第8酵母基因工程基因工程原理与技术刘志国课件

1、第二节第二节 常见的酵母基常见的酵母基因表达系统因表达系统第八章第八章 酵母基因工程酵母基因工程 酵母菌表达载体酵母菌表达载体 酵母基因表达宿主系统酵母基因表达宿主系统第一节第一节 酵母基因工程表达体系酵母基因工程表达体系第四节第四节 酵母基因工程应用举例酵母基因工程应用举例-利用重组酵母生产乙肝利用重组酵母生产乙肝疫苗疫苗 酵母菌的转化系统酵母菌的转化系统第三节第三节 影响外源基因表达的因素影响外源基因表达的因素酵母菌的分类学特征酵母菌的分类学特征 酵母菌（酵母菌（Yeast）是一群是一群以芽殖或裂殖方式以芽殖或裂殖方式进行无性繁进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知菌

2、殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知菌类，共由类，共由5656个属和个属和500500多个种组成。多个种组成。 酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。第一节第一节 酵母基因表达体系酵母基因表达体系-宿主系统宿主系统作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求 安全无毒，没有致病性。安全无毒，没有致病性。 遗传背景清楚，容易进行遗传操作。遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 外源外源DNADNA容易导入宿主细胞，转化效率高。容易导入宿主细胞，转化效率高。 培养条件简单，容易进行培养条件简单，容易进行高密度高密度发酵。发酵。 有较

3、强的蛋白质分泌能力。有较强的蛋白质分泌能力。 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能力力。 酵母菌表达外源基因的优势酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便操作简便能将外源基因表达产物能将外源基因表达产物分泌至培养分泌至培养基中基中具有原核细菌无法比拟的具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉低廉不含有特异性的病毒、不含有特异性的病毒、不产内毒素不产

4、内毒素，美国，美国FDA认定认定为安全的为安全的基因工程受体系统基因工程受体系统酵母菌是酵母菌是最简单的真核模式生物最简单的真核模式生物常用的酵母宿主菌常用的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酿酒酵母属酿酒酵母属 如酿酒酵母（如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）克鲁维酵亚母属克鲁维酵亚母属 如乳酸克鲁维酵母（如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）毕赤酵母属毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母属裂殖酵母属 如粟酒裂殖酵母（如粟酒裂

5、殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）解脂耶氏酵母（解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。 假丝酵母属假丝酵母属 产朊假丝酵母产朊假丝酵母 (Candida utilis) 酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛醛-3-磷酸脱氢酶基因磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因磷酸甘油

6、激酶基因PKG、乙醇脱氢乙醇脱氢酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统酶基因酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化超糖基化能力，往往使得能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源已被广泛用作重组

7、异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也乳酸克鲁维酵母表达系统乳酸克鲁维酵母表达系统能稳定遗传能稳定遗传4040代以上。代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。于酿酒酵母表达系统。 巴斯德毕赤酵母是一种巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌甲基营养菌，能在甲醇培养基中生，能在甲醇培养基中生巴斯德毕赤酵母表达系巴斯德毕赤酵母表达系统统长，长，甲醇可高效甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因

8、的表达。表达系统优势表达系统优势：生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1） 、可诱导表达、可诱导表达 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因序列一般整合入受体的染色体外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因上。其外源基因20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 多型汉逊酵母也是一种多型汉逊酵母也是一种甲基营养

9、菌甲基营养菌。其自主复制序列。其自主复制序列多型汉逊酵母表达系统多型汉逊酵母表达系统HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体，已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒质粒能高频自发地整合在受体的染色体能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合上（可连续整合100多多 目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。系统中获得成功表达。系统中获得成功表达。酿酒酵母中的酿酒酵母中的2 2m m环状质粒环状质粒同源重组同源重组RE

