[自然科学]分子克隆ppt课件

1、哺乳动物培养细胞的基因表达分析 本章所介绍的两种实验方法，通常用来测量哺乳动物基因的转录活性以及对它们在转染细胞中的表达的调节。 这里我们主要介绍两种实验方案。DNA酶足迹法对DNA上的蛋白质结合位点作图DNA结合蛋白的凝胶阻滞分析DNA酶足迹法对DNA上的蛋白质结合位点作图 本方案介绍在放射性标记的DNA片段上确定蛋白质结合位点的作图方法。使用DNA酶切割，而在替代方案中是用羟自由基断裂DNA。 原理 材料 方法 替代方案原理：DNA酶足迹法DNasefootprinting是一种可以直接看到蛋白质和特定DNA序列结合的方法。该法常与凝胶阻滞分析联用，鉴定结合在基因调控区序列上的核因子kB体

2、系主要涉及机体防御反响、组织损伤和应激、细胞分化和调亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递。转录因子结合DNA，保护某个DNA片段不被DNA酶核酸裂解活性的作用，就会形成DNA酶“足迹。通常试验中，在加或不参加核提取物的情况下用DNA酶分别对靶DNA片段进展切割，然后对所得图谱进展比较。在核提取物存在时，没发生酶切反响的地方，足迹会呈条带出现。DNA酶切割产物的电泳迁移率与同样的DNA片段所得到的序列梯带进展比较，就可确定足迹的位置，从而确定DNA结合蛋白的识别序列。详细方法是： 先将待测双链DNA 片段中一条单链的一端选择性地进展末端标记，参加假定的DNA结合蛋白孵育，然后参加恰当浓度的DNase

3、，使在DNA 链上随机形成缺口，经变性后电泳别离，放射自显影，即可形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA 条带。但当DNA 片段与相应的序列特异性DNA 结合蛋白结合后，DNA 结合蛋白可保护相应的DNA 序列不受DNase的攻击，因此在放射自显影图谱上，DNA梯度条带在相应于DNA结合蛋白的结合区域中断，从而形成一空白区域，恰似蛋白质在DNA上留下的足迹，因此被形象地称作足迹法。假如同时进展DNA 化学测序，即可判断出结合区的准确顺序。材料： 酶： DNA酶 缓冲液 凝胶：聚丙烯酰胺凝胶 核酸和寡聚核酸：为了减少蛋白与放射性标记的DNA片段的非特异性结合 放射性化合物： 32P末端标记的DNA

4、细胞和组织细胞匀浆缓冲液细胞重悬缓冲液细胞淋洗缓冲液方法： 1、制备核提取物从组织制备核提取物从培养细胞中制备核提取物从小量培养细胞中制备核提取物注：此方法适应于转染有质粒的细胞，这些质粒可以表达编码转录因子的cDNA 除了这些制备方法以外，纯化细胞方法得到的组分可以直接用于下一步实验。 2、在离心管中参加：核提取物或蛋白组分32P末端标记的DNA1mg/ml poly dI-dCH2O将这些按一定比例参加。 3、室温下参加50LMgCl2/CaCl2溶液并轻轻混匀。室温下放置1min,参加几微升稀释的DNA酶溶液，混匀。 4、参加75L终止液终止反响。摇匀后，用一样体积的酚/氯仿抽提反响液。

5、 5、把液相转移到新的离心管中，用两倍体积的乙醇沉淀核酸。 6、参加少量甲醛染液，剧烈震荡使DNA沉淀溶解。煮3min使DNA变性。 7、跑聚丙烯酰胺变性胶，注：在加样前进展至少30min的预电泳。 8、电泳完毕后，将胶真空枯燥一个小时，然后用X射线胶片曝光，需在-20度曝光几小时。以上方法是根本的实验方案，但根据每一个实验的不同，我们还可以对它进展一些优化。 优化方案：在反响混合物中单价阳离子浓度要小于200mmol/L,通常是在50mmol/L范围内。高浓度会抑制甚至会破坏蛋白和带负电的DNA之间的互相作用。DNA酶足迹分析的缓冲环境是由核提取物中的组分提供的，所以必要时可以改变缓冲环境中

