分子细胞生物学——细胞周期调控

1、分子细胞生物学细胞周期调控第四节 细胞周期调控 细胞周期调控有两大机制：细胞周期驱动机制(时顺调控机制)；细胞周期监控机制(检查点调控机制)。 细胞周期调控的关键点：、 细胞周期调控是一个非常复杂和精细的调节过程，有大量调节蛋白参与其中。 此过程的核心是一组细胞周期依赖性蛋白激酶(CDKs)，而CDKs调节的关键步骤是细胞周期检查点。 细胞周期调控由信号传导通路来实现，并决定细胞的分裂、分化和凋亡等过程。细胞周期调控一、细胞周期时顺调控二、细胞周期检查点调控三、细胞周期同步化一、细胞周期时顺调控 细胞周期调控的关键物质是细胞周期蛋白(cyclin)，周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin dep

2、endent kinase, CDK)和CDK的抑制性蛋白(CDKI)。 不同分子的cyclin和 CDK及CDKI 与其他相关调控蛋白精确调控细胞周期的每一个时相。 细胞通过调节cyclin的水解和Cdks的连续激活和灭活来实现周期调控。 （一）细胞周期蛋白 细胞周期蛋白 cyclin，也称周期素、循环素，指合成和降解与细胞周期相关，并能与相应的Cdk形成复合物的一类蛋白。它们与细胞周期依赖性激酶(Cdk)形成复合物以决定激酶特异性和酶活性。 脊椎动物已发现10余种： cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3，cyclin E1、cyclin E2 cyclin A1、 c

3、yclin A2、cyclin A3、 cyclin B1、cyclin B2，cyclin C，cyclin G， cyclin H 。 cyclins均含有由100150个氨基酸残基组成的保守区，称为周期蛋白框(cyclin box)，是介导周期蛋白与CDK结合的活性区域。 此外， cyclins还可含有由降解盒(destruction box)或PEST序列(脯-谷-丝-苏)，用于决定其降解途径以调节周期蛋白的水平。 按周期素表达及作用的细胞周期阶段的不同，可将其分为G1期 (C、D、E)和M期(A、B)两大类。 cyclins分子结构特点周期蛋白分子结构Cyclin D 家族 含有3个

4、成员cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3在G1期开始表达，分裂后期降解。 与CDK2、CDK4、CDK6组成复合体，是启动细胞由G1期向S期转换的关键因子。Cyclin E 家族 有cyclin E1和cyclin E2两种。 其表达水平在G1/S调控点达峰值。 与CDK2、CDK3结合，启动DNA复制。Cyclin A 家族 包括cyclin A1、 cyclin A2和cyclin A3 在S期开始表达，G2期达高峰，M期的中期降解。 与CDK2结合， 启动DNA复制。Cyclin B 家族 含有2个成员cyclin B1和 cyclin B2。 在G2末期开始表达，

5、 M期的中期达高峰，M期的后期降解。 与CDK1、CDK2结合， 促进G2期向M期转换。Cyclin H 家族， cyclin H 的表达在整个细胞周期过程中不呈周期性变化。 与CDK7结合，组成CAK。 激活CDK、磷酸化RNA-pol 的CTD，调节基因转录。Cyclin C 家族 与CDK8结合，组成CAK，激活CDK。细胞周期蛋白水平变化 周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase)是指与周期蛋白结合才具有酶活性的激酶类。现已发现10余种。（二）周期蛋白依赖性激酶 在细胞周期中，CDK的表达量相对恒定，但以非活性的形式存在，在细胞周期特定的时间与周期素特异地结合

6、，一种CDK能与多种cyclin结合，以复合体的形式发挥作用。 CDKs是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，称为CDK19。 CDK常以使底物磷酸化的形式起作用，其效应是多方面的，包括DNA合成的启动和终止，染色体的凝集、运动和松懈，核膜、核仁的崩解和重新形成，核纤层的降解和重新聚合，纺缍体的形成和消失等。 各种CDK分子在进化上高度保守，都含有一段类似的CDK激酶结构域，其中一段PSTAIRE的序列相当保守，与周期蛋白的结合有关。另外，都有多个磷酸化位点，位点的磷酸化与激酶的活性有关。 CDK催化活性的激活： CDK与周期素结合 保守苏氨酸残基磷酸化修饰 CDK催化活性的抑制： N-端氨基酸残基的

