生物制品制造新技术(公开课)

1、 重组表达抗原重组表达抗原(Recombinant antigen) 核酸图谱分析核酸图谱分析(Atlas of Nucleic Acid) 核酸探针核酸探针(Nucleic acid probe) 聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR) 基因芯片基因芯片(Gene chip)一、重组表达抗原一、重组表达抗原n 基因工程重组表达抗原是用基因工程重组表达抗原是用DNA重组技术重组技术，将编码特定，将编码特定抗抗原原的基因插入原核或真核表达质粒，再转入宿主中使其高效表达，的基因插入原核或真核表达质粒，再转入宿主中使其高效表达，然后运用生物化学分离、纯化技术，提取表达产物等，最终制成然后运用生物化学分离

2、、纯化技术，提取表达产物等，最终制成诊断诊断用重组表达抗原。用重组表达抗原。高特异高特异 、高纯度高纯度 、均质性好均质性好、 重复性强重复性强成本低并可大量生产成本低并可大量生产常规方法无法制备的抗原常规方法无法制备的抗原高危险病原高危险病原优点二、核酸图谱分析二、核酸图谱分析n核酸电泳图谱n核酸酶切图谱n寡核苷酸指纹图谱（一）核酸电泳图谱分析（一）核酸电泳图谱分析n1、质粒图谱分析、质粒图谱分析质粒相对稳定性质粒相对稳定性细菌分型、流行病学调查细菌分型、流行病学调查简便、特异、快速、可靠简便、特异、快速、可靠缺点：缺点：一些细菌无质粒或质粒不稳定一些细菌无质粒或质粒不稳定质粒相对分子质量相

3、同而核苷酸序列不质粒相对分子质量相同而核苷酸序列不同的菌株无分辨能力同的菌株无分辨能力n2、RNA电泳图谱分析电泳图谱分析分节段分节段RNA病毒病毒不同病毒或相同病不同病毒或相同病毒不同毒株比较毒不同毒株比较reovirus禽流感：禽流感：8个片段个片段 RNA呼肠孤病毒：呼肠孤病毒：1012 个节段个节段轮状病毒：轮状病毒： 11个节段个节段(二二) 核酸酶切图谱分析核酸酶切图谱分析染色体染色体DAN、质粒、质粒DNA或或RNA经反转录形成的经反转录形成的cDNA，经限制性内切酶，经限制性内切酶切割产生的不同片段，经琼脂糖电泳后可形成不同的带型，即核酸酶切切割产生的不同片段，经琼脂糖电泳后可

4、形成不同的带型，即核酸酶切图谱，又称图谱，又称DNA指纹指纹。 用于比较用于比较不同病原体基因组不同病原体基因组的差异，了解它们之间的遗传关系的差异，了解它们之间的遗传关系RFLP（限制性酶切片段（限制性酶切片段长度多态性）长度多态性）细菌基因特征的重要指标细菌基因特征的重要指标与与核酸杂交核酸杂交技术联合使用技术联合使用更有利于判断和解释更有利于判断和解释（三）寡核苷酸指纹图谱分析（三）寡核苷酸指纹图谱分析将将纯化纯化的的RNA经一种特殊的经一种特殊的RNA酶（通常为酶（通常为T1酶酶）消化后，产生许）消化后，产生许多理化特性和大小不同的寡核苷酸片段，经多理化特性和大小不同的寡核苷酸片段，经

5、PAGE双向双向电泳分离后电泳分离后进行放射自显影，形成类似指纹的图谱，即进行放射自显影，形成类似指纹的图谱，即寡核苷酸指纹图谱寡核苷酸指纹图谱（Oligonucleotide fingerprinting ）。抗原变异分析抗原变异分析疫苗株与野毒株的鉴别疫苗株与野毒株的鉴别分析同源性和变异性，有助于研分析同源性和变异性，有助于研究病毒的变异趋势，跟踪毒株的究病毒的变异趋势，跟踪毒株的来源，扩散途径及目前的优势流来源，扩散途径及目前的优势流行株，有助于爆发流行的预测行株，有助于爆发流行的预测三、核酸探针三、核酸探针用用放射性同位素放射性同位素、地高辛地高辛或或生物素生物素等标记核酸分子或其它一

6、条链作为核酸等标记核酸分子或其它一条链作为核酸探针，与处理样本中存在的互补链结合为双链，该反应称探针，与处理样本中存在的互补链结合为双链，该反应称核酸杂交核酸杂交或或分子分子杂交杂交。Southern blot DNANorthern blot RNA应用：应用：难以培养的病原体检测难以培养的病原体检测 牛白血病、猪痢疾、牛和猪钩端螺旋体病、牛副结核牛白血病、猪痢疾、牛和猪钩端螺旋体病、牛副结核转印杂交转印杂交 （transfer hybridization ）原位杂交（原位杂交（in situ hybridization ）DNA 样品样品 DNA 探针探针变性X-ray 片限制性内切限制性