6、的离子成分。对于每种DNA片段成分，Mg离子的最正确浓度都要确定。为了观察到足迹所需的蛋白抽提物的量要取决于该蛋白与DNA的亲和力。核提取物必须经过一次或屡次层析才可以在实验中观察到足迹。DNA酶的量在实验过程中是比较重要的，确切的浓度要依靠试验本身来确定。酶切反响与DNA酶的比活，DNA片段的纯度，以及所分析的DNA的序列都是有关系的注：对于每一个进展分析的DNA片段或组分，需要有两个对照反响。 一个对照反响不含核提取物，可以鉴别裸DNA片段中可以抵抗DNA酶的下滑或只被部分消化的区域；另一个不在第二步中参加DNA酶，这样可以发现内源的内切核酸酶。替代方案：羟自由基足迹法对DNA上的蛋白质结

7、合位点作图 DNA酶切割DNA并不是随机的，因此在足迹实验中，观测到的条带图谱并不代表探针中的每个磷酸二酯键切点。只要在DNA结合蛋白保护的序列里有一处以上发生了酶切，就可以推断该蛋白是有两部分组成的。但是，假如目的蛋白结合位点在两个DNA酶切点之间，该蛋白和DNA的互相作用就会发生漏掉，为了防止这些问题并使足迹法的分辨率进步到核苷酸程度，又引入了称为羟自由基足迹法的化学切割方法，依靠Fe催化O2或H2 O2 的复原反响产生羟自由基来切割DNA骨架。 这种方法很直接，化学试剂在本质上对所有的磷酸二酯键作同等切割，而且这些试剂对大多数缓冲液成分不起反响，本方法有时可以提供关于识别序列中蛋白质和个

8、别核苷酸相对亲和力的详细信息。 除此以外，传统的DNA酶足迹法程序复杂，并且要求目的蛋白经过一定程序的纯化，而固相DNA酶足迹法通过结合有模板的磁珠，先富集序列特异的DNA结合蛋白，进展DNA酶酶切，然后用测序胶别离并分析结果。DNA结合蛋白的凝胶阻滞分析 概述 实验原理 实验方法EMSA概述 凝胶阻滞试验是分析DNA结合蛋白的方法，本方法如今通常用于监测DNA或RNA结合蛋白的纯化;确定一种或可能的DNA结合蛋白所识别的序列;建立反响常数如亲和结合常数和开/关速率，以及研究蛋白一蛋白组装或多种蛋白在基因序列上的互相作用 20世纪70年代凝胶阻滞最初是hahlberg等和Shaup等作为分析核

9、糖体蛋白和核糖体RNA互相作用的技术。 20世纪80年代，用纯化了的原核调控蛋白与其DNA靶序列进展结合平衡和动力学的相关研究。 当发现非标记载体DNA抑制蛋白和放射性标记靶DNA的非特异结合后，凝胶阻滞才用于研究哺乳动物细胞粗裂解物等复杂混合物中序列特异的DNA结合蛋白。 序列特异的DNA结合蛋白这项技术如今已扩展到用于分析蛋白和异常构象的DNA形成的复合物，包括Holliday连接、错配碱基对和Z-DNA。但是，这种方法到目前为止仍然主要用于研究和分析反式作用蛋白和顺式DNA序列形成的调控真核和原核生物基因表达的复合物。原理 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探

10、针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，利用了电泳迁移率的差异别离复合物和非结合的探针。 DNA- 蛋白复合物或RNA-蛋白复合物比非结合的探针挪动得慢。凝胶像无水的笼子，阻止游离的组分向溶液中扩散这种笼子效应可以维持部分组分的高浓度，有效地驱使双分子重结合反响的平衡向右。同位素标记的探针根据研究的结合蛋白的不同，可以是双链或者是单链。 当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，根据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。 通常DNA片段用32 P进展放射性标记，而蛋白质不标记。DNA结合

11、蛋白后形成的复合物带有了蛋白质的电泳迁移特性。因为可以使用高比活性的DNA探针以及聚丙烯酰胺凝胶中有“锁定现象发生，所以本方法非常灵敏。发生锁定现象使有利于复合物的形成，所以甚至非常弱的结合作用也都能观测到。 DNA结合反响的蛋白特异性可以用竞争性分析实验来检验。 竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段特异，和其它非相关的片段非特异，来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，根据复合物的特点和强度来确定特异结合。 试验反响体系中参加放射性标记探针的同时参加过量的非放射性标记探针。通过参加合理量的非放射性标记探针进展竞争，可以完全使放射性标记