7、抑制性磷酸化 抑制蛋白与其结合(是主要的抑制性调节) CDK的催化活性受到激活因素与抑制因素两方面的调节。CDK的调节物包括：cyclin、CKI、CDK调节分子、CAK和磷酸酶等。（三） CDKs 激活激酶 CAK (CDK activating kinase)有2种： cyclin H-CDK7 及 cyclin C-CDK8。 CDKs 的激活需要与特异性亚基cyclins 结合，并被cyclin H-CDK7-MAT1三元复合物(CAK)磷酸化。 CDK7-cylin H-MAT1也是转录因子H(TFH)的亚基组成部分，磷酸化RNA 聚合酶(RNAP )大亚基的C-末端结构域 (CTD

8、)。p27能阻止cyclin H-CDK7的催化作用。 CDKI分为两大家族： INK4 ( Inhibitor of CDK4) CIP/KIP (Kinase inhibition protein)（四）CDK抑制因子 CDK抑制因子(CDK inhibitor, CDKI或CDI、CKI)是一类细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂、主要对细胞周期起负性调控作用，大部分都是抑癌基因的编码产物，以多肽的分子量大小来命名。 1、Ink4 (Inhibitor of Cdk 4) P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d等，能专一性的与CDK4和CDK6结合，并阻止其与周期素

9、的结合反应，从而特异地抑制CDK4-cyclin D1、CDK6-cyclin D1复合物的活性，使细胞停留于G1期。 p15、p16受TGF的调控，p18 、p19的表达受p53的调控 。 2、CIP/KIP (Kinase inhibition protein) P21cip/waf1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2 等，含一相似的 60 个氨基酸抑制区，能抑制所有G1和S期CDK的激酶活性。 P57是CDK2的抑制剂。 P21cip/waf1除抑制CDK的激酶活性外，还能

10、与DNA聚合酶的辅助因子PCNA (proliferating cell nuclear antigen)结合，直接抑制DNA的合成。 P53可促进P21cip/waf1的表达，因P53是WAF1/CIP1基因的转录激活因子。 P27能与几乎所有的cyclin-CDK复合物结合，抑制其蛋白激酶活性，使细胞停留于G1期。其作用机制是抑制cyclin H-CDK7等CAK的活性。 p27的表达受TGF的调控，还受cAMP的调节。the G1 Cdk complexes;G1/ S-phase Cdk complexes;the S-phase Cdk complexes;the mitotic C

11、dk complexes.5. APC(anaphase promoting complex) （五）细胞周期调控复合物 Cyclin-CDK复合物及其相关蛋白细胞周期调控复合物（六）细胞周期运转细胞周期运转依赖于调控复合物活性的周期性变化。 细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使PRb被磷酸化而失活，释放出转录因子E2F， E2F进入细胞核内，使促进G1期转入S期所需的调控基因开始转录。当细胞进入S期后，cyclin D被磷酸化后由SCF泛素化途径降解。1. 细胞周期的启动 PRb是由Rb抑癌基因编码合成的蛋白质，有低磷酸化型和高磷酸型两种型式。低

12、磷酸化型的PRb可与转录因子E2F形成复合体，抑制其转录激活作用，阻止细胞分裂；而高磷酸化型的PRb则不能与E2F形成复合体。催化 Rb由低磷酸化型转变为高磷酸化型的蛋白激酶就是各型CDK。 在G1-S期，cyclinE在G1期到S期的早期与CDK2结合，启动DNA的复制，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。 细胞进入S期后，cyclin E由依赖SCF的泛素化途径降解。 在S期，cyclinA与CDK2结合，维持S期DNA合成。 cyclin A是在S期和G2期稳定存在的cyclin 。 2、细胞周期由G2期过渡到M期 在G2-M期，cyclin B在细胞周期G2的中晚期逐渐积累，cycl

13、inA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化(如组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件)，使得细胞进入M期。 不同类型的M期细胞中分别提取出了能够促进细胞分裂的因子，统称为M期促进因子或成熟促进因子 (M- phase promoting factor ， maturation promoting factor，MPF)， 即the mitotic Cdk complexes 。 MPF由细胞周期蛋白cyclinA/B和周期蛋白依赖激酶Cdk1 (p34cdc2)组成。M期促进因子(MPF) MPF活性在细胞分裂中呈周期性改变。当细胞处于

