第六章 色谱分析方法导论

1、气相色谱仪分析流程示意图（气相色谱仪分析流程示意图（5-25-2） o1-载气钢瓶；载气钢瓶；2-减压阀；减压阀；3-净化干燥管；净化干燥管；4-针形阀；针形阀；5-流量计；流量计；6-压力表；压力表；7-进样器；进样器；8-色谱柱；色谱柱；9-检测器；检测器；10-放大器；放大器；11-温温度控制器；度控制器；12-记录仪记录仪第六章 色谱分析法概论6.1 概述6.2 色谱过程与术语6.3 色谱分离的基本理论6.4 基本类型色谱法的分离机制6.5 色谱法的发展趋势6.1概述6.1.1色谱法的起源和发展1906年，俄国植物学家 M.Tswett 发表了他的实验结果：为了分离植物色素，他将含有植

2、物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，从而形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱色谱法(chromatography)。在此后的20多年里，几乎无人问津这一技术。到了1931年，Kuhn 等用同样的方法成功地分离了胡萝卜素和叶黄素，从此色谱法开始为人们所重视，相继出现了各种色谱方法。俄国植物学家茨维特7.1概述7.1.1色谱法的起源和发展Tswett植物色素分离实验图示：l样 品：植物色素l固定相：CaCO3颗粒l流动相：石油醚 流动

3、相石油醚混合色素叶绿素叶黄素胡萝卜素分离组分色谱柱固定相碳酸钙表7-1 色谱法的发展简史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn, Lederer用氧化铝和碳酸钙分离-,-,-胡萝卜素。色谱法受重视。1938Izmailov, Shraiber最先使用薄层色谱法。Taylor, Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin, Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气相色谱。1944Consden等等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱

4、进入实用阶段1952Martin, James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。(1952诺贝尔奖)1956Van Deemter等等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath, Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等等创立了毛细管电泳法。表7-2 色谱法起

5、过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代获奖学科获奖研究工作1937化学胡萝卜素化学，维生素A和B1938化学胡萝卜素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学医学关于神经元触处迁移物质的研究化学发现糖核苷酸及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究生理学医学抗体结构的研究o1906，俄国植物学家 M.Tswett 发明色谱法，色谱之父o1931，对液固吸附色谱的杰出贡献者库恩

6、，分离出60多种胡萝卜素，核黄素、维生素，获1938年诺贝尔化学奖o蒂塞利乌斯(Tiselius)因电泳分析和分析方法的研究，发现血清蛋白组分，获1948年诺贝尔化学奖o1941，马丁(Martin)和辛格(Synge)创始分配色谱特别是纸色谱而共获1952年诺贝尔化学奖o氨基酸自动分析仪发明人S.穆尔(Stanford Moore)和W.H.斯坦(William Howard Stein),定量分析方法解决了有关氨基酸、多肽、蛋白质等复杂的生物化学问题，获1972年诺贝尔化学奖1. 色谱法的定义 色谱法又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质(样品)与固定相和流动相之间的作

7、用力(分配、吸附、离子交换等)的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次“平衡”，使各溶质达到相互分离。固定相：在色谱分离中固定不动，对样品产生保留的一相。流动相：带动样品向前移动的另一相，与固定相处于平衡状态。6.1概述 6.1.2色谱法的定义与分类2. 色谱法的分类 根据流动相的状态将色谱法分成四大类。表17-3 色谱法以流动相种类的分类色谱类型流动相主要分析对象气相色谱法气体挥发性有机化合物液相色谱法液体溶于水或有机溶剂的各种物质超临界色谱法超临界流体各种有机化合物电色谱法缓冲溶液、电场离子和各种有机化合物6.1概述 6.1.2色谱法的定义与分类如粘度小、密度、扩散系数、溶剂化能

