我们实验室用的银染方法

1、我们实验室用的银染方法1.50%甲醇浸泡15分钟(置于摇摆床上,以下省略,本步骤两次,每15分钟更换一次)2.10%甲醇浸泡10分钟 3.水漂洗3次,每次数秒4.2M  DTT溶液浸泡20分钟%硝酸银溶液浸泡20分钟6.水漂洗3次,每次不超过15秒(每次约150ML)7.显色液漂洗3次,每次不超过15秒(每次约100ML)8.显色液浸泡显色至看到目的蛋白带(约200ML)9.10G柠檬酸定影显色液:15G无水碳酸钠溶于500ml水,用前加入250L福尔马林搅拌均匀水用双蒸水就可以,纯度越高越好,其他试剂用分析纯,据书上说甲醇用化学纯的比分析纯更灵敏此方法出自冷泉港蛋白质技术

2、指南(实际上是其蛋白质技术会议的总结)灵敏度稍低于分子克隆上老方法,但是非常方便,也比其他方法快速,只需要1.5小时,我染出来的胶非常漂亮,有需要的话可以上传给大家看看一般来说，高背景是由于杂质产生的，银染的水质很重要，最好要用去离子水或双蒸水，装胶的器皿也一定要洗得很干净。固定、银染之后均需充分的漂洗。其实银染就是银镜反应，可能是你的样品浓度高，所以白了，浓度更高还会变成一条能反光的带。固定时间不需加长，我有时来不及还减少固定时间，银染关键是器皿和溶液干净，显色前胶一定要漂干净大板本来效果就差点，浓度越大，条带形状越差，这也很正常，银染薄点的胶效果要好些，因为染的是表面的蛋白1. 取下凝胶,

3、蒸馏水冼胶30秒.2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.材料没什么要求，玻璃会更好一点，但不好搞到，我们是见到什么大小合适就用什么。液体的量一般是胶体积的5倍，比如13×13×0.1cm的胶，用一百ml一定够，80也行。我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，% 硝酸银染色10分钟.3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）4.显色液显色15秒,换

4、用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。我的做法是这样的，染色效果还可以10%的乙醇固定10分钟，ddH2O洗一次， 2分钟。1%的硝酸脱色4分钟，ddH2O洗两次，每次1分钟。0.2%AgNO3染色20分钟，ddH2O洗三次，每次1分钟。NaCO3-甲醛显色至条带出现。我的感觉是乙醇和硝酸重复使用的次数不要太多，这样效果不好，NaCO3-甲醛得质量很关键，我们有一次换了试剂，效果非常差银染法分以下几个程序： 1、固定 2、敏化 3、银育 4、显影

5、 5、停显 此外，其间还有数步的漂洗程序。 在你的银染方法中没有敏化过程，不过也中可以的，只是灵敏度会下降。 银染法还可分为碱性银染和酸性银染法，为何称为酸法？是指硝酸银这一强酸弱碱盐溶液因水解呈酸性而得名？ 何为二胺类银染法？俺知道有银铵法，即在硝酸银溶液中加入氢氧化钠，银离子在氢氧化钠的作用下生成氢氧化银沉淀，后加入过量氨水，形成可溶的银铵络和物，而后者经甲醛还原为单质银颗粒。二胺法可是指此络和物为二铵盐？您这里的“胺”应为“铵”。 至于敏化作用，众说纷纭，且银染的灵敏度相当高，对常规分子生物学实验已是牛刀小用，敏化俺认为还是不用的好，因为对背景不利。 对于银染的研究在80年代的elect

6、rophoresis杂志中多有报道。 小经验：为便于控制显影速度，得到最佳的信噪比，银染的显影液温度不要过高，以10度左右为宜，高则易显影过度，背景深，低则显影时间长。 请兔子兄将您的大作上传，大家学习学习。有人建议在显色液中加0.02%的硫代硫酸钠来降低背景，我还未实践，不知牛兄和兔兄有无此经验？还有灌胶用的玻璃板是否已经洗干净。染色液:1g硝酸银、1升水显影液：20g氢氧化钠、0.4g碳酸钠、4ml甲醛、1升水步骤：1、将要染的胶板用水清洗1015s          2、放入染色液中摇床轻

7、摇810min3、用水清洗1015s，再加入少许显影液摇1015s          4、放入显影液中摇床轻摇5min左右直至条带清晰。此种方法染出的胶底色淡黄，带清晰。不足之处就是不易保存，在胶干透之前最好拍照或扫描。固定:% 乙醇+.%冰醋酸 分钟染色: .% gNO3 + 10% 乙醇+0.5% 冰醋酸 12分钟清水漂洗 10-15s 显色： 3% NaOH + 0.5% 甲醛（用时加）10min左右对比以后觉得比那个用Na2CO3显色的方法好多了，无论是花费的时间还是银染的效果。呵，传张

