法进行验证并保留验证记录？v实验室是否有文件化的程序，规范实验室自制方法的制定并保留相关记录？ v常见问题： 标准更新不及时,作废标准未及时从工作场所撤出。 用筛选法代替传统方法进行病原菌检测 方法更新前未对方法进行验证，或是方法验证内容过于简单，未进行能力确认。 v环境要求 区域分隔,避

10、免交叉污染 标识 温度、湿度、噪声、照度、洁净度的控制。 样品检验的环境要求：洁净实验室或超净工作台，洁净室在使用前及使用后应进行消毒,并定期监测消毒效果。 病原微生物分离鉴定：生物安全二级实验室，应符合GB 19489的规定。生物安全实验室，容易发生污染的检测区域，证明已采取了清洁措施。 v问题v在洁净实验室缓冲间内设洗手池v培养间与洁净室连通v洁净室内放置生物安全柜v在超净工作台内在风机开启情况下进行霉菌计数，或是进行病原微生物操作。v未对紫外线灯进行监测及评价。v感染性废弃物与生活垃圾混放。v如何标识？ 人员控制标识、洁净区域标识、生物危害标识、污染警示标识v如何监测？ 洁净室：洁净度监

11、测（沉降菌、浮游菌、悬浮粒子。 生物安全实验室：生物安全柜做洁净度、风速、泄漏等监测。 v应制定合理的环境监测程序（），设定不同工作区域可接受的背景菌落总数，有文件化的程序处理菌落数超标情况。v如果实验室有使用紫外线灯,应有定期监测记录及结果评价记录。v对环境监测结果进行数据分析，对环境质量进行评价。v洁净室监测记录无检测依据、评价依据及结果评价，方法有曝皿5分钟、15分钟。 设备必须满足检验标准的要求 检定、校准、维护、保养、确认 标识：检定、校准合格标识、污染警示标识 监控记录及使用记录：对检测结果有影响的设备的监控、正确灭菌与否的监控。 实验室应对重要的检验设备（特别是自动化检验仪器）进

12、行核查。名称要求推荐频率参考玻璃温度计完全可追溯性重新核查单点（如零点）核查每五年一次每年一次工作温度计在零点和工作范围内用参考温度计核查每年一次天平完全可追溯性校准每年一次校准法码完全可追溯性校准每五年一次温控设备（培养箱、水浴箱）确定温度的稳定性和均匀性监测温度初次使用前，此后每两年一次和每次维修后每个工作日一次或每次使用前干热灭菌箱确定温度的稳定性和均匀性监测温度初次使用前，此后每两年一次和每次维修后每个工作日一次或每次使用前高压灭菌器确定运转的特性监测温度和时间初次使用前，此后每两年一次和每次维修后每次使用时生物安全柜确定性能微生物监测气流监测初次使用前，此后每年一次和每次维修后每两周

13、一次每次使用前无菌室和洁净室空气和表面微生物污染每两周一次v期间核查：仅针对设备的稳定性不好，及恶劣条件下使用的设备，核查后应进行评价。v应对设备的检测结果进行确认，确认设备是否符合检测工作需要。 可在检定周期表里增加使用要求、检定结果、结果确认等栏目。v修正因子的应用v去污染要求。v设备的维护维修应在设备的使用记录上体现。 v问题：v设备检定、校准后未进行结果确认，期间核查后未进行评价v设备检定、校准产生的修正因子未能正确应用。v可能受污染的设备未贴污染警示标识。v天平使用记录上称量的小数点位与天平精度不一致，或与标准方法要求的称样量不一致。v自动化微生物鉴定设备的核查未做或不充分。v检验用

14、品 储存环境应保持干燥和清洁 标识 适宜的消毒方法并记录：消毒与灭菌的方式、方法、时间、效果等。v问题：v灭菌物品无灭菌时间及有效期标识，甚至无标识。v废弃样品的处理制度（程序）及记录。v废弃物的处置要注意生物安全。v检出致病菌的样品要经过无害化处理。 样品运送：样品运输过程中要储存在28，而且要防止外部污染。所有样品24h内送达实验室。特殊情况下（必须长途运输），时间可延长到48h，前提是样品检测时不能超过其保质期。v样品在送达实验室立即分析或24h内分析，分析前应在包装标签说明的保存温度下进行保存。v如果标签说明未提到保存温度，采用81。v冷冻样品应在45 以下不超过15min或在2 5