10、P1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB环状质粒，拷贝数达环状质粒，拷贝数达5050至至100100个。个。IRs 反向重复序列，反向重复序列，600 bp，重组重组FLP 编码产物驱动编码产物驱动IRs的同源重组的同源重组REP 编码产物控制质粒的稳定性编码产物控制质粒的稳定性STB REP的结合位点的结合位点接合酵母属中的接合酵母属中的pSR1和和pSB1，以及以及克鲁维酵母属中的克鲁维酵母属中的pKD1等均与等均与2m m质质粒类似。粒类似。第一节第一节 酵母基因工程表达体系酵母基因工程表达体系-载体载体第一节第一节 酵母基因工程表达体系酵母基因工程表达体系-载体载体 酵母质粒载

11、体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（穿梭载体（shuttle vectorshuttle vector）。 酵母菌酵母菌-大肠杆菌穿梭表达载体是由来自酵母的部分核大肠杆菌穿梭表达载体是由来自酵母的部分核酸序列和细菌的部分核酸序列所组成，其原核部分主要包酸序列和细菌的部分核酸序列所组成，其原核部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的起点序列括可以在大肠杆菌中复制的起点序列(Ori)和特定的抗生素和特定的抗生素抗性基因序列，这两个部分主要是作为在大肠杆菌宿主时抗性基因序

12、列，这两个部分主要是作为在大肠杆菌宿主时增殖和筛选组分。酵母部分包括酵母转化子的筛选组分，增殖和筛选组分。酵母部分包括酵母转化子的筛选组分，主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列(如：如：HIS4基因序基因序列列)或特定的抗生素抗性基因序列或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗如：抗Zeoein的基因序列的基因序列)，以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。，以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。 第一节第一节 酵母基因工程表达体系酵母基因工程表达体系 -载体载体1 1酵母载体的基本结构酵母载体的基本结构 DNA复制起始区复制起始区：2质粒的复制起始区及酵母

13、基因组的质粒的复制起始区及酵母基因组的自主复制序列（自主复制序列（autonomously replicating sequence，ARS） 筛选标记：筛选标记：营养缺陷型筛选或者抗性筛选营养缺陷型筛选或者抗性筛选 整合介导区整合介导区 有丝分裂稳定区有丝分裂稳定区 表达盒表达盒： 启动子启动子 ，基因（分泌信号序列，基因（分泌信号序列 ），终止子），终止子2 酵母载体的种类酵母载体的种类酵母整合型质粒酵母整合型质粒YIp： 缺乏酵母的复制起始位点，缺乏酵母的复制起始位点，不不能在酵母中自主复制，能在酵母中自主复制，含有酵母的筛选标记含有酵母的筛选标记ura3基因基因。具有整合介导区，具有整

14、合介导区， 所以，它只有整合到酵母染色体所以，它只有整合到酵母染色体中才能稳定中才能稳定(a)。酵母克隆表达载体根据其在酵母中酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式复制形式来分来分类。分为下列五类类。分为下列五类 ：酵母载体按照酵母载体按照用途用途不同可分为克隆载体和表达载体不同可分为克隆载体和表达载体两类两类含有酵母菌染色体含有酵母菌染色体DNA同源序列的同源序列的YIp质粒质粒的构建的构建 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插目的基因表达盒通常插在染色体

15、在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体酵母菌特定的染色体DNA区域。区域。酵母附加体质粒酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母：含有酿酒酵母2m m质粒质粒DNA复复制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数可达可达60-100。转化效率高（。转化效率高（b）。）。 酵母复制型质粒酵母复制型质粒YRp：含有来源于酵母的：含有来源于酵母的DNA复制复制起始区起始区(ARS)，能在酵母染色体外自主复制的一种自，能在酵母染色体外自主复制的一种自主复制型载体，虽然其转化效率高，在宿主的拷贝数

16、主复制型载体，虽然其转化效率高，在宿主的拷贝数可以达上百个（可以达上百个（c）。）。 ARS为酵母菌中的自主复制序列，为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每染色体上每30-40 kb就有一个就有一个ARS元件。元件。 以以ARS为复制子的质粒称为为复制子的质粒称为YRp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200200个，个， 以以2m m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp但培养几代后，质粒的丢失率高达但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%50%-70%，主要是由于，主要是由于分配不均匀