8、胶的照片佐证啊！顺便请教一下各位，为什么我跑电泳的时候靠近电极的一端总是比另一端慢呢？电压太高？你这样显色是不规范的，具体显色步骤如下： .3  银染 （1）固定：将粘胶的玻璃板（胶面向上）置于固定/终止液（10%冰醋酸溶液），振荡20分钟左右至指示剂颜色脱掉为止。 （2）清洗：用蒸馏水振荡洗涤凝胶3次，每次5分钟，凝胶板从水中取出后，竖直控水15秒。 （3）染色：将胶板移至染色液（1gAgNO3溶于1L水，加入37甲醛1.5ml（用时加），轻摇35分钟。 （4）显影：将染色后的凝胶板放入蒸馏水中2-3秒，迅速取出并竖直控水，随后把胶板放入预冷的显影液中（30g无水Na2C

9、O3溶于1L水中，放在4预冷，使用时加入1.5ml 37甲醛和200ul硫代硫酸钠（10mg/ml）。振荡显影至条带颜色深浅合适。 （5）定影：将胶板放入第一步反应的固定/终止液中，轻摇7-8分钟。 （6）清洗：用蒸馏水清洗几分钟，取出晾干。 （7）扫描胶，找出差异带，并进行条带统计甲醛在银染当中的作用，求教各位大侠在此发表自己的一点拙见：，关于甲醛在银染中的作用：在显色步骤（developing)中：甲醛的作用是充当还原剂，反应式如下：- 2e-，失电子而g+得电子在银染步骤中（impregnation)中，其作用主要是增敏原理偶不是非常清楚，应该是加速与蛋白质结合的g+的还原。有文献讲到过

10、（很老的了，找不到了，应该是ELECTROPHORESIS上年代的文章，上世纪），低浓度甲醛与蛋白质的结合是可逆的，其并不阻止蛋白质氨基酸残基与g+结合；而高浓度甲醛与蛋白质的结合不可逆，而且造成蛋白质广范围交联（是不是有点类似于戊二醛？），并抑制Ag+与蛋白质的结合，同时甲醛不能被释放出来用于还原。至于究竟具体是什么机制造成与质谱不兼容，偶也不知道（不好意思的说）想说的一点是，既然两种方法都已经证明optimized for maldi-tof，那么应该都没有问题，如果您还有狐疑，那么，用amersham的方法吧，毕竟人的心态都更倾向于保险硫代硫酸钠：增敏时形成潜像硝酸银：形成显色的像素点甲

11、醛：还原剂，将银离子还原为零价银。终止液：一种配方中的EDTA将银螯合，另一种配方的HAc改变pH，使甲醛在酸性pH下的还原能力降低，（个人经验：HAc终止反应不是很彻底，有一次我用HAc终止反应，但没有更换buffer，结果过夜放置后胶变黑了）一点看法，抛砖引玉。 一个高灵敏度的质谱相容性银染法这种方法不用戊二醛，所以是质谱相容的，而且由于甲醛用量很低，其质谱相容性高于其它的相容性银染方法；灵敏度可以与双胺法银染相近，但比双胺法稳定，基本上没有负染现象，值得一试！for 1mm  SDS  PAGE：固定：50%甲醇，5%乙酸  &

12、#160;             20min醇洗：50%甲醇                                10min水洗：ddH2

13、O                    10min    敏化：0.02%硫代硫酸钠             1min水洗：ddH2O        

14、0;                            2×1min银染：冰冷的0.1%AgNO3                  

15、20min（4）      （我是把它扔到冰箱里染的）水洗：ddH2O                                      2×

16、1min显影：0.04%  37%甲醛，2%无水碳酸钠    显影至蛋白点清晰   这一步要注意在液体变黄时及时更换新鲜的溶液，一般要换四次左右，头几次很快，第一次可能只要几秒就黄了停显：5%乙酸保存：1%乙酸对于1.5mm的胶：固定：50%甲醇，5%乙酸 20min醇洗：50%甲醇 10min水洗：ddH2O                 &#

17、160;                    2×10min    敏化：0.02%硫代硫酸钠            2min水洗：ddH2O       &

18、#160;                             3×1min银染：冰冷的0.1%AgNO3                

19、0;  30min（4） （我是把它扔到冰箱里染的）水洗：ddH2O                                      3×1min显影：0.04%  37

