第五章分子生物学研究法(上)1

1、分子生物学基本研究法（上）分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术第五章 扉页：扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀翅膀”，否，否则，你就不可能走在别人的前面。则，你就不可能走在别人的前面。基因操作主要包括基因操作主要包括DNA分子的分子的切割与连接、细胞转切割与连

2、接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和突变和PCR扩增扩增等，是分子生物学研究的核心技术。等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主

3、细胞中的繁衍调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它生命科学技术的根本特征。区别于其它生命科学技术的根本特征。重组重组DNADNA技术发展史上的三大里程碑：技术发展史上的三大里程碑：一、一、2020世纪世纪4040年代确定了遗传信息的携带者、即基因年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是的分子载体是DNADNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质而不是蛋白质，解决了遗传的物质

4、基础问题。基础问题。图图1-1 DNA是是“转化源转化源” 二、二、5050年代提出了年代提出了DNADNA分子的双螺旋结构模型和半保留分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制复制机制, ,解决了基因的自我复制和世代交替问题。解决了基因的自我复制和世代交替问题。Generalized model of semiconservative replication of DNA. New synthesis is shown in blue.三、三、5050年代末至年代末至6060年代，相继提出了年代，相继提出了“中心法则中心法则”和和操纵子学说操纵子学说, ,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息成功地

5、破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。的流动与表达机制。Crick于于1958年所提出的遗传信息传递规律（即中心法年所提出的遗传信息传递规律（即中心法则）。则）。中心法则的演变中心法则的演变1958年首次年首次提出的提出的“中心法则中心法则” 1970-1980年年的的“中心法则中心法则” 21世纪后修正世纪后修正的的“中心法则中心法则” 上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源自工具酶的发现。自工具酶的发现。5.1 基因操作的基本工具基因操作的基本工具（一）（一）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能够识别能够识别DNA上的特定碱基序

6、列并从这个位点切开上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。分子。第一个核酸内切酶第一个核酸内切酶EcoRI是是Boyer实验室在实验室在1972年发年发现的，它能特异性识别现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链序列，将双链DNA分分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 图图5-1 几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及内切酶所识别的序列及其酶切末端其酶切末端。Werner Arber, Hamilton Smith and Daniel Nathans were awarded the 1978 Nobel Prize for

7、their work on REs. 图图5-2 DNA连接酶能把不同的连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体片段连接成一个整体 Pvu RE 切割随机切割随机DNA分子（假定分子（假定4种碱基在种碱基在DNA中均匀中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n 来计来计算，如一个算，如一个6碱基切割酶平均每碱基切割酶平均每4096 bp核核DNA有一有一个酶切位点（个酶切位点（46），而一个），而一个4碱基切割酶平均每碱基切割酶平均每256 bp核核DNA就有一个酶切位点（就有一个酶切位点（44）。）。重组重组DNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的

8、主要工具酶酶酶 类类功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片段连接片段连接成一个成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大肠杆菌）（大肠杆菌） 按按55到到33方向加入新的核苷酸，补平方向加入新的核苷酸，补平DNADNA双双链中的缺口链中的缺口反转录酶反转录酶按照按照RNARNA分子中的碱基序列，根据碱基互补分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成原则合成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到

9、多聚核苷酸链的5-OH5-OH末端末端（进行末端标记实验或用来进行（进行末端标记实验或用来进行DNADNA的连接的连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的33末端加上多聚或单核苷酸末端加上多聚或单核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII从从DNADNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA链末端的磷酸基团链末端的磷酸基团 （二）基因克隆的载体（二）基因克隆的载体 载体三要素：载体三要素：自我复制能力自我复制能力携带外

10、源基因片段大小携带外源基因片段大小插入位点多少插入位点多少易于鉴定识别程度易于鉴定识别程度大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体质粒载体 长长9.09kb，带有四环素抗性基因（，带有四环素抗性基因（tetr）及）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及以及SmaI等等7种限制性核酸内切酶的种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在单酶切位点，在HindIII、BamHI和和SalI等等3个位点插入外源基因，会导致个位点插入外源基因，会导致tetr失活。失活。大 肠 杆 菌大 肠 杆 菌pSC101质质粒 载 体 示粒 载 体 示意图。意图。是第

11、一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有12个拷个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。产量很低。2、ColE1质粒载体质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。松弛型复制控制的多拷贝质粒。 一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停的