17、所致。分配不均匀所致。2 2 酵母载体的种类酵母载体的种类 酵母着丝粒质粒酵母着丝粒质粒YCp：含有酵母染色体着丝粒的：含有酵母染色体着丝粒的DNA片段，这种载体在细胞分裂过程中，在母细胞片段，这种载体在细胞分裂过程中，在母细胞和子细胞之间平均分配，表现出高度的稳定性和子细胞之间平均分配，表现出高度的稳定性(d)。 CEN为酵母菌染色体为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关上与染色体均匀分配有关的序列的序列,将将CEN DNA插入含插入含ARS的质粒中，获得的新的质粒中，获得的新载体称为载体称为YCp .YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有，但拷贝数

18、只有1 - 5个。个。 酵母人工染色体酵母人工染色体YAC：自主复制序列（自主复制序列（ARS）、着丝粒序列（）、着丝粒序列（CEN）和端粒序列（）和端粒序列（TEL），）， YAC载体在宿主细胞中载体在宿主细胞中以线性双链以线性双链DNA存在，具有高度的遗传稳定性。存在，具有高度的遗传稳定性。 主要结构：主要结构： 两个可在酵母菌中利用的选择基因，两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和和TRP1(色氨酸合成基因色氨酸合成基因)； 酵母菌着丝粒序列酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4)； 一个自主复制序列一个自主复制序列(ARS1)； 两个来自嗜热四膜虫两个来自嗜热四膜虫

19、(Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列的末端重复序列(TEL)，以，以保持重组保持重组YAC为线状结构；为线状结构； 在两个末端序列中间，有一段填充序在两个末端序列中间，有一段填充序列列(stuff, HIS3)，以便，以便pYAC4在细菌细胞在细菌细胞中稳定扩增；中稳定扩增； Ampr抗性及细菌质粒复制原点；抗性及细菌质粒复制原点； 一个一个EcoR克隆位点，该位点位于酵克隆位点，该位点位于酵母菌母菌Sup4 tRNA基因内。基因内。 酵母菌的转化系统酵母菌的转化系统酵母菌的转化方法酵母菌的转化方法用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因酵母菌转化方法酵母

20、菌转化方法原生质球法原生质球法：酶解酵母细胞壁，产生原生质球，：酶解酵母细胞壁，产生原生质球，原生质体原生质体在在Ca2+和和PEG的存在下，的存在下，具有穿透性，并允许具有穿透性，并允许DNADNA进入，然进入，然后使原生质球再生新的细胞壁。后使原生质球再生新的细胞壁。可以实现转化，转化子可可以实现转化，转化子可达原生质体总数的达原生质体总数的1-2%。Li+盐转化方法盐转化方法 ：酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如：酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）处理后，在等）处理后，在PEG存在下和热休克之后可高效吸收质存在下和热休克之后可高效吸收质粒粒DNA。醋酸锂对酿酒酵母有效，对毕赤酵

21、母无效，毕赤。醋酸锂对酿酒酵母有效，对毕赤酵母无效，毕赤酵母转化一般用氯化锂有效酵母转化一般用氯化锂有效优点优点：吸收线型：吸收线型DNADNA的能力明显大于环状的能力明显大于环状DNADNA（相差（相差8080倍）倍）酵母菌转化方法酵母菌转化方法电击转化法：电击转化法：原理是通过利用高压电脉冲作用，造成细胞膜的原理是通过利用高压电脉冲作用，造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，形成可逆的瞬间通道，不仅有利于离子不稳定，形成电穿孔，形成可逆的瞬间通道，不仅有利于离子和水进入细胞，也有利于外源和水进入细胞，也有利于外源DNADNA等大分子进入等大分子进入 优点：优点：不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条