20、%甲醛，2%无水碳酸钠 显影至蛋白点清晰   约十分钟，期间注意及更换新鲜溶液，保持溶液不变黄！  停显：5%乙酸保存：1%乙酸除了银染外，全过程均需摇动。是我用过最好的银染法，我用过双胺法，安玛西亚的方法，还有其它 的一些，安玛西亚的方法加戊二醛时的灵敏度只与此方法相当，约为考染的50100倍，胶体考染的10倍，锌负染的两倍。希望大家都能重视它，多试多使用我们实验银染的方法很简单，好象大家做的效果都很好！你也可以试试。1.50%的甲醇摇30分钟2。5%的甲醇摇10分钟3.用水快速洗3次4.用10 uMde  DTT浸泡20分钟5.用

21、0.1%的AgNO3浸泡20分钟6.用水快速洗1次。用显影液（取15g的无水Naco3，溶于500ml水中，临用前加250uml的37%的甲醛）洗2次，每次不超过15秒。7.在显影液中浸泡数分钟，直至蛋白带出现。8.加柠檬酸终止我用的是这种方法：1. Fix gel in 50% MeOH, 5% HAc for 20 mins.2. Wash gel in 50% MeOH for 10 mins.3. Wash gel in H2O for 2 hrs.Additional washing over night will reduce backgroundstaining.4. Sensi

22、tize gel in 0.02% Na2S2O3 for 1 min.5. Wash gel in H2O for 1 min.6. Wash gel in H2O for 1 min.7. Incubate gel in cold 0.1% AgNO3 for 20 mins.8. Wash gel in H2O for 1 min.9. Change gel chamber10. Wash the gel in H2O for 1 min.11. Develop gel in 0.04% formalin, 2% Na2CO3Observe the color and change so

23、lution when the developerturns yellow. Terminate when the staining is sufficient.12. Terminate staining in 5% HAcChange the solution a couple of times13. Leave the gel at 4ºC in 1% HAc前，步的时间可以延长或者缩短我觉得以前失败的原因可能是没有掌握水洗的时间，以及与水的纯度可能有关我也做过两次,效果不好.虽然有带,但带感觉是透明的,孔道和背景是暗的.楼主,祝贺你!多指教呀!水的质量也是比较重要的，不然背景

24、会很深的，银染时间太长的话，背景也会很深。而且水洗的时间好像不能太长哦，宁愿多洗几次1分析型银染(不能用于质谱鉴定)-科学通报,2000,45:170-178(1)水洗胶5min(2)40%乙醇,10%乙酸固定1h(3)5%乙醇,5%乙酸固定过夜(4)水洗20min,重复2遍.(5)5%戊二醛1h(6)水洗30min,重复4遍(7)250ml新鲜配制的银氨液(1ml NaOH与5ml饱和氨水混合再加10ml 20%硝酸银)/胶45min(8)水洗3min,重复3遍(9)1.5ml 1%柠檬酸,125ul 37%甲醛/胶显色.(10)5%乙酸停显10min(11)水洗10min,重复3遍.2快速

25、银染(和质谱鉴定相匹配)-Electrophoresis,2000,21:3666-3672(1)水洗5min(2)40%乙醇,10%乙酸重复固定15min,重复2遍(3)30%乙醇,0.2硫代硫酸钠,6.8%乙酸钠30min(4)水洗5min,重复3遍(5)2.5%碳酸钠,0.04%的福尔马林(36%甲醛溶液)显影至背景出现(6)1.46% EDTA 溶液停显10min(7)水洗10min,重复3遍.一般可以分成两类，一类以氨银络化物为银染剂，一类以硝酸银为银染剂前者灵敏度较高，但不太稳定，且对酸性蛋白不敏感，要用大量的戊二醛，对质谱不利。后者的具体方法有很大的变化，其中隔壁帖的EMBL方法

26、是我用过最好的，不用戊二醛且灵敏度与前者相近，强烈推荐！冷泉港蛋白质纯化与鉴定书上方法：15%甲醇浸泡两次，每次15MIN5%甲醇浸泡10MINDDH2O洗2次DTT浸泡20MIN（2UL 1M DTT=>200ML）转移胶到硝酸银溶液中浸泡20MIN（20%硝酸银1ML=>200ML）DD水洗3次，每次15S，显影液洗3次，每次15S200ML显影液显影10G柠檬酸定影显影液=15g无水碳酸钠=>500ML，用前加250UL甲醛混匀总时长1.5小时1  固定：        

27、  40乙醇  10醋酸                             10分钟2  漂洗            石英水 

28、;                                        10分钟3  固定和敏化：    0.05%  

29、戊二醛      0.0037%甲醛   乙醇40%      5分钟4  漂洗：          40    乙醇               &

30、#160;                   20分钟5  漂洗：          双蒸水                 &

31、#160;                       20分钟6  敏化：          硫代硫酸钠 0.2克/ L           

32、60;                 1分钟 7  漂洗：          石英水                   

33、60;                     1分钟  8  漂洗：          石英水             

34、0;                           1分钟 9  银染:            0.1硝酸银       &

35、#160;                            20分钟10 漂洗：          石英水                              &#