14、间期时，检测不到 MPF活性；处于分裂期时MPF具有活性。MPF以无活性的前体形式存在，其活化依赖于Cdc25磷酸酶的出现。 Cyclin levels fluctuate; CDK levels are constant. 在中期当MPF活性达到最高时，通过某种途径激活APC(一类泛素连接酶E3)，将泛素连接在cyclin上，导致cyclin被蛋白酶体识别和降解，从而完成细胞分裂，完成一个细胞周期。 3、细胞周期M期的过渡 细胞通过M期需要cyclin A和cyclin B的降解，若cyclin A不被降解则会引起细胞周期停止在M期的中期。如果cyclin B的降解受到抑制，将会使细胞周期停

15、滞在M期后期。 Cyclin A和Cyclin B都是经依赖APC泛素化途径所降解。细胞周期中Cyclin B的合成与降解（七）泛素介导cyclins降解与细胞周期 cyclins的泛素化途径可分为两类： 依赖SCF(Skp1-Cullin-F-box protein)的泛素化途径 依赖APC/C (Anaphase promoting complex)的泛素化途径。 cdc(cell division cycle)基因： 是指那些表达水平随细胞周期性变化或者表达产物直接参与细胞周期调控的基因。 泛素(Ubiquitin)是由76个氨基酸组成的一种小蛋白，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素

16、。其主要功能是标记需要降解掉的蛋白质，使其被水解。 蛋白质的泛素化主要发生在赖氨酸残基的侧链，且通常是多泛素化。结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别进而被降解，泛素相当于蛋白质被降解的标签。 26S蛋白酶体(proteasome)是一个由70 多个亚基组成的大型复合分子，分子量接近2,000 KD，可识别泛素化的蛋白质，并将其降解成短肽。 1 泛素-蛋白酶体途径 需要被蛋白酶体降解的蛋白质会先被连接上泛素作为标记，这一过程是一个三酶级联反应。 泛素活化酶E1(ubiquitin activating enzyme) 泛素结合酶E2 (ubiquitin conjugating enzyme) 泛素

17、连接酶E3 (ubiquitin-protein ligase)，也称底物识别因子 (substrate recognition factor)。蛋白分子泛素化 由于蛋白酶体识别泛素化的蛋白并将其降解是一个非特异性的进程，因此，E3在整个蛋白质的降解过程中发挥了至关重要的作用，决定了反应的特异性。 首先泛素激活酶E1 水解ATP获取能量，通过其活性中心的Cys残基与泛素分子的C端形成高能硫酯键而激活泛素(形成E1-泛素复合体)； 然后E1-泛素复合体将活化的泛素递交给泛素结合酶E2； 最后由泛素连接酶E3家族中的一员(随底物的不同而异)识别需要被泛素化的靶蛋白，募集底物和E2，并介导泛素从E2

18、转移到靶蛋白上。蛋白分子泛素化反应 当第一个泛素分子被连上后，后续泛素分子连于前一泛素分子的赖氨酸残基，逐渐形成一条多聚泛素链(至少4个泛素分子) 。 泛素化反应包含一个E1，少数几个E2和众多E3。 参与细胞周期调控的泛素连接酶E3至少有两类： SCF (skp1-cullin-F-box protein)复合物，负责将泛素连接到G1/S期周期蛋白和某些CKI上。 APC/C (anaphase promoting complex /cyclosome 负责将泛素连接到M期周期蛋白、双体素和其它有丝分裂因子上。 在细胞周期中SCF始终具有活性，其作用底物蛋白质必须先磷酸化后，才能被SCF识别

19、并通过泛素化而降解。 APC/C活性在细胞周期各相中不断发生变化。 1 依赖SCF复合物的泛素化途径 SCF(SKP/CUL/F-box)复合物主要参与G1/S期调控因子的泛素化降解，如Cyclin D、Cyclin E、p27Kip1等。 SCF复合物主要包含Skp1、Cullins、F-box 蛋白、ROC/Rbx/SAG环指蛋白等。其中 Cullins 为复合物各个组分提供作用平台，环指蛋白识别E2，F-box蛋白是一大类蛋白的统称，其F-box结构域与Skp1结合，Skp1-F-box识别底物。 F-box是一个大约50个氨基酸的结构域，由于周期素F具有与此相同的结构域而命名。 Skp

