枯草杆菌生物兴趣小组

1、枯草杆菌枯草杆菌高一（高一（10）班）班李阳、李佩烨、项洁莹、郑铭琳李阳、李佩烨、项洁莹、郑铭琳对消化有重要作用的细菌目录v1、认识枯草杆菌、认识枯草杆菌v2、革兰氏染色法、革兰氏染色法v3、枯草杆菌的培养、枯草杆菌的培养v4、枯草杆菌的培养、枯草杆菌的培养认识枯草杆菌认识枯草杆菌枯草芽孢杆菌（枯草杆菌一般指枯草芽孢杆菌）v枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.70.823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需

2、氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。水上形态在枯草杆菌丰富的水体里，水的表面张力比较大，可以在吹出来的泡泡的小圈上形成一层膜。枯草杆菌培养基电镜图片形态特征革兰氏染色法细菌介绍细菌介绍芽孢具有厚而致密的壁，透性差，含水量低，折光性强，不易着色。在加芽孢具有厚而致密的壁，透性差，含水量低，折光性强，不易着色。在加热条件下加入着色力强的染料，让芽孢、菌体与染料作用较长时间，使热条件下加入着色力强的染料，让芽孢、菌体与染料作用较长时间，使芽孢染上颜色

3、，再使菌体的颜色脱去；然后再用另一种与前者颜色不同芽孢染上颜色，再使菌体的颜色脱去；然后再用另一种与前者颜色不同的对比度强的染料对菌体复染，使芽孢和菌体分别呈现出不同的颜色，的对比度强的染料对菌体复染，使芽孢和菌体分别呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，以便观察。因而能更明显地衬托出芽孢，以便观察。荚膜是一层覆盖在某些细菌细胞壁表面的粘性物质，主要成分是多糖荚膜是一层覆盖在某些细菌细胞壁表面的粘性物质，主要成分是多糖类。荚膜与染料的亲合力较差，不易着色。荚膜的通透性好，某些染类。荚膜与染料的亲合力较差，不易着色。荚膜的通透性好，某些染料可透过荚膜而使菌体着色。因此，常采用负染色法将菌体

4、和背景着料可透过荚膜而使菌体着色。因此，常采用负染色法将菌体和背景着色而荚膜不着色，因而荚膜在菌体周围呈一透明无色圈。色而荚膜不着色，因而荚膜在菌体周围呈一透明无色圈。细菌鞭毛非常纤细，直径细菌鞭毛非常纤细，直径10-20nm，只能在电子显微镜下才能观察到。但采，只能在电子显微镜下才能观察到。但采用特殊的染色法在光学显微镜下也能见到。其原理是：在染色前先用媒染剂用特殊的染色法在光学显微镜下也能见到。其原理是：在染色前先用媒染剂处理，使媒染剂沉积在鞭毛上，将鞭毛加粗，然后再进行染色，便能在油镜处理，使媒染剂沉积在鞭毛上，将鞭毛加粗，然后再进行染色，便能在油镜下看见鞭毛的形状和着生方式。下看见鞭毛

5、的形状和着生方式。 原理原理v基本原理v 革兰氏染色法是一种鉴别性的染色方法。结果细胞保留初染剂篮紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞为复染剂的颜色（红色），则为革兰氏阴性菌。其机理是由于细菌细胞壁的化学组成及结构不同和通透性不同的缘故。v 细菌的革兰氏染色受菌龄、培养基pH值和染色技术等因素的影响，并非固定不变。三、器具材料三、器具材料 1.器材：显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、接种环、酒器材：显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、接种环、酒 精灯、火柴、吸水纸、载破片、盖玻片。精灯、火柴、吸水纸、载破片、盖玻片。 2.染色液及试剂染色液及试剂: 结晶紫染色液、路戈氏碘液、结晶紫染色液、路戈氏碘液、

6、 95%的酒的酒 精、番红染精、番红染 色液、蒸馏水。色液、蒸馏水。 碱性复红染色液、碱性复红染色液、5%5%孔雀绿染色液。孔雀绿染色液。 3.菌种；菌种；培养培养18小时至小时至20小时的小时的枯草芽孢杆菌、苏云金杆枯草芽孢杆菌、苏云金杆 菌、大肠杆菌的新鲜斜面菌种。菌、大肠杆菌的新鲜斜面菌种。 培养培养24小时至小时至36小时的小时的枯草杆菌或苏云金杆菌、枯草杆菌或苏云金杆菌、 巨大芽孢杆菌。巨大芽孢杆菌。细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染,在媒染处理时，媒染剂与染料形成不溶性化合物，可增加染料和细菌的亲和力。 实验过程1、 取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（

7、用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。2、 涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。3、 晾干：让涂片在空气中自然干燥。4、 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。5、 染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。6、 水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察

8、细胞形态。8、 脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。9、 复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。观察荚膜和鞭毛标本片观察荚膜和鞭毛标本片周生周生荚膜一端生一束1.1培养基培养基v牛肉膏蛋白胨液体培养基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，1000mL蒸馏水，pH 7.27.5 。v牛肉膏蛋白胨固体培养基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5g NaCl，20g琼脂, 1000mL蒸馏水，pH 7.27.5 。1号培养基： 3g木屑, 0.4 g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4

9、 ,16mL水。2号培养基： 3g稻草, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。3号培养基： 3g玉米芯, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。4号培养基： 3g糠壳, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。为了更好地探究枯为了更好地探究枯草杆菌繁殖的适宜草杆菌繁殖的适宜条件，对培养基进条件，对培养基进行优化：行优化：1.2培养基的优化1.2.1培养方法1.2.