8、力等性质随温度和压力变化十分敏感：粘度和扩散系数接近气体，而密度和溶剂化能力接近液体。 1.按两相分子的聚集状态分类2. 按固定相的固定方式分类平面色谱纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱 色 谱 填充柱色谱 毛细管柱色谱 分配色谱： 利用分配系数的不同吸附色谱： 利用物理吸附性能的差异离子交换色谱：利用离子交换原理空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同3. 按分离机制分类流动相 固定相 类型液体 固体 液-固色谱液体 液体 液-液色谱气体 固体 气-固色谱气体 液体 气-液色谱液相色谱气相色谱 6.2色谱过程与术语6.2.1色谱过程6.2.2基本术语6.2色谱过程与术语6.2.1色谱过程色谱过程是物质

9、分子在相对运动的两相间分配平衡的过程。在混合物中，若两个组分的分配系数不等，则被流动相携带移动的速率不等，即形成差速迁移而被分离。如图所示。6.2色谱过程与术语6.2.1色谱过程o色谱过程的实质(1)色谱过程是吸附与解析的过程；(2)不同组分极性的差异导致吸附与解析的差异；(3)不同组分向前移动的过程是差异不断累积过程，是在动态中由量变到质变的过程。BAABBABBABABct流动相样品液色谱柱固定相检测器6.2色谱过程与术语6.2.2基本术语1.色谱2.保留值3.分配系数(K)和容量因子(k)4.分离参数6.2色谱过程与术语6.2.2基本术语1.色谱检测色谱分离后组分的响应信号对时间作图得到

10、的曲线称为色谱图。图7-2 色谱流出曲线AOAEGFH进样 空气峰C I DJtBh21h.6670h221/WW0tRRtt信号O01. 1. 关于色谱峰的术语关于色谱峰的术语示意图示意图峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差 0ootMtRtRA2 CIJABEGFHDW Wh/2空气峰空气峰进进样样6.2色谱过程与术语6.2.2基本术语1.色谱名词术语：色谱峰、基线、峰高h、标准偏差、峰宽W、半峰宽W1/2、峰面积A；包含信息：tR；h或A；,W1/2,W 。关系：W=4，W1/2=2.355，W=1.699W1/2，AOAEGFH进样 空气峰C I DJtBh21h.6670h221/WW

11、0tRRtt信号O0色谱术语：色谱术语：1）基线：在实验条件下，色谱）基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。基线时的流出曲线称为基线。基线在稳定的条件下应是一条水平在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的平直与否可反应的直线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。出实验条件的稳定情况。 2）峰高（）峰高（h）和峰面积）和峰面积 ：色谱峰顶点与：色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。色谱峰与峰底基线所基线的距离叫峰高。色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。围成区域的面积叫峰面积。6.2色谱过程与术语6.2.2基本术语2.保留值保留值 a.

12、死时间(t0) ：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据 t0 可求出流动相平均流速 0tLu 柱长死时间u b. 保留时间保留时间tr：试样从进样到出现峰极大：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间子的时间t0和组份在固定相中滞留的时间和组份在固定相中滞留的时间。c. 调整保留时间调整保留时间tr ：某组份的保留：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即是组份在固定相中

13、的滞留时间。即 由于保留时间为色谱定性依据。但由于保留时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留因此有时需用保留体积来表示保留值。值。 0rrttt d. 死体积V0：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项可得到：00coVt F000cwcorTppFFTpn其中，其中，Fco为柱出口的载气流为柱出口的载气流速速（mL/min)，其值为：，其值为：nF0-检测器出口流速；检测器出口流速；Tr-室温室温；Tc-柱温；柱温；p0-大气压；大气压；pw-室温室温时水蒸汽压。时水蒸汽压。

14、 e. 保留体积保留体积Vr：指从进样到待测：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。的流动相的体积。 0rcoVtF of. 调整保留体积 ：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。rV0rrrcoVVVtFg. 相对保留值相对保留值r2,1：组份：组份2的调整保留值与组份的调整保留值与组份1的的调整保留值之比。调整保留值之比。222,111rrrrtVrtVn注意：注意：r2,1只与柱温和固定相性质有关只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长，而与柱内径、柱长L、填充情况及流、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，动相流速无关，因此，

