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1、多重PCR分析检测和定量分析小定鞭金藻（定鞭藻门）的物种特异性孙勇摘要 多重PCR用于检测和定量分析小定鞭金藻的物种和基因特异性，以基因组基因为模版，用一套引物特异性的扩增四种具有基因特异性的PCR产物，通过普通PCR扩增产物经过凝胶电泳可以产生诊断条带，荧光分子标记被用于实时定量PCR（qPCR），通过分离小定鞭金藻及其相关物种，对其物种和基因特异性加以评价，用定量PCR进行评估环境样品中藻类数目可比从人工计数得到平均值有较低的标准偏差。这显着的改善了基于DNA的检测技术，通过快速同时测定四种特异性条带，可以区分一些长期地理隔离的小定鞭金藻。引言 小定鞭金藻与世界范围内很多鱼类的死亡，快速的

2、从水体中检测出来该藻显得十分必要，早期的检测往往有缺憾，包括光学显微镜检测溶血性检测，但这些检测方法对低浓度的金藻无能为力。有一些分子生物学的替代方案用于检测，如实时定量PCR，为了扩大检测范围改善检测方法，使用多重荧光PCR，在普通PCR的基础上加入多对引物，以增加遗传标记的数目，使PCR不需要经过凝胶电泳就能分析，缩短了检测时间。实验及结果先选取相应引物，进行单引物扩增，获得特异性条带，并测定序列，单引物扩增后多引物扩增，实验及结果 多引物扩增采用选取四个引物GMP1,SYNAP1,FUCO,GST，由于小定鞭金藻多以单藻形式生存，而常规PCR也不能给出相关藻类浓度方面的信息，所以根据所测

3、定的序列使用特异性荧光分子信标，实时定量PCR（QPCR），根据荧光量得到相应藻类的含量，用QPCR检测了六个藻种（TX,SC,ME,UK,N1,N2,PAT）实验及结果 其中只有FUCO荧光信号在六个物种中均有存在，确定使用FUCO进行QPCR，然后DNA的浓度梯度评估，细胞浓度梯度评估，以确定不同的标准曲线，使他们可以用于定量未知样本，得到DNA用量和细胞用量与信号强度的关系。DNA的量小于10pg大于50ng均得不到理想的曲线细胞用量小于100，大于10000个也得不到理想的曲线分别得到DNA用量和细胞用量与QPCR的标准曲线然后测定信号大小根据标准曲线得到相应藻类的量讨论 讨论本测定的效率随地理隔离距离的增加而下降，也取决于探针的特异性和灵敏度，实验中可知每个探针的灵敏度是不同的，在此次实验中其他的地理植株没有被探测就是因为没有选取到特异性比较好的探针（引物），进一步的实验应当寻找更加保守的DNA区域，更敏感的引物。讨论 本实验表明多重QPCR可以用于小定鞭金藻的检测，快速切特异性好。传统多重PCR需要7个小时完成，而多重QP

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