20、1：S-phase kinase-associated-protein 1 Cullin：淘汰素2 依赖APC/C的泛素化途径 APC介导的泛素化途径较为复杂，它与姊妹染色单体分离、纺锤丝解聚、胞质分裂、细胞脱离有丝分裂和细胞重新进入G1期都有着密切的关系。 APC是一个20S的多亚基泛素连接酶E3，定位于纺锤体微管和中心粒上，其作用底物都含有由9个氨基酸组成的保守区(cyclins的降解框)。 与E2的结合部APC2、APC11和APC10 /Doc1，前两个亚基被认为是催化反应的核心； TPR(34肽重复单位)亚基APC3、APC6、APC7、Apc13，参与最初的与衔接蛋白和Apc8的结

21、合； 结构性复合物Apc1、Apc4和Apc5。 、和三部分构成了APC /C的稳定核心； 共激活因子Cdc20、Cdh1和Ama1，APC /C复合物的活性调节和底物识别特异性主要依靠共激活因子。 APC /C可分成 4 个部分 APC/C核心和衔接蛋白、底物共同形成最终具有连续催化泛素连接反应的APC-Cdc20 /Cdh1-底物复合物。二、细胞周期监控机制 细胞周期的运行，是在一系列称为检查点的严格检控下进行的。 细胞周期检查点(check point)是细胞周期中的一套保证DNA复制和染色体分配质量的检查机制。从功能上看，细胞周期有DNA损伤检测点和时相次序检测点两大类。 细胞周期查验

22、点主要在4个时相点发挥作用： (1)G1/S期检查点，在酵母中称Start点，在哺乳动物中称Restriction point； (2)S期检查点； (3)G2/M期检查点； (4)中/后期检查点，又称纺锤体组装检查点。 根据调控内容，检查点又可分： DNA损伤检查点(DNA damage checkpoint) 负责查看DNA有无损伤；DNA复制检查点(DNA replication checkpoint) 负责DNA复制的进度；纺锤体组装检查点(spindleassembly checkpoint) 管理染色体的正确分配已否。 G1/S检查点；又称限制点(restriction point

23、)，控制细胞由G1进入S期，检查的事件包括DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？ S期检查点：DNA复制是否完成？ G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？ 中-后期检查点： 又称纺锤体组装检查点，检查染色体着丝粒有没有正确连接到纺锤体上？任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制APC的活性，引起细胞周期中断。细胞周期 4 个主要查验点（一） DNA损伤检查调控 DNA损伤检查由DNA损伤感应机制、细胞生长停滞机制、DNA修复机制和细胞命运决定机制四个功能机制组成。 细胞一旦发生DNA损伤或复制错误，DNA损伤首先启

24、动损伤感应机制，将DNA损伤转化成信号，由信号传导通路传给生长停滞机制，使细胞停止生长，进而启动DNA修复机制，修复损伤的DNA。最后，如果DNA损伤得到完全修复，细胞周期可进入下一个时相，细胞周期仍可正常完成，但倘若DNA损伤修复失败，细胞凋亡机制将被启动，损伤细胞进入凋亡，从而避免DNA损伤带到子代细胞，维持了组织细胞基因组的稳定性。 在G1/S检查点，DNA损伤引起p53依赖的细胞周期阻滞。 正常细胞内p53的水平通常很低，DNA损伤刺激能引起p53的表达量和并被磷酸化而激活。P53又可引起多种基因转录，如p21等。 p21是一种CDKI，通过抑制CDKs导致细胞周期阻滞，阻止损伤DNA的复制。 Chk1和Chk2是G2期DNA损伤检查点的核心分子。 Chk1(checkpoint kinase 1)引起Cdc25的Ser216磷酸化，通过抑制Cdc25的活性而抑制 M-CDK的活性，阻止细胞进入 M 期。 Chk2 (checkpoint kinase 2)使P53被磷酸化而激活，激活后的 P53 作为转录因子导致P21表达， P21抑制G1-S期CDK的活性，使细胞停止于G2期。（二）纺锤体组装检查点 在纺锤体装配检控(spindle assembly chec