15、在色谱分析中，尤其是尤其是GC中广泛用于定性的依据！中广泛用于定性的依据！具体做法：固定一个色谱峰为标准具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然，然后再求其它峰后再求其它峰 i 对标准峰的相对保留值对标准峰的相对保留值，此时以，此时以 表示：表示：( )( )rst it sn 1, 又称选择因子。又称选择因子。 h.h. 区域宽度：色谱峰的区域区域宽度：色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，可用于衡量色谱柱的柱效及反一，可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。映色谱操作条件下的动力学因素。宽度越窄，其效率越高，分离的效宽度越窄，其效率越高，分

16、离的效果也越好。果也越好。o区域宽度通常有三种表示方法：o标准偏差：峰高0.607 倍处峰宽处的一半。o半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354 o峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。W= 46.2色谱过程与术语6.2.2基本术语3.分配系数(K)和容量因子(k) 分配系数(K)：色谱过程中，在流动相和固定相中的溶质分子处于动态平衡。平衡时组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(c)之比，称为分配系数(K)。msccK 分配系数的物理意义：表示平衡态下，组分在固定相和流动相的浓度之比，也叫做分配平衡常数。其中，在吸附色谱中称为吸附系数(Ka)；在离子交换色谱中称

17、为选择性系数(Ks)；在凝胶色谱中称为渗透系数(Kp)。分配系数的差异是所有色谱分离的实质性的原因。 6.2色谱过程与术语6.2.2基本术语3.分配系数(K)和容量因子(k) 容量因子(k) ：在平衡状态下，组分在固定相(s)与流动相(m)中的质量之比，称为容量因子。色谱柱的容量因子是溶质分子与色谱柱填料相互作用强度的直接量度，由下式定义： )()1 (-BA00000msmmsskkttktttttttkVVKVcVckRRRR，6.2色谱过程与术语6.2.2基本术语4.分离参数 分离因子()：即相邻两个组分调整保留值之比，又称为分配系数比或选择性系数比。 分离度 (Rs)：相邻两个组分的色

18、谱峰，其保留时间差与两峰峰底宽平均值之商。;12121212KKkkVVttRRRR。122112WWttRRRs6.2色谱过程与术语6.2.2基本术语4.分离参数o色谱分析的目的就是要将混合物中的各组分分离，为了获得较好的准确度，一般规定两相邻峰的分离度 Rs1.5时，可认为两组分完全分离。6.3色谱分离的基本理论6.3.1 分配系数与保留行为的关系6.3.2 等温线6.3.3 塔板理论6.3.4 速率理论6.3.5 影响分离度的因素6.3色谱分离的基本理论6.3.1分配系数与保留行为的关系推导色谱过程方程：在实验条件一定时，保留时间tR取决于分配系数K，也就是取决于组分的性质，所以，保留时

19、间是对组分进行色谱定性的指标。msRRmsmmssVVKttkttVVKVcVck1100色谱过程方程：，保留时间：，容量因子：Vs固定相的体积Vm流动相的体积K,tR,组分后出柱K0， 组分不保留K,组分完全保留6.3色谱分离的基本理论6.3.2等温线等温线： 在一定温度条件下，组分在固定相和流动相的分配达到平衡时，在两相中的浓度之比值K为常数，由此绘制出的cs与cm的关系曲线称为等温线。aK=cs/cmbccscmtRcb前延峰a正常峰c拖尾峰6.3色谱分离的基本理论6.3.2等温线对称因子：u完全对称：fs=1.00u对称峰：fs=0.951.05u前沿峰：fs0.95u拖尾峰：fs1.