12、复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。止。松弛型质粒松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细却继续复制数小时，使每个寄主细胞中胞中ColE1质粒的拷贝数达到质粒的拷贝数达到10003000个，占细胞个，占细胞总总DNA的的50%左右。左右。3、pBR322质粒载体质粒载体由三个不同来源的部分组成的：由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于第一部分来源于pSF2124质粒易位子质粒易位子Tn3的氨苄青霉的氨苄青霉素抗性基因（素抗性基因（AmpR）；）；第二部分来源于第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因质粒的四环素抗性基因（tetr）；）；第三部分则来源于第三部分则来源于ColE1

13、的派生质粒的派生质粒pMB1的的DNA复复制起点（制起点（ori）。）。AmpR优点是具有较小的分子量优点是具有较小的分子量(4363bp)，易于纯化。即使，易于纯化。即使携带了携带了6-8kb的外源的外源DNA片段，操作仍较便利。片段，操作仍较便利。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积1000300010003000个拷贝，便于制备重组体个拷贝，便于制备重组体DNADNA。获得了用外源获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种片段和载体分子重组而成的

14、杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图分子的增殖（图5-3）。）。 图图5-3 重组重组DNA操作过程示意图操作过程示意图 4、其它常见的质粒载体、其它常见的质粒载体5. 2 DNA操作技术操作技术5. 2. 1核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳自 从 琼 脂 糖 （自 从 琼 脂 糖 （ a g a r o s e ） 和 聚 丙 烯 酰 胺） 和 聚 丙 烯 酰 胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分）凝胶被引入核酸研究以

15、来，按分子量大小分离子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。重要实验手段。 一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。生理条件下

16、，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所 以 ，所 以 ， D N A 和和 R N A 又 被 称 为 多 聚 阴 离 子又 被 称 为 多 聚 阴 离 子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。样的速度向正电极方向迁移。 在生理条件下，在生理条件下，DNA电泳的迁移率，电泳的迁移率，取决于取决于核酸分子

17、本身的大小和构型核酸分子本身的大小和构型。琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为片段的范围为0.250kb之间。之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到到1000个碱基对之间。个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。高，孔隙越小，其分辨能力就越强。表表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片片段的能力段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖

18、琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501图图5-4 5-4 溴化乙锭染溴化乙锭染料的化学结构及其料的化学结构及其对对DNADNA分子的插入作分子的插入作用。由于插入了溴用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中糖凝胶电泳中DNADNA的的条带便呈现出橘黄条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。色荧光，易于鉴定。凝胶电泳中，加入凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭对核适量溴化乙锭对核酸分子进行染色，酸

19、分子进行染色，紫外光下发荧光。紫外光下发荧光。每条每条DNADNA带中仅含带中仅含0.050.05g g微量微量DNADNA，也可以被清晰地检也可以被清晰地检测出来。测出来。加标准分子量DNA Marker,测定分子量加标准浓度的DNA，测定浓度图图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图脉冲电场凝胶电泳示意图 5. 2. 2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分子导入分子导入宿主细胞中。外源宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来

20、，并能进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。细菌转化（细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗而导致性状特征发生遗传改变的过程。传改变的过程。图图5-5 细菌转化及蓝白斑筛选细菌转化及蓝白斑筛选 为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取加其获取DNADNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞受态细胞（compe

21、tent cells）。CaCl2法法将快速生长期大肠杆菌置于经将快速生长期大肠杆菌置于经0预处理的低渗预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相相粘附。粘附。将该体系转移到将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外源下做短暂的热刺激，外源DNA就就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。养基上，筛选阳性克隆。转化效率可达到转化效率可达到51062107个转化子个转化子/g超螺旋质超螺旋质粒粒DNA。 电击法电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞

22、。电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的孔洞，介质中的DNA进入细胞质。进入细胞质。将生长至对数中期的将生长至对数中期的E. coli菌液冷却至菌液冷却至4后离心，后离心，洗 菌 后 用洗 菌 后 用 1 0 % 的 甘 油 悬 浮 ， 将 高 密 度 菌 液的 甘 油 悬 浮 ， 将 高 密 度 菌 液（21010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。）置于特制的电极杯中进行电击。获得最大转化效率时场强一般为获得最大转化效率时场强一般为12.515kV/cm，时间跨度一般为时间跨度一般