7、内切酶消化酶消化琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳转移印迹转移印迹胶胶 膜膜两部分工作两部分工作标记杂交杂交暴光暴光聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）RTPCR 原位原位PCR荧光荧光PCR巢式巢式PCR定量定量PCR定性、定量、定位定性、定量、定位假阳性、假阴性假阳性、假阴性可重复性可重复性反向反向PCR不对称不对称PCR重组重组PCR多重多重PCR免疫免疫-PCR PCR的反应体系的反应体系五、基因芯片（五、基因芯片（Gene chip） 将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针探针，有规律地排列固，有规律地排列固定于支持物上，然后与待检测样品中的基因

8、按定于支持物上，然后与待检测样品中的基因按碱基配对原理碱基配对原理进行进行杂交杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作比较和检测，从而迅速得出所要的信息。对每一探针上的荧光信号作比较和检测，从而迅速得出所要的信息。arrayermicroarrayBiologicalSampleAnalyze dataScanner“Hybridize”DNA芯片技术流程DNADNA芯片技术的应用领域芯片技术的应用领域生物战剂检测生物战剂检测 临床疾病的临床疾病的 基因诊断基因诊断法医学鉴定法医学

9、鉴定药物研究开发药物研究开发动植物检疫动植物检疫 基因组研究基因组研究后基因组计划后基因组计划生物信息学生物信息学DNA芯片芯片第三节、抗体工程技术第三节、抗体工程技术 单克隆抗体单克隆抗体 基因工程抗体基因工程抗体 催化抗体催化抗体一、单克隆抗体一、单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体：由一个：由一个B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的针对针对单一抗原决定簇单一抗原决定簇的抗体。的抗体。特性特性多抗多抗单抗单抗对免疫原性要求对免疫原性要求免疫原纯度高，抗体纯度才高免疫原纯度高，抗体纯度才高用不纯的免疫原可得高纯单抗用不纯的免疫原可得高纯单抗抗体产生细胞抗体

10、产生细胞多克隆性多克隆性单克隆性单克隆性同质性同质性高度异质高度异质高度同质高度同质特异性特异性较高，与抗原上多种决定簇结合较高，与抗原上多种决定簇结合高，与特定决定簇结合高，与特定决定簇结合稳定性稳定性较好较好相对较差，对理化条件敏感相对较差，对理化条件敏感标准化标准化较难，不同批次的抗体质量差异较较难，不同批次的抗体质量差异较大大易于标准化，批次间差异较小易于标准化，批次间差异较小交叉反应交叉反应很常见，难避免非特异反应很常见，难避免非特异反应不常见，可避免非特异反应不常见，可避免非特异反应沉淀反应沉淀反应有有大多数没有大多数没有杂交瘤技术制备单抗将经预定抗原免疫的将经预定抗原免疫的淋巴细

11、胞淋巴细胞与失去次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移与失去次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（）或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）合成能力的）合成能力的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系系融合，产生杂交瘤细胞，经过培养，筛选或克隆化，获得既能分泌针融合，产生杂交瘤细胞，经过培养，筛选或克隆化，获得既能分泌针对预定抗原的单抗又有无限繁殖能力的杂交瘤细胞系，这就是对预定抗原的单抗又有无限繁殖能力的杂交瘤细胞系，这就是淋巴细淋巴细胞杂技瘤技术胞杂技瘤技术（lymphocyte hybridoma technology）。）。1、B细胞的制备细胞的制备：提纯的抗原免疫：提纯的抗原免疫Balb/c或其它

12、品系的纯系小鼠，取或其它品系的纯系小鼠，取小鼠脾脏，制备小鼠脾脏，制备B细胞细胞2、骨髓瘤细胞的制备、骨髓瘤细胞的制备：相同来源小鼠的骨髓瘤细胞，营养缺陷，不能：相同来源小鼠的骨髓瘤细胞，营养缺陷，不能在在HAT培养基上生长培养基上生长3、饲养细胞的制备、饲养细胞的制备：小鼠胸腺细胞、腹腔巨噬细胞等：小鼠胸腺细胞、腹腔巨噬细胞等4、HAT培养基筛选杂交瘤的原理培养基筛选杂交瘤的原理小鼠小鼠脾细胞脾细胞小鼠小鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞ABPEG未融合的A相互融合的AA与B融合相互融合的B未融合的BHAT选择培养液中培养HGPRT+TK+HGPRT+ TK+HGPRT 或 TK代谢完整但不能连续培养代