22、件；适用范围不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件；适用范围广；转化率高（达广；转化率高（达105 / m mg DNA）。）。PEG转化法转化法：PEG 1000酵母细胞转化特点酵母细胞转化特点单、双链单、双链DNADNA均可转化，但单链的转化率是双链的均可转化，但单链的转化率是双链的10-3010-30倍倍单链质粒进入细胞后，能转化为双链并复制（含有复制子）或单链质粒进入细胞后，能转化为双链并复制（含有复制子）或同源整合入染色体（不含复制子）同源整合入染色体（不含复制子）克隆在克隆在YIpYIp上的外源基因，会发生高频同源整合，上的外源基因，会发生高频同源整合，整合子占转化子整合子占转化子总

23、数的总数的50-80%用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA 等等 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难常困难营养缺陷型的互补基因营养缺陷型的互补基因用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因其编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白其编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因显性标记基因 aph 氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶 抗抗G418G418 cat 氯霉素乙酰转移酶氯霉

24、素乙酰转移酶 抗氯霉素抗氯霉素 dhfr 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 铜离子螯合物铜离子螯合物 耐受铜离子耐受铜离子 suc2 蔗糖转化酶蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂标记基因标记基因编码产物编码产物遗传表型遗传表型第二节第二节 常见的酵母基因表达系统常见的酵母基因表达系统一、一、 酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统1 1，启动子，启动子 组成型表达的启动子组成型表达的启动子：磷酸甘油酸激酶（：磷酸甘油酸激酶（PGKl）启动子）启动子、甘油醛磷酸脱氢酶（、甘油醛磷酸脱氢酶

25、（GAPDH或或GAPl）启动子）启动子 可控性启动子可控性启动子：半乳糖启动子（：半乳糖启动子（GALGAL）、酸性磷酸酶启动）、酸性磷酸酶启动子（子（PHOPHO）、乙醇脱氢酶（）、乙醇脱氢酶（ADH2ADH2）启动子、）启动子、CuCu2+2+螯合蛋白启螯合蛋白启动子（动子（CUPICUPI）以及交配）以及交配a a型阻遏系统（型阻遏系统（MATa/aMATa/a） 酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性pho4TS-PHO5启动子启动子：酿酒酵母酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开PHO4基因编码产物是基因编码产物是PHO5

26、启动子的正调控因子启动子的正调控因子因此，装在因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在启动子下游的外源基因在35时关闭时关闭2323诱导表达诱导表达温度控制型启动子温度控制型启动子PHO4温度敏感型突变基因温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在的编码产物在35时失活时失活酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性a a a 型启动子酿酒酵母有a和a a两种单倍体，分别由MATa和MATa a两个等位基因决定。a a1因子决定a a细胞特征表达a a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a a细胞特征表达编码a a2因子的基因突变型hmla a2-102能产生a a2变体，它能灭

27、活a1，同时阻遏a型温度控制型启动子温度控制型启动子a 型启动子hmla a2-102 MATaa1Sir3-8TSa 型启动子 受体细胞基因组受体细胞基因组 重组质重组质粒粒a 型启动子hmla a2-102 MATaa1Sir3-8TSa 型启动子a a2a a12535（）酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性酿酒酵母酿酒酵母超诱导型启动子超诱导型启动子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80基因基底水平表达基因基底水平表达GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导时，半乳糖诱导时，GAL4高效表达，高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达超高效表

28、达GAL10Promoter的半乳糖的半乳糖利用酶系利用酶系由由GAL1 GAL7和和 GAL10基因编码基因编码杂合启动子：杂合启动子：将酿酒酵母的乙醇脱氢酶将酿酒酵母的乙醇脱氢酶基因（基因（ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛）所属启动子的上游调控区与甘油醛-3-磷酸脱磷酸脱氢酶基因（氢酶基因（GAPDH）所属启动子的下游基本区重组）所属启动子的下游基本区重组在一起，构建出在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子型杂合启动子 酿酒酵母表达载体酿酒酵母表达载体 目前已建立的酿酒酵母目前已建立的酿酒酵母表达载体有（表达载体有（1）酵母）酵母附加体质粒附加体质粒(YEp) （见（见右图

