液相色谱质谱分析

1、 液相色谱质谱分析液相色谱质谱分析一、一、 液相色谱概述液相色谱概述二、二、 HPLCHPLC仪器构成仪器构成三、高效液相色谱法的类型及分离机理三、高效液相色谱法的类型及分离机理四、色谱分离方法的选择四、色谱分离方法的选择五、质谱仪五、质谱仪主要内容主要内容一、一、 概概 述述 高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）是一种以是一种以液体为流液体为流动相动相的的快速分离分析色谱技术快速分离分析色谱技术。具有。具有高压、高速、高压、高速、高效、高灵敏度高效、高灵敏度的特点，对于那些的特点，对于那些沸点高沸点高，热稳热稳定性差定性差，相对分子质量大相对分子质量大的的有机化合物有机化合物如烷烃、如烷烃、

2、烯烃、芳烃、染料、蛋白质、氨基酸、核酸等均烯烃、芳烃、染料、蛋白质、氨基酸、核酸等均可进行分离分析。可进行分离分析。 1 、高效液相色谱、高效液相色谱1）高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 10cm3min-1.2）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20。对于占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。高效液相色谱的优点高效液

3、相色谱的优点3）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 4）气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。高效液相色谱的优点高效液相色谱的优点2 、液相色谱仪器液相色谱仪器（high performance liquid chromatograph）液相色谱仪（液相色谱仪（1）液相色谱仪（液相色谱

4、仪（2）液相色谱仪（液相色谱仪（3）液相色谱仪（液相色谱仪（4）LCQ Deca XP MAX液相色谱质谱联用仪液相色谱质谱联用仪二、二、 HPLC仪器构成仪器构成1 、流程流程2 、 HPLC仪器组成：仪器组成： 高压输液装置高压输液装置 进样系统进样系统 分离系统分离系统 检测系统检测系统 高压输液系统 (1) 贮液器贮液器 用来供给足够数量的合乎要求的流动相以完成分析用来供给足够数量的合乎要求的流动相以完成分析工作。工作。材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK） 容积：容积：0.52.0L 放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压

5、差放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差 注意：密封、过滤注意：密封、过滤流动相过滤与脱气装置 流动相过滤装置 分为在线过滤和真空过滤 流动相脱气装置 分为在线真空脱气和超声波脱气泵体材料耐腐蚀泵体材料耐腐蚀泵腔的体积要小，泵腔的体积要小，以便快速更换以便快速更换溶剂溶剂能在高压下连续能在高压下连续工作工作, ,耐压耐压40-40-50MPa. cm50MPa. cm2 2压力平稳，无压力平稳，无脉冲脉冲高压输液泵高压输液泵输出流量稳定，输出流量稳定，重复性高重复性高, ,输出输出流量范围宽流量范围宽(2) 高压输液泵高压输液泵 梯度淋洗装置梯度淋洗装置 (内梯度)(外梯度)梯度淋洗装置梯度

6、淋洗装置等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱的特点的特点改善分离改善分离, , 加快分析速度；加快分析速度；改善峰形改善峰形, , 减少拖尾减少拖尾; ;可能引起可能引起基线漂移基线漂移分配比变化范围宽的分配比变化范围宽的复杂样品应采取复杂样品应采取梯度洗脱方式分离梯度洗脱方式分离1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2) 适用于所选择的检测器。适用于所选择的检测器。3) 化学惰性好，以免破坏固定相。化学惰性好，以免破坏固定相。4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5) 纯度高。溶剂

7、不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。流动相溶剂选流动相溶剂选择的一般要求择的一般要求(2)(2) 进样系统进样系统进样针进样针六通阀六通阀 准备状态准备状态 进样状态进样状态六通阀进样六通阀进样 装置装置六通阀进样六通阀进样 装置的使用及保养装置的使用及保养1、进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品 溶液均要用045微米的滤膜过滤。 2、进样时，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，以免漏液和引 入空气；另外，也防止了针头刺坏密封组件及定子。 3、进样时，要求完全置换样品定量环内残留的溶液，以此提 高精密度及重现性。4、进样时，手柄处于Load和In

8、ject之间时，应尽快转阀，不 能停留在中途。5、每次结束后应反复冲洗进样器再用无纤维纸擦净注射器针 头的外侧。(3) 分离系统分离系统 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。色谱柱色谱柱1使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有 一定的溶解度)。2大多数反相色谱柱的pH稳定范围是27.5，尽量不超过该色谱 柱的pH范围。3避免流动相组成及极性的剧烈变化。4流动相使用前必须经脱气和过滤处理。5如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱 子冲洗干

