第4章基因组测序与序列组装3+1陈竺

1、（一）（一）DNADNA的酶法测序（双脱氧终止法）的酶法测序（双脱氧终止法）1955 1955 确定牛胰岛素结构，确定牛胰岛素结构， 1958 1958 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖1975 1975 设计出设计出DNADNA测序法，测序法， 1980 1980 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖Sanger合成一段与待测合成一段与待测DNADNA序列互补的序列互补的DNADNA片段群片段群吴瑞（吴瑞（1928-2008）吴瑞在分子生物学和植物生物学等领域有重要贡献。吴瑞在分子生物学和植物生物学等领域有重要贡献。A 克隆于质粒中DNA用碱或热变性B M13克隆单链DNAC 噬粒克隆DNAD PCR产

2、生单链DNAA 高酶活性B 无53外切酶活性C 无35外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子连接的是氢原子,不是羟基A 高酶活性： 聚合酶在终止合成前，多聚核苷酸分子可延伸的有效长度聚合酶在终止合成前，多聚核苷酸分子可延伸的有效长度B 无53外切酶活性 外切核酸酶活性外切核酸酶活性C C 无35外切酶活性 较读功能较读功能 KlenowKlenow酶酶 250bp250bp测序酶测序酶 sequenasesequenase 蛋白水解酶水解有限产物,68000和35000的片段， 用途：双链DNA 5突出(5overhang)末端的补平(fill-in)；双链DNA

3、 3突出(3overhang)的打平(也称削平)；5突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序；cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。 35外切酶活性外切酶活性校对作用校对作用这种酶活性的主要功能是从这种酶活性的主要功能是从35方向识别和切除方向识别和切除不配对的不配对的DNA生长链末端的核苷酸。生长链末端的核苷酸。 53外切酶活性外切酶活性切除修复作用切除修复作用从从53方向水解方向水解DNA生长链前方的生长链前方的DNA链，主要产链，主要产生生5-脱氧核苷酸。脱氧核苷酸。A 克隆于质粒中DNA小于3kb的可以进行，是包装在噬菌体中的单链DNA，容

4、易丢失和重排。用碱或热变性，可能有未纯化的DNA沾染，干扰测序反应，但是最常用方法。B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA10kb，质粒自身的复制起点，还有一个M13或者其他的单链DNA噬菌体的复制起点，大肠杆菌中含有噬粒和辅助噬菌体时，因携带噬菌体复制酶和外壳蛋白的基因，所以激活噬菌体DNA复制，产生单链噬粒噬菌体，比M13稳定。用标记了金属粒子的引物，磁性装置纯化后使用。D PCR产生单链DNA哌啶硫酸二甲酯DNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP120台毛细管电泳装置24小时连续作业，一天工作量是1亿亿个碱基长度的DNA，4天就可测完水稻基因组1 A TACGTTA

5、2 GTTAGA TC3 ACGTTAGA4 CGTTAGA T5 GTTAGA TCDNA 样品 TA TGCAA TCTAG与基因芯片上 65,000 种可能的八聚体进行杂交从而形成特定的结合图形计算机分析杂交图象并由探针的重叠情况推导样品的核酸序列1 A TACGTTA3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGA T5 GTTAGA TC3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGA T互补序列为：A TACGTTAGA TC样品序列为：TA TGCAA TCTAG利用基因芯片进行杂交测序的原理利用基因芯片进行杂交测序的原理可测可测DNA片段的长度是芯片上排列的

6、寡聚核苷酸数目的平方根。片段的长度是芯片上排列的寡聚核苷酸数目的平方根。1、碱基组成特殊，着丝粒附近，高度重复，缺少酶切位点，难已获得大分子克隆2、高度重复序列不稳定，在扩增中容易丢失3、某些基因的表达产物对宿主菌有毒性ABCABCABCABC小片段测序小片段测序计算机拼装计算机拼装ABC小片段测序小片段测序计算机拼装计算机拼装鸟枪法鸟枪法(Shotgun)测序的问题测序的问题 CAATGCATTAGCAGCCAATGCGAP错装错装解决办法:通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库解决办法:利用其它宿主菌与载体重新构建文库 先将染色体打成比较大的片段先将染色体打成比较大的片段(几十几十-

7、几百几百Kb), 利用利用分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群(Contig), 分别分别测序后拼装测序后拼装. 这种策略叫这种策略叫基于克隆群基于克隆群(contig-based)的策的策略略.ABCABC大片段大片段contig小片段测序拼装小片段测序拼装随机测序与序列组装方法和指导测序与序列组装方法相结合进行序列组装19号染色体号染色体是是含基因最丰富含基因最丰富的染色的染色体，而体，而13号染色体号染色体含基因量最少含基因量最少目前已经发现和定位了目前已经发现和定位了26000多个多个功能基因，其中尚有功能基因，其中尚有42%的基因尚的基因尚不知道功能不知道功能人类基因组中存在人类基因组中存在“热点热点”和大片和大片“荒漠荒漠”。在染色体上有基因成簇密集。在染色体上有基因成簇密集分布的区域，也有大片的区域只有分布的区域，也有大片的区域只有“无无用用DNA” 不包含或含有极少基因的不包含或含有极少基因的成分。成分。基因组上大约有基因组上大约有14的区域没有的区域没有基因的片段基因的片