13、谢完整并能连续培养代谢缺陷细胞死亡细胞死亡细胞存活并增殖细胞死亡细胞死亡H: 次黄嘌呤次黄嘌呤A：氨基喋呤：氨基喋呤T：胸腺嘧啶核苷：胸腺嘧啶核苷5、细胞融合、细胞融合：脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合，离心后吸尽上清液，然后缓慢加入融合剂50PEG。静置90S，逐渐加入HAT培养基，分于加有饲养细胞的96孔细胞培养板孔中，置510CO2培养箱。6、杂交瘤细胞的筛选、杂交瘤细胞的筛选：血清学方法检测各孔抗体 筛选阳性抗体7、杂交瘤细胞的克隆化：、杂交瘤细胞的克隆化：尽早克隆化，反复克隆3-5次使杂交瘤细胞稳定 有限稀释法 显微操作法 软琼脂平板法：458、杂交瘤细胞的冻存、杂交瘤细胞的冻存：加

14、入DMSO分装于小安瓿内保存于液氮中9、单抗的生产、单抗的生产：动物体内生产系统：小鼠腹腔，收腹水，腹腔注射液体石蜡或降植烷，刺激腹水产生细胞培养产生系统：单层细胞培养或悬浮培养。关键：提高培养液中的细胞密度（四）单克隆抗体的应用1.血清学技术：血清学技术：可取代原有的多克隆抗体，用于传染病的诊断及病原的分型，避免了多克隆抗体引起的交叉反应。提高检测生物活性物质水平2.免疫学基础研究免疫学基础研究：促进抗体结构的进一步探讨，淋巴细胞CD及细胞组织相容性抗原的分析3.肿瘤治疗肿瘤治疗：肿瘤特异性抗原的单抗，与药物或毒素连接制成免疫毒素，又称生物导弹4.抗原纯化抗原纯化：亲和层析柱，提取抗原；基因

15、工程疫苗筛选保护性抗原成分或决定簇二、基因工程抗体二、基因工程抗体n用基因工程技术制备抗体分子，这种抗体分子用基因工程技术制备抗体分子，这种抗体分子称为称为基因工程抗体基因工程抗体（genetic engineering antibody）。 嵌合抗体（chimeric antibody） 重构抗体（reshaping antibody） 单链抗体（single-chain antibody） Ig相关分子 噬菌体抗体（phage antibody） 全套抗体（the immunoglobulin repertoire）基因库嵌合抗体（chimeric antibody）n嵌合抗体是指在同一抗

16、体分子种含有不同种属来源抗体片段的抗体，又称杂种抗体。 “鼠人”型重构抗体（reshaping antibody）n在嵌合抗体的基础上，进一步将鼠Ab超变区基因嵌入人抗体Fab骨架区的编码基因中，再将此DNA片段与人Ig恒定区基因相连，然后转染杂交瘤细胞，使之表达嵌合的V区抗体。 在人抗体可变区序列内嵌入鼠源抗体的高变区基因序列，通过这种置换为人类抗体提供了一个新的抗原结合部位。单链抗体单链抗体（single-chain antibody）Ig相关分子n将抗体分子的部分片段（如V区或C区）连接到与抗体无关的序列上（如毒素），就可创造一些Ig相关分子。 “生物导弹”，毒素取代Fc,通过高变区结合

17、特异抗原，连接上的毒素可直接运送到靶细胞表面噬菌体抗体（phage antibody）全套抗体（the immunoglobulin repertoire）基因库n将全套抗体基因库中的将全套抗体基因库中的VH基因与有限数基因与有限数目的目的VL基因排列组合构建基因排列组合构建Ig，从中可筛，从中可筛选出有催化作用的抗体。选出有催化作用的抗体。 Ig与抗原结合的作用主要来自重链三三 、催化抗体催化抗体(catalytic antibody)n也称抗体酶也称抗体酶(abzyme),是具有是具有催化活性催化活性的的免疫球蛋白免疫球蛋白，具有抗体的高度选择性和，具有抗体的高度选择性和酶的高效催化性。酶

18、的高效催化性。1、与天然酶相比抗体酶的特点、与天然酶相比抗体酶的特点l 能催化一些天然酶不能催化的反应能催化一些天然酶不能催化的反应l 有更强的专一性和稳定性有更强的专一性和稳定性l 催化作用机制不同催化作用机制不同2、抗体酶和非催化性抗体作用的比较、抗体酶和非催化性抗体作用的比较l 更高的反应特异性更高的反应特异性l 反应的可逆性反应的可逆性l 反应的量效性反应的量效性l 反应过程反应过程抗体酶的特点（二）催化抗体的制备（二）催化抗体的制备n1、细胞融合法、细胞融合法：用设计好的：用设计好的半抗原半抗原，通，通过间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白）过间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。（偶联制成抗原。（反应物的过渡态类似反应物的过渡态类似物物） 以此抗原制备相应的单抗即得抗体酶以此抗原制备相应的单抗即得抗体酶2、抗体结合位点化学修饰法、抗体结合位点化学修饰法： 在抗体结合位置或附近在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基因。 游离巯基（-SH），它具有高亲核性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点3 . 引入辅助因子法引入辅助因子法 酶活性中心酶活性中心 金属离子金属离子 将金属离子引入抗体酶，催化肽键的选将金属离子引入抗体