15、不超过18 h解冻，若不能及时检验，应放于15 左右保存。v非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置2 5 冰箱保存，在24 h内检验。v样品接收：核查抽样者记录的样品信息； 如果可能，检查样品的外观性状是否有腐败变质。检查样品包装有否损坏；v样品制备 实验室操作人员要注意避免各阶段样品间的交叉污染和环境污染。如果分析过程出现了不可接受的偏差而终止分析，就要重新取样。v做好培养基质量控制，定期带标准菌株检测。v生化试验注意事项 （1）用API20E或VITEK-GNI+或其它肠杆菌科生化鉴定试剂盒，按照生产商提供的使用说明进行。 （2）进行生化试验时应是用新鲜培养物（24h）。

16、 （3）菌液的稀释应注意无菌操作，浊度应达到使用说明的要求。v应有程序管理。v标准培养物用于验收培养基、验证方法、评估人员能力、校验设备、评估实验操作。v来源：CMCC、ATCC，菌种收藏机构标准菌株。 标准菌株的商业派生菌株仅可用作工作菌株。 v实验室是否保存有满足试验需要的标准菌种或参照标本？ v标准菌种或标本是否是从认可的菌种或标本收集途径获得？ v实验室是否建立和保存其所有菌种、标本的收集、贮藏、保存、确认试验的记录？ v 实验室是否有文件化的程序管理参照菌种（从原始菌种到日常工作用菌）？ v参照菌种是否定期转种传代，并做确认试验，包括实验室中所需要的关键诊断指标？实验室是否加以记录并

17、予以保存？v每一支参照菌种是否都应以适当的标签、标记或其它标识方式来表示其名称、标准号、接种日期和所传代数？ v其管理记录中还应包括（但不限于）以下内容： 从原始菌种传代到工作用菌种的代数； 菌种生长的培养基及孵育条件； 菌种生存条件。 v实验室应保存能满足实验需要的标准或参考菌株，在购入和传代保藏过程中，应进行验证试验，并进行文件化管理。v标准菌株：至少定义到属或种水平的菌株，有明确的来源。v标准储备菌株：标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。v工作菌株：由标准储备菌株转接后获得的同种菌株。v一旦标准菌株被解冻，最好不要重新冷冻和再次使用。v所有标准培养物从储备菌株传代培养次数不得超过5次。

18、除非标准方法中要求并规定，或实验室能提供文件化证据证明其相关特性没有发生变化。v标准菌株如已老化、退化或变异、污染，经确认试验不符合的或该菌株已无使用需要的，应及时销毁。v问题：v不能提供来源证明。v不能提供对标准菌株传代及确认记录，或是传代记录信息不全。v不能提供标准菌株管理程序。 冻干菌种 转种活化，同时作生物学性状的鉴定-80冰箱保存的培养物 转种活化用于微生物质控的新鲜培养物v菌种活化常用培养基v普通细菌： 营养肉汤NBNB 胰蛋白胨大豆肉汤TSBTSB 脑心浸液培养基BHIBHI 胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤TSB-YETSB-YEv真菌：真菌培养基v乳酸菌：MRSMRS肉汤v嗜盐性弧菌：

19、含3%NaCl3%NaCl的TSBTSBv冻干菌株的开启v一、安瓶管开封 1用浸过75酒精的脱脂棉擦净安瓿管。 2用火焰将安瓿管顶端适度加热。 3滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃 开裂。 4用挫刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。v二、菌株恢复培养 1用无菌吸管，吸取0.30.5ml适宜的液体培养 基，滴人安瓿管内，轻轻振荡，使冻于菌体溶 解呈悬浮状。 2取0.10.2ml菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂 斜面平板培养基上，剩余的菌液，注入适宜 的液体培养基内，然后在建议的温度下培养。 菌种名称斜面/平板培养基液体培养基培养温度沙门氏菌BHABHI361阪琦肠杆菌BHABHI361单核细胞增生性李斯

20、特菌BHABHI361金黄色葡萄球菌BHABHI361大肠杆菌O157BHABHI361大肠杆菌BHABHI361藤黄微球菌营养琼脂营养肉汤361副溶血性弧菌含3% NaCl的BHA含3% NaCl的BHI361创伤弧菌含3% NaCl的BHA含3% NaCl的BHI361空肠弯曲菌哥伦比亚血平板布氏肉汤421v菌株保存：对于每个阳性样品，都应尽可能地保存检出的食源性致病菌分离株，用于进一步的药敏试验和分型研究。v应对从食品、环境或人体分离、纯化、鉴定的原始分离菌株（野生菌株）进行系统、完整的菌株信息记录，包括分离时间、来源，表型及分子鉴定的主要特征等。 包括质控菌株及分离已经鉴定的菌株 （1