9、净，并保存大乙腈中。6压力升高是需要更换预柱的信号。色谱柱的使用和维护色谱柱的使用和维护(4) 液相色谱检测器液相色谱检测器a. 紫外检测器紫外检测器b. 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器c.示差折光检测器示差折光检测器d. 荧光检测器荧光检测器e.电导检测器电导检测器f. 质谱检测器质谱检测器a. 紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机应用最广，对大部分有机化合物有响应。化合物有响应。特点：特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。b. 光电二极管阵列检测器光电二

10、极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。两种检测器的色谱图两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器：二极管阵列检测器nm254 紫外检测器紫外检测器灵敏度高，灵敏度高，精密度及线性范围较好精密度及线性范围较好 ，可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 流动相选择有限制。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂溶剂CS2氯仿氯仿 四氢四氢呋喃呋喃苯苯乙腈乙腈甲醇甲醇水水紫外截

11、紫外截止波长止波长/nm380245212210 190205187类类 型型 主要分离机理主要分离机理 主要分析对象或应用领域主要分析对象或应用领域 吸附色谱吸附色谱 吸附能，氢键吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备异构体分离、族分离，制备分配色谱分配色谱 疏水分配作用疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱凝胶色谱 溶质分子大小溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱离子交换色谱 库仑力库仑力 无机离子、有机离子分析无机离子、有机离子分析离子排斥色谱离子排斥色谱 Donnan膜平衡膜平衡 有机

12、酸、氨基酸、醇、醛分析有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱离子对色谱 疏水分配作用疏水分配作用 离子性物质分析离子性物质分析 疏水作用色谱疏水作用色谱 疏水分配作用疏水分配作用 蛋白质分离与纯化蛋白质分离与纯化 手性色谱手性色谱 立体效应立体效应 手性异构体分离，药物纯化手性异构体分离，药物纯化亲和色谱亲和色谱 生化特异亲和力生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析三、高效液相色谱法的类型及分离机理三、高效液相色谱法的类型及分离机理2. 分配色谱（液液分配色谱）分配色谱（液液分配色谱）（1）原理）原理 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解根据各待测

13、物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系数度不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中，。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。过程。分离原理分离原理msccK K不仅与固定相的不仅与固定相的种类有关，也与流种类有关，也与流动相的种类有关动相的种类有关固定相极性固定相极性流动相极性流动相极性正相分配色谱正相分配色谱组分极性越大，组分极性越大，保留时间越长保留时间越长反相分配反相分配色谱色谱固定相极性固定相极性流动相极性流动相极性组分极性越

14、小，组分极性越小，保留时间越长保留时间越长（2）分类）分类四、四、 色谱分离方法的选择色谱分离方法的选择五、质谱仪五、质谱仪1. 质谱分析法质谱分析法2. 质谱仪的结构及工作原理质谱仪的结构及工作原理3. 质谱图及离子峰的主要类型质谱图及离子峰的主要类型 质谱分析法质谱分析法（Mass Spectrometry, MS）是）是在高真空系统中测定样品的分子离子及碎片离在高真空系统中测定样品的分子离子及碎片离子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构的方法。化合物分子受到电子流冲击后，形成的方法。化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子，按

15、照其质量的带正电荷分子离子及碎片离子，按照其质量m和电荷和电荷z的比值的比值m/z（质荷比）大小依次排列（质荷比）大小依次排列而被记录下来的图谱，称为质谱。而被记录下来的图谱，称为质谱。 1. 质谱分析法质谱分析法1)根据质谱峰的质荷比测定化合物的分子量，根据质谱峰的质荷比测定化合物的分子量，推测分子式及结构式推测分子式及结构式2)根据峰强度进行定量分析根据峰强度进行定量分析 CH32.2.质谱仪的结构质谱仪的结构（1） 进样系统进样系统作用：作用：将样品分子引入到离子源中将样品分子引入到离子源中。 蠕动泵连续进样蠕动泵连续进样六通阀直接进样六通阀直接进样 色谱进样系统色谱进样系统方式：方式：

16、(2) 离子源离子源作用：作用： 1. 将导入质谱仪系统的样品去溶剂化将导入质谱仪系统的样品去溶剂化 2. 将离子源处的大气压与质谱仪系统一级将离子源处的大气压与质谱仪系统一级 真空阻隔开真空阻隔开 3. 被分析物离子化或将溶剂中的离子转化被分析物离子化或将溶剂中的离子转化 成气相成气相 4. 去除中性物质和带反极性电荷离子，否去除中性物质和带反极性电荷离子，否 则会对分析产生干扰则会对分析产生干扰电喷雾电离源电喷雾电离源(ESI)多电荷离子多电荷离子测定的样品分子量大测定的样品分子量大(3) 质量分析器质量分析器 a 单聚焦型磁分析器单聚焦型磁分析器作用作用: 是将不同碎片按质荷比是将不同碎