10、2检测方法1.2.3含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响1.2.4稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响 1.2.5氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响1.2.6碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响1.2.7碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响1.2.8pH对枯草芽孢杆菌生长的影响1.2.1培养方法培养方法先用接种环接种1环试管菌种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，200r/min，37培养24h，进行扩大培养和活化，然后再取1mL液体种接种到发酵培养基中，37培养48h。1.2.2检测方法检测方法活菌的检测方法：称量大概5g发酵48h后的培养基溶解在50mL无菌水中,200r/min，20min摇散得10，再用5mL无菌吸管吸

11、取5mL到45mL无菌水中，摇匀得10，依次这样稀释到一个适当的稀释度，取0.1mL稀释液到无菌牛肉膏蛋白胨固体培养基中并涂匀，37培养24h，然后数培养皿上的菌落数7。芽孢率的检测方法：称量大概5g发酵48h后的培养基溶解在50mL无菌水中,200r/min，20min摇散得10，再用5mL无菌吸管吸取5mL到45mL无菌水中，摇匀得10，依次这样稀释到10，取0.02mL滴到载玻片上，涂匀，用酒精灯烘干，然后用酚酞染色1min，用清水冲洗，再用酒精灯烘干，镜检，找几个清晰的画面，数画面中的芽孢数和杆数，取其平均值，即可得到其芽孢率。1.2.3含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响含水量对枯草芽孢杆

12、菌生长的影响麦麸与稻草的比例确定以后，即可得其含水量为67%，分别以75%，71%，63%，59%，55%代替其含水量作为发酵培养基，在其它成分和条件不变的情况下培养48h，检测各处理后的活菌数和芽孢率，计算得其单位质量的干重的发酵培养基的芽孢数，以确定最佳的含水量。 1.2.4稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响分别以稻草粗细程度为1.5mm,混合样作为发酵培养基，其它组分不变，相同发酵条件下培养48h,检测各的活菌数和芽孢率，以确定稻草的最佳粗细程度。1.2.5氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响在相等的N含量的条件下，分别用蛋白胨，

13、酵母膏，豆饼粉，尿素，（NH）SO及不同组合作为N源，其它成分不变，相同条件下培养48h,检测活菌数和芽孢率，以确定最佳N源。1.2.5碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响确定N源后，在保持C含量不变的情况下，分别用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作为C源制作发酵培养基，其它组分不变，相同条件下培养48h，测定活菌数和芽孢率，确定最佳C源。1.2.7碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响确定好碳源和氮源之后，改变碳源和氮源的比例，分别采用0:1,1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1,1:0的C/N比(原料质量比)配制发酵

14、培养基，其它成分不变，在相同的条件下培养48h，检测发酵料中和活菌数和芽孢率，以确定最佳的C/N比。1.2.8 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响对枯草芽孢杆菌生长的影响改变发酵培养基中的pH值，分别以pH值为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5作为发酵培养基，其它成分不变，在相同的发酵条件下培养48h，检测活菌数和芽孢率，得最佳pH。枯草杆菌的应用在生活中的应用1.枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用 枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具

15、有较强的防病作用。美国用枯草芽孢杆菌QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，用于防治多种作物的白粉病、白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害霜露病、疫病、灰霉病等病害，用于防治叶部用于防治叶部病害病害(灰霉病、白粉病灰霉病、白粉病)和根部病害和根部病害(枯萎病、根枯萎病、根腐病、黑斑病等腐病、黑斑病等)，用于防治番茄晚疫病、灰用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进剂。霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进剂。澳大利亚开发的B.subtilis A-B对麦类和胡萝卜立枯病等具有很好的防治和增产作用。2.枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生

16、长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长 研究证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。最近，科学家发现从枯草芽孢杆菌提取到的淀粉酶、纤维素酶能够补充体内消化酶补充体内消化酶的不足，恢复正常消化机能；蛋白酶能够分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。日本人日常生活中食用的纳豆就是利用枯草芽孢杆菌生产的，研究表明，纳豆中含有的溶栓酶(纳豆激酶)对心血管对心血管疾病有很好的预防和治疗作用疾病有很好的预防和治疗作用；而同样由枯草芽孢杆菌

17、合成的聚谷氨酸可用作药物缓释材料和医用高分子纤维材料等。英文名称英文名称：Combined Bacillus Subtilis and Enterococcus Faecium Granules with Multivitamines，Live是否处方药是否处方药：非处方药剂型剂型：颗粒药品类型药品类型：生物制品通用名称通用名称：枯草杆菌二联活菌颗粒化学成分化学成分 ：每袋(1克)含活菌冻干粉37.5毫克,内有活菌1.5亿个。 含有两种活菌枯草杆菌和肠球菌，可直接补充正常生理菌丛，抑制致病菌，促进营养物质的消化、吸收，抑制肠源性毒素的产生和吸收，达到调整肠道内菌群失调的目的。本品还有婴幼儿生长

18、发育所必须的多种维生素、微量元素及矿物质钙，可补充因消化不良或腹泻所致的缺乏。 3.刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力 4枯草芽孢杆菌菌体自身合成-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用。 枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质种类十分丰富，这决定了其自身含有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜力。研究资料表明，枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶。在

19、过去的10年，利用基因工程技术，枯草芽孢杆菌几乎可以在短期内大量短期内大量生产生产任何种源的新酶，从而省略了大量的原始菌种改造、驯化、毒理学实验改造、驯化、毒理学实验等工作；利用蛋白质工程技术，能够在生产新酶之前对该酶的性质进行改良和调整，从而改善酶的活性或者赋予酶新的所需性质。这些新技术的应用使新酶种的开发周期大大缩短，难度和成本降低，产品更加稳定有效。难度和成本降低，产品更加稳定有效。5能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。 枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用起步较晚，由于它能分泌蛋白酶等多种酶类和抗生素，使池底积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体以及有害气体(氨、硫化氢等)，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸等)，后分解为更小