21、）在相应的斜面或平板培养基上经2次纯化，保存于相应的液体培养基与甘油体积比为1：1 的菌种保存管中，置于-80 保存。 （2）冷冻干燥保存。v实验室是否建立和保持有效的适合试验范围的培养基（试剂）质量控制程序？v该程序包括对培养基（试剂）进行评估的方式和储存的规定、接受/拒收的标准等？v对自备的和商业提供的培养基（试剂）都需要评估？ v根据培养基（试剂）的性质和实验类型，对培养基（试剂）的可用性进行评估？ v关键培养基的评估，是否采取了技术性验收？ v食品检验工作规范第十五条：食品检验机构应当对影响检验结果的标准物质、试剂和消耗材料等供应品进行验收和记录，并定期对供应商进行评价，列出合格供应商

22、名单。v培养基（试剂）质量控制程序v关键培养基的技术性验收记录v培养基的配制记录。 v培养基的可用性评估记录。v质控菌株的选择 生化性状典型的强阳性质控菌株 生长相对较弱的阳性质控菌株 不具备目标菌典型反应特性的质控菌株 生长被抑制的阴性质控菌株v培养基的制备及质量控制 应有对试剂进行检查、接收（拒收）和贮存的程序。 对检验结果有重要影响的关键试剂应进行适用性验证。 试剂的管理控制应包括全部相关试剂、质控材料以及校准品的批号、实验室接收日期以及这些材料投入使用的日期。 确定和验证已制备的培养基在适的的贮存条件下的保存期限。v问题：v使用过了保质期的培养基v已配制的培养基上未标识保质期。v培养基

23、的验收记录没有验收依据，未记录试验观察现象。v已配制的培养基无标识。v培养基质量控制依据 ISO11133:2003 Part 1 SN/T1538.1-2005：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T1538.2-2007：培养基性能测试实用指南 WS/T232-2002：商业性微生物培养基质量检验规程培养基的配制 称量准确：严格按标签上的称量数称取，注意单 双料的变化 配制用水：电阻率在25300000 cm 重金属（镉、铬、铜、镍、铅等）0.05mg/L 重金属总量10mg/L 溶解充分：加水时避免干粉挂壁粘底，避免烧糊 分装合理：分装量不宜超过容器容积2/3，倾注 平皿（90mm）每皿

24、15mL-20mL 灭菌方式：根据培养基成分的不同，选择适宜的 灭菌方式，常用高压、煮沸、过滤v理化指标的质量控制 色泽：因品种而异，但同一品种批间差异不宜过 大。 水分含量：干粉培养基应控制在5%。 澄清度：除个别特殊品种含有不溶成分外，应澄 清，无絮状物，无沉淀。 pH值：指灭菌后冷却至25时的测定值，允许偏 差0.2。 凝胶强度: 固体培养基的凝胶强度。v微生物学指标的质量控制 常用质控方法及应用 灵敏度测定法基础型培养基 混合增菌培养法选择性增菌培养基 回收率测定法选择性分离培养基 生化鉴定方法鉴别培养基v（1）灵敏度测定法 例：脑心浸液肉汤培养基 质控菌株营养苛求菌 乙型溶血性链球菌

25、 短小芽孢杆菌 测定方法 制备108菌悬液，10倍梯度稀释至10-8。 选取适宜的34个连续稀释度，接种1mL于9mL待检测 培养基中，每个稀释度接种3管，3537培养3d。 接种管2/3生长的最高稀释度即为该培养基的灵敏度。（2）混合增菌培养法 例：SC肉汤 质控菌株：鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌 实验方法 （1）将沙门氏菌和大肠埃希氏菌的新鲜肉汤培养物按照1:99进行混合。 （2）接种于SC肉汤中，361培养18h-24h。 （3）将培养物适当稀释，取稀释液0.1mL涂布麦康凯琼脂。 结果：平板上应90%以上为沙门氏菌，而大肠埃希氏菌应10%。v（3）回收率测定法（Recovery Rat

26、e） 可从菌落数量上判断分离培养基对目标菌的选择效果，以及对非目标菌的抑制性 目标菌的回收率要求在70%以上,并具有典型菌落特征 非目标菌全部抑制或部分抑制v（3）回收率测定法（Recovery Rate）例：XLD培养基 质控菌株名称 菌号 菌落特征 粪链球菌 32221 抑制 金黄色葡萄球菌 26003 抑制 大肠埃希氏菌 44104 黄色菌落，有胆酸盐沉淀 鼠伤寒沙门氏菌 50115 红色菌落，有黑心 福氏志贺氏菌 51571 红色菌落v标准菌株名称 稀释度 XLDXLD菌落平均数量 NANA菌落平均数量回收率% % 鼠伤寒沙门氏菌 10-7 110 121 90.9 伤寒沙门氏菌 10-7 97 104 93.3 弗氏志贺氏菌 10-7 81 92 88.0 大肠埃希氏菌 10-7 135 144 93.8 金黄色葡萄球菌 10-4 0 108