17、片按质荷比m/z分开。分开。质量分析器类型：磁分析器、飞行时间、四极杆、离子捕获、离子回旋等。 b 四级杆分析器四级杆分析器(4) 检测器检测器 电子倍增器示意图 质谱仪常用的检测器有法拉第杯(Faraday Cup)、电子倍增器及闪烁计数器、照相底片等。阴极阴极放大放大105-108倍倍特点：特点：实现高灵敏度、快速测定实现高灵敏度、快速测定.(5) 真空系统真空系统作用：作用： 1) 消减离子的不必要碰撞，避免离消减离子的不必要碰撞，避免离子损失；子损失；2) 避免避免离子分子反应改变裂解模离子分子反应改变裂解模式，使质谱复杂化；式，使质谱复杂化；3) 减小本底。减小本底。离子源离子源质量

18、分析器质量分析器真空度要求：真空度要求： 脂环硫醚、硫酮共轭烯烃直链烷烃酰胺酮醛胺脂醚羧酸支链烃腈伯醇叔醇缩醛c、分子离子峰与邻近峰的质量差是否合理。分子离子峰与邻近峰的质量差是否合理。 有机分子失去碎片大小是有规律的：如失去H、CH3、H2O、C2H5，因而质谱图中可看到M-1，M-15，M-18，M-28等峰，而不可能出现M-3，M-14，M-24等峰，如出现这样的峰，则该峰一 定不是分子离子峰。 质量差为(4-13)、19-25、37、38、50-53、65-66的不是分子离子峰，当 差值为14=CH2时应小心，这表明可能有待测物的同系物存在。b、利用经验规律：、利用经验规律：分子离子峰

19、应符合“氮律” 在C、H、O组成的化合物中，分子离子峰的质量数一定是偶数；在含C、H、O、N化合物中，含偶数个N的分子量为偶数，含奇数个N的分子量为奇数不符合上述规律者必不是分子离子峰。 通过改变仪器实验条件来检验：通过改变仪器实验条件来检验： 1）采用化学电离源、场离子或场解吸源等电离方法； 2）制备易挥发的衍生物，如通过甲基化、乙酰基化、甲酯化、氧化或还原等方法将样品制备成适当的衍生物后再测定。 3、结构鉴定、结构鉴定 a) 根据质谱图，找出分子离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰、m/z、相对峰高等质谱信息，根据各类化合物的裂解规律，重组整个分子结构。 b) 采用与标准谱库对照的方法。 由质谱

20、数据推导有物机分子结构的过程，形象地说，由质谱数据推导有物机分子结构的过程，形象地说，如同用弹弓击碎一个瓷花瓶，再由一堆碎片来拼凑复原花如同用弹弓击碎一个瓷花瓶，再由一堆碎片来拼凑复原花瓶的过程。瓶的过程。 蜂胶素被誉为蜂胶素被誉为“紫色黄金紫色黄金”，集动植物之精华，集动植物之精华, ,具有复杂而独特的化学组成。富含黄酮类和萜烯具有复杂而独特的化学组成。富含黄酮类和萜烯类物质。黄酮是人体必需营养成份之一，体内不类物质。黄酮是人体必需营养成份之一，体内不能合成，但对调节生理功能，提高生命运动质量能合成，但对调节生理功能，提高生命运动质量有重要意义。而蜂胶中含有多种黄酮类物质，因有重要意义。而蜂

21、胶中含有多种黄酮类物质，因此对蜂胶产品的开发和使用有重要的社会意义。此对蜂胶产品的开发和使用有重要的社会意义。53实验实验 HLPC分离蜂胶中的黄酮类物质分离蜂胶中的黄酮类物质仪器与试剂仪器与试剂 SURVEYORSURVEYOR液相色谱质谱联用仪液相色谱质谱联用仪( (美国菲尼根公司美国菲尼根公司) ) 甲醇（色谱纯）甲醇（色谱纯）; ;水（高纯水）水（高纯水）; ;芦丁芦丁, ,槲皮素槲皮素, ,木犀草素木犀草素, ,染料染料木素木素, ,高良姜素高良姜素, ,姜黄素标样（分析纯）姜黄素标样（分析纯） 原料原料 蜂胶由河南科技学院养蜂厂提供蜂胶由河南科技学院养蜂厂提供54 色谱条件的选择色谱条件的选择 色谱柱色谱柱:EclipseXDB-C:EclipseXDB-C1818(4