20、05图7-5 对称因子的计算ABAAWfhs2205. 0Wh/2h0.05hW0.05hAB1.塔板理论的基本假设2.塔板理论的计算公式3.塔板理论的优点和局限6.3色谱分离的基本理论6.3.3塔板理论6.3色谱分离的基本理论6.3.3塔板理论1.塔板理论的基本假设o色谱柱是由一系列连续、等距的水平塔组成，在柱内每层塔板内部，组分能够在流动相和固定相两相中达到平衡。o流动相通过色谱柱呈间歇式前进运动，每次前进为一个塔板体积。o样品和流动相同时加在第一个塔板上，且样品垂直于前进方向的扩散(即纵向扩散)可以忽略。o分配系数在各塔板上是常数。6.3色谱分离的基本理论6.3.3塔板理论1.塔板理论的

21、基本假设塔板理论的这些假设，实际上是把组分在两相间的连续转移过程，分解为间歇地在单个塔板中的分配平衡过程，经过多次分配平衡后，分配系数小的组分先达到塔顶(即挥发性大的组分先流出色谱柱)。色谱柱的塔板数可高达几千甚至几万，使被测组分在分配系数间有微小的差别时就可以得到分离。6.3色谱分离的基本理论6.3.3塔板理论1.塔板理论的计算公式 理解：在tR一定时，W或W1/2越小(即峰越窄)，理论板数n越大， 理论板高越小，柱的分离效率越高。有效理论塔板neff也同此理。因此，理论塔板数是评价柱效能的指标。；22/12222/122254. 51654. 516WtWttnWtWttnnLHHLnLH

22、RRReffRRReffeff推导有效理论塔板数：推导理论塔板数：有效理论板高：理论塔板数：理论板高：6.3色谱分离的基本理论6.3.3塔板理论3.塔板理论的优点和局限优点：塔板理论是半经验性理论，在解释流出曲线的形状、浓度极大点的位置、评价柱效高低等方面是成功的。局限：塔板理论的基本假设与事实不完全相符，它无法解释谱带扩展的原因，也无法解释色谱过程与流动相流速、柱内分子扩散传质过程以及色谱操作参数等动力学因素的关系。这些问题，在速率理论中得到了圆满的解决。为了克服塔板理论的缺陷，Van Deemter等在Martin等人的工作基础上，比较完整地解释了速率理论。后来，Giddings等又作了进

23、一步的完善。速率理论充分考虑了溶质在两相间的扩散和传质过程，更接近溶质在两相间的实际分配过程。 当溶质谱带向柱出口迁移时，必然会发生谱带展宽。谱带的迁移速率的大小决定于流动相线速度和溶质在固定相中的保留值。同一溶质的不同分子在经过固定相时，它们的迁移速率是不同的，正是这种差异造成了谱带的展宽。谱带展宽的直接后果是影响分离效率、降低检测灵敏度，所以，抑制谱带展宽就成了高效分离追求的目标。 引起谱带展宽的主要因素有：涡流扩散；纵向扩散；传质阻力。这些因素都统一于Van Deemter方程中。6.3色谱分离的基本理论6.3.4速率理论6.3色谱分离的基本理论6.3.4速率理论Van Deemter方

24、程BCAHCuuBAH2最小符号名 称单位H塔板高度cmA涡流扩散项cmB纵向扩散系数cm2s-1C传质阻力系数 s u载气线流速cms-1图17-6 范氏方程中各项对板高的贡献0tLu Van Deemter方程方程中各项的意义符号名称关系式备 注A涡流扩散项(多路径项)A=2dpdp：固定相颗粒平均直径；：涡流扩散因子，与填充的均匀性有关B/u纵向扩散项(分子扩散项)B=2rDgr ：曲折因子，反映固定相颗粒的空间结构。填充柱r0.5-0.7,空心柱r1；Dg ：组分分子在载气中的扩散系数Cgu气 相传质阻力项k：容量因子Clu液 相传质阻力项df ：固定液液膜厚度，Cl： 组分在固定液中