12、探针形成不了复合体，从而检验DNA结合的特异性。 凝胶迁移或电泳迁移率实验EMSA是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列互相作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的互相作用。 所需试剂： 凝胶迁移实验需要的结合蛋白，可来源于纯化或部分纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。 制备同位素标记的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探针用-32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记，同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。包括：标记特异性探针，非特异性竞争探针，未标记特异性竞争探针 与结合蛋白特异

13、性结合抗体，非特异性结合抗体。 凝胶 47%中性聚丙烯酞胺凝胶厚度成1. 5mm 实验步骤： 1核蛋白的提取用 细 胞 刮或胰酶消化细胞，将悬浮细胞移入1.5mlEP 管中。 将细胞用冰冷PBS洗两遍，于4, 5000g离心3min，沉淀细胞。 加5倍细胞体积的冰浴缓冲液A含NP-40洗细胞一次，于4,5000g离心3 min沉淀细胞. 加3倍细胞体积的冰浴缓冲液A悬浮细胞，冰上放置30 min、剧烈振荡10次，4,5000g离心15min，去上清，沉淀为细胞核。 加与细胞等体积的冰浴缓冲液B，充分混匀，冰上放置30min后，于40 ,15 000g离心15min,上清为核蛋白。 取2ul核蛋

14、白Bradford法测定核蛋白浓度，分装后于-70保存。 2.探针的标记A、探针的标记:将以下试剂参加冰浴中的0.5m l的EP管中，总体积20ul时。未标记的探针:2ul 50ng; 10 x激酶缓冲液:2u1; -32P-ATP: 4ul ; T4多聚核甘酸激酶:lul 10U;超纯水:11ul。B.混匀后37水浴30分钟;C、参加5u1 1%SDS/100 mM EDTA短暂涡旋混匀，以终止激酶反响; 3、探针的纯化a.首先3000rpm离心Sephadex G-50 柱子，以除去G50柱子中的Buffer； b.取一个新的1.5ml的EP管放置G50柱子，并在EP管中参加30l水； c

15、.将标记体系参加Sephadex G-50 柱子，3000rpm，离心2分钟；G50柱子能吸附单核苷酸，通过柱子离心到EP管中的就是标记好的探针 d.测试探针CPM放射性比活度； e.标记的探针储存在铅馆中放于-20 4,测定探针的放射活性取1ul纯化的探针，用闪烁计数器测量其放射活性，放射活性大于1* 10 5cpm/ul示标记成功。 4 蛋白质DNA结合反响 A反响体系： 细胞核蛋白 510 g 5x结合缓冲液 2 l 加蒸馏水至 9 l B混匀，冰上放置； C参加1l标记好的探针，室温孵育30分钟； D 在蛋白与DNA结合孵育后，再参加抗体，继续室温孵育1h. 5. 5%的非变性聚丙烯酰

16、胺凝胶电泳检测。 4条件下8-10伏/cm，电泳 23 小时 6 显影、扫图 在暗室中将磷屏固定在凝胶上方；使用磷屏压片24小时， 扫图 影响蛋白一DNA复合物在凝胶中的迁移率有3个主要因素: 蛋白- DNA复合物的分子量、它们的总电荷及复合物中DNA的构象。作为一般规那么。复合物的迁移率与游离蛋白的大小有关。因此，蛋白质分子量通常是造成延迟条带迁移率减小的惟一原因。 假如结合蛋白是高酸性的而且带很强的负电荷，那么复合物的迁移率可能与裸DNA没有明显的差异。这个问题可以通过进展低pH值的电泳来解决。 当蛋白结合引起DNA片段的弯曲，迁移率就会发生更大的偏向。“弯曲复合物的迁移率要比单从结合蛋白

17、分子量预测的更小有时候量相当大。引起弯曲的角度越大，迁移率的减少的越大。而且，弯曲的位置离分子的中部越近，它的迁移也越慢。一般来说，构象引起的效应有以下性质:电泳分析DNA复合物时，低温、有Mg2+存在以及凝胶的孔径比较小都会增大这种效应。 在上面讨论的理论事项以外，提一些操作上的建议: 凝胶基质: 分析长度大于200个核苷酸的DNA片段形成的复合物用5%聚丙烯酞胺凝胶; 短一些的DNA一般用10%聚丙烯酞胺凝胶。除非结合蛋白或DNA的分子量非常大大于 lkb，否那么不用琼脂糖凝胶。因为琼脂糖凝胶的孔径很大，不能检测蛋白引起的DNA弯曲。 电泳缓冲液:大多数蛋白一DNA复合物是稳定的，而且在中性pH下带