23、为4.55.5毫秒。毫秒。电击转化与温度有关，一般在电击转化与温度有关，一般在04进行。由于转进行。由于转化载体上常带有化载体上常带有LacZ基因，多用带有不同抗生素基因，多用带有不同抗生素的选择性培养基结合的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。细胞。 5. 2. 3聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术聚合酶链式反应是快速扩增聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。序列最常用的方法。PCR反应的模板反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就若是基因组上的某个片段，就称为称为genomic PCR，若是，若是mRNA反转录产生的反转录产生

24、的cDNA，就称为，就称为RT-PCR。图图5-7 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 图图5-8 PCR指数扩增时循指数扩增时循环次数与环次数与DNA产物数量的产物数量的比较比较1989年年12月，月， 著名的自然科学杂志著名的自然科学杂志“SCIENCE”将将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子年度分子”。主编主编Daniel Koshland Jr. 写道：第一篇有关写道：第一篇有关PCR的论的论文发表于文发表于1985年。自那以后，年。自那以后，PCR已经发展成为日益已经发展成为日益强大的和有广泛用途的技术。强大的和有广泛用途的技

25、术。 有了有了PCR，极少量，极少量遗传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、遗传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、可用于生化分析和鉴定的材料。可用于生化分析和鉴定的材料。PCR技术的原理技术的原理首先将双链首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链成两条单链DNA分子，分子，DNA聚合酶以单链聚合酶以单链DNA为模为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸和实验板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸和实验中提供的引物序列合成新生的中提供的引物序列合成新生的DNA互补链。互补链。 DNA解链（变性）解链（变性） 引物与模板引物与模板D

26、NA相结合（退火）相结合（退火） DNA合成（链的延伸）三步。合成（链的延伸）三步。经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段区段的拷贝数，理论上的最高值应是的拷贝数，理论上的最高值应是2n,实得实得1.8n.将含有待扩增将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温样品的反应混合物放置在高温（94）环境下加热）环境下加热1分钟，使双链分钟，使双链DNA变性，形变性，形成单链模板成单链模板DNA。94加热，淬火加热，淬火降低反应温度（退火，约降低反应温度（退火，约50），

27、约），约1分钟，使寡核分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶结合在靶DNA区段两端区段两端的互补序列位置上。的互补序列位置上。将反应混合物的温度上升到将反应混合物的温度上升到72左右保温左右保温1-数分钟，在数分钟，在DNA聚聚合酶的作用下，从引物的合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按板分子按53方向延伸，合成新生方向延伸，合成新生DNA互补链。互补链。There was a time when to amplify DNA,从前你要扩增DNA，You had to grow tons and tons

28、of tiny cells.总有培养大批细胞的重任要你背。Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,这时有个家伙叫Kary Mullis博士的，Said you can amplify in vitro just as well.他钻出来说体外合成也一样OK！Just mix your template with a buffer and some primers,只要把你的模板混上缓冲液，再加些引物，Nucleotides and polymerases, too.还有核苷和聚合酶。Denaturing, annealing, and exten

29、ding.变性，退火，和延伸。Well its amazing what heating and cooling and heating will do.加热冷却加热太神奇了！PCR, when you need to detect mutations.当你想要检测突变，来啊做PCR吧！PCR, when you need to recombine.当你想要基因重组，来啊做PCR吧！PCR, when you need to find out who the daddy is.当你想知道孩子他爹到底是谁，来啊做PCR吧！PCR, when you need to solve a crime当你

30、想要侦破大案，来啊做PCR吧！5. 2. 4 实时定量实时定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）由于由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。量不准确。90年代末期出现了年代末期出现了Q-PCR， 利用荧光检利用荧光检测测PCR仪绘制仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。的问题。混合在混合在PCR反应液中的荧光探针只有与大片段反应液中的荧光探针只有与大片段DNA结合后，才能够被激发

31、出荧光。结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成随着新合成DNA片段的增加，由于结合到片段的增加，由于结合到DNA上上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。非序列特异性荧光染料非序列特异性荧光染料SYBR Green I , 激发光波激发光波长长520nm。 SYBR Green I作探作探针的实时定量针的实时定量PCR实验过程图示实验过程图示 用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量A 扩增曲线循环数荧光强度Log值循环数B标准曲线Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。的绝对含量。 为确保荧光检测的确实是靶为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了仅能与目的，又设计了仅能与目的DNA特异结合特异结合的荧光探针。的荧光探针。TaqMan探针是一段与靶探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链序列中间部位结合的单链DNA，长，长50bp-150bp，该，该DNA的的5和和3端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移