25、的扩散系数gpgDkdkC222101. 0()lflDdkkC222+18=6.3色谱分离的基本理论6.3.4速率理论引起谱带展宽的主要因素引起谱带展宽的主要因素(1)涡流扩散(2)纵向扩散(3)传质阻力6.3色谱分离的基本理论6.3.4速率理论引起谱带展宽的主要因素(1)涡流扩散：引起涡流扩散的原因是色谱柱内的多路径。溶质分子在前进过程中形成的这种紊乱类似于涡流的流动，所以称之为涡流扩散。A=2dpo空心毛细管柱无多径相：A0 ABC柱管壁 固定相 组分移行轨迹初始带宽谱带展宽流动相方向6.3色谱分离的基本理论6.3.4速率理论引起谱带展宽的主要因素(2)纵向扩散：引起纵向扩散的原因是浓度

26、梯度。纵向扩散是溶质分子在移动方向上向前和向后的扩散，引起谱带展宽。它是由浓度梯度所引起。纵向扩散引起的峰展宽由下式决定：纵向扩散引起的色谱峰展宽示意图uDuBg2o式中B2Dg，为纵向扩散系数；为弯曲因子或阻碍因子，填充柱0.50.7，毛细管1；Dg为溶质在流动相中的扩散系数；u 为流动相线速度。随着样品带在固定相中的移动，因纵向扩散使样品带宽逐渐增加，相应得到的色谱峰就越来越宽而矮。6.3色谱分离的基本理论6.3.4速率理论引起谱带展宽的主要因素(3) 传质阻力引起的扩散 传质阻力系数C，是溶质在固定相中传质阻力系数(Cl)与流动相(气相)传质阻力系数(Cg)之和：CClCg流动相传质阻力

27、引起的扩散溶质分子要从流动相转移到固定相中，就要从流动相主体扩散到气液、气固、液液或液固界面，阻碍这一扩散过程的阻力称流动相传质阻力。流动相传质阻力引起的谱带展宽程度由下式决定：gpgDkdkC222101. 06.3色谱分离的基本理论6.3.4速率理论引起谱带展宽的主要因素(3) 传质阻力引起的扩散固定相传质阻力引起的扩散溶质分子到达两相界面后，将继续扩散到固定相内部达到分配平衡，然后又返回到两相界面。溶质在这一移动过程中的阻力称固定相传质阻力。固定相传质阻力引起的谱带展宽由下式决定：lflDdkkC222)1 (86.3色谱分离的基本理论6.3.4速率理论结论： Van Deemter方程

28、说明了色谱柱填充均匀程度、载体的性质与粒度、载气种类与流速、固定液层厚、柱温等对柱效的影响，对分离条件具有指导意义。ggDrkkkC2022)1 (241161lflDdkkC22)1 (32uDdCDdCDdCuDCdHmpsmsfsmpmmdp2222Giddings方程(液相色谱) Golay方程(空心柱气相色谱) uCuCuBHlg6.3色谱分离的基本理论6.3.5影响分离度的因素c b a 11422skknRABBABBAA原始状态增加 k增加 n增加6.3色谱分离的基本理论6.3.5影响分离度的因素 在保持色谱条件不变的情况下，从分离度方程式可以推导出柱长与分离度的关系式2122

29、1LLRR6.4基本类型色谱法的分离机制6.4.1吸附色谱法6.4.2分配色谱法6.4.3离子交换色谱法6.4.4空间排阻色谱法6.4基本类型色谱法的分离机制6.4.1吸附色谱法吸附色谱法利用固体吸附剂作为固定相，最常用的固定相是硅胶。它利用被分离组分对固定相表面活性中心吸附能力的差别而实现分离。吸附平衡：Xm + nYa Xa + nYmmXaXnamnmaaVnSnYXYXKma吸附系数：常数分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离。过程：吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分离mXmYmaaX图710吸附色谱示意图 X.溶质分子溶质分子 Y.流动相分子流动相分子 a. 吸附剂吸附剂 m.流动相流动相6.4基本类型色谱法的分离机制6.4.1吸附色谱法要求：固定相机械吸附在惰性载体上的液体；流动相必须与固定相不为互溶；载体惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应。分离机制：见图示 狭义分配系数狭义分配系数mXsXmsVnVnCCKmsn 注：K与组分的性质、