限制性核酸内切酶(2)

1、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶一、概念概念核酸酶：催化核酸酯键的水解 。核酸外切酶:作用于核酸链的末端（3端 或 5端),逐个水解下核苷酸。核酸内切酶：从核酸分子内部切断3,5-磷酸二脂键。限制性内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶，可用于特意切割DNA,常作为工具酶。特性特性I I类内切酶类内切酶IIII类内切酶类内切酶IIIIII类内切酶类内切酶限制和修饰活限制和修饰活性性单一多功能的酶单一多功能的酶内切酶和甲基化内切酶和甲基化酶分开酶分开共同亚基的双共同亚基的双功能酶功能酶内切酶的蛋白内切酶的蛋白结构结构3 3种不同的亚基种不同的亚基单一成分单一成分2

2、2种不同的种不同的亚基亚基限制作用所需限制作用所需要的辅助因子要的辅助因子ATPATP、 MgMg2+2+和和SAMSAMMgMg2+2+ ATPATP、MgMg2+2+和和SAMSAM寄主特异性位寄主特异性位点识别序列点识别序列EcoBEcoB：TGA(N)TGA(N)8 8TGCT TGCT EcoKEcoK：AAC(N)AAC(N)6 6GTGCGTGC回文序列回文序列 （IIsIIs型除外）型除外）EcoP1:AGACC EcoP1:AGACC EcoP15:CAGC EcoP15:CAGC AG AG切割位点切割位点在距离识别位点至在距离识别位点至少少1000bp 1000bp 处随

3、机切开一条单处随机切开一条单链。链。位于寄主特异位于寄主特异性位点或其附性位点或其附近近距寄主特异性位距寄主特异性位点点33端端2426bp2426bp处处酶催转换酶催转换不能不能能能能能DNADNA易位作用易位作用能能不能不能不能不能甲基化作用的位点甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位寄主特异性位点点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进识别未甲基化的序列进行切割行切割能能能能能能序列特异的切割序列特异的切割不是不是是是是是基因工程中的用途基因工程中的用途无用无用十分有用十分有用用途不大用途不大 限制性内切酶以环状或线性的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识

4、别特定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的氢键也随之断开，产生具有3-羟基和5-磷酸基的DNA片段。 EcoR的识别序列 GAATTC CTTAAG Hind 的识别序列 AAGCTT TTCGAA BamH的识别序列 GCATCC CCTAGG 从以上举例的各种限制性酶切酶的识别序列看出，它们具有共同的规律性，呈旋转对称或二重互补对称。 有的限制性酶切酶可识别两种以上的核酸序列。 另外有一些限制性酶切酶随然来源不同，但是具有相同的识别序列，这样的限制性内切酶被称为同裂酶同裂酶。 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点

5、一般不能再被原来的酶识别。一般不能再被原来的酶识别。五 限制性酶切酶切割DNA的位点从切割位点处切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 产生粘性末端产生粘性末端EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端产生平齐末端 DNA DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDSSDS、EDTAEDTA等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。 1. DNA1. DNA的纯度的纯度 纯化

6、纯化DNA DNA 加大酶的用量加大酶的用量 延长酶催化反应的保温时间延长酶催化反应的保温时间 扩大反应体积（扩大反应体积（2020 l l）一般采取以下措施一般采取以下措施大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒dam甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰GATC中的中的A）；）； dcm甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰CCA/TGG的的C）。）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。的菌株。 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是多数是3737o oC C，少数要求，少数要求40-6540-

7、65o oC C。酶酶最适最适温度温度o oC C酶酶最适最适温度温度o oC C酶酶最适最适温度温度o oC CApa I Apa I Bcl I Bcl I Mae II Mae II Taq ITaq I30 30 50 50 50 50 6565Apy I Apy I BstE II BstE II Mae IIIMae III30 30 60 60 5555Ban I Ban I Mae I Mae I Sma ISma I50 50 45 45 2525 DNADNA分子的不同构型对限制性内切酶分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影响。某些限制性核酸的活性也有很大的影响。某

8、些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒内切酶切割超螺旋的质粒DNADNA所需要的酶量所需要的酶量要比消化线性的要比消化线性的DNADNA量高出很多倍。量高出很多倍。是影响限制酶活性的重要因素。是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。制酶一般都带有专用缓冲液。化学组成化学组成MgClMgCl2 2、NaCl/KClNaCl/KCl：提供：提供MgMg2+2+和离子强度和离子强度Tris-HClTris-HCl：维持：维持pHpH二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTTDTT）：保持酶稳定性）：保持酶稳定性牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSABSA等：有助于酶的稳定等：有助于酶的稳定如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号活性。如果改变反应条件就会影响酶的