29、）；（右图）；（2）酵母复）酵母复制型质粒制型质粒(YRp)；（；（3）酵母着丝粒质粒酵母着丝粒质粒(YCp) ；（；（4）酵母整合型质）酵母整合型质粒粒 (YIp)；（；（5）酵母人）酵母人工染色体工染色体(YAC)。前三。前三类统称为游离自主复制类统称为游离自主复制型质粒载体。含有来自型质粒载体。含有来自酵母基因组的复制起始酵母基因组的复制起始区区ARS或者酵母天然质或者酵母天然质粒粒2m m复制起点序列，复制起点序列，能能够自主复制，通常为多够自主复制，通常为多拷贝数拷贝数酿酒酵母宿主酿酒酵母宿主 有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。如达。

30、如pep4-3pep4-3突变株中蛋白酶的活性显著降低突变株中蛋白酶的活性显著降低，对外源基因表达产物的降解作用较小。，对外源基因表达产物的降解作用较小。 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型ssc1 改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的钙离子依赖型的ATP酶酶ssc2 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达 转录后加工转录后加工rgr 1 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达 转录水平转录水平ose1 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达 转录水平转录水平ssc1

31、1 改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌 羧肽酶羧肽酶Yrho- 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达 转录水平转录水平突变类型突变类型生物效应生物效应作用位点作用位点酿酒酵母宿主酿酒酵母宿主 为了减少目的蛋白的过度糖基化，目前已从为了减少目的蛋白的过度糖基化，目前已从野生型的酿酒酵母中分离出许多类型的糖基化途野生型的酿酒酵母中分离出许多类型的糖基化途径突变株，如甘露聚糖合成缺陷型的径突变株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突变株突变株、天门冬酰胺侧链糖基化缺陷的、天门冬酰胺侧链糖基化缺陷的alg突变株以及外突变株以及外侧糖链缺陷型的侧糖链缺陷型的och突变株等。在这些突变株中，突变株等。在这些突变株中，

32、具有重要实用价值的是具有重要实用价值的是mnn9、och1、och2、alg1和和alg2，因为它们不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧，因为它们不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧链上延长甘露多聚糖长链。链上延长甘露多聚糖长链。 抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌能抑制超糖基化的突变类型能抑制超糖基化的突变类型mnn 甘露糖生物合成缺陷型甘露糖生物合成缺陷型alg 天冬酰胺侧链糖基化缺陷型天冬酰胺侧链糖基化缺陷型och 外侧糖链添加缺陷型外侧糖链添加缺陷型突变类型突变类型生物效应生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖基团，许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖

33、基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心糖基核心和和外侧糖外侧糖链两部分组成。链两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈糖基化反应很难控制，呈超糖基化超糖基化倾向，因此超糖倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。基化缺陷株非常重要。减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体蛋白酶体LysHOOCUbiquitin 76 aa ubiqu

34、itin ligase E3 Lysubiquitin ligase E3 Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌有四个泛素编码基因：酵母菌有四个泛素编码基因：UBI 1 编码编码泛素泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI 2 编码编码泛素泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI 3 编码编码泛素泛素-羧基延伸蛋白羧基延

35、伸蛋白76（CEP76） 对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI 4 编码编码泛素五聚体泛素五聚体 对数生长期关闭对数生长期关闭 稳定期表达稳定期表达酵母菌有七个泛素连接酶基因：酵母菌有七个泛素连接酶基因：UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素降解途径衰减的酿酒酵母泛素降解途径衰减的酿酒酵母酿酒酵母菌中，泛素主要由酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，基因表达，UBI 4-突变株能突变株能UBI 4缺陷型缺陷型： 外源基因表达理想的受体外源基因表达

36、理想的受体正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，UBA 1缺陷型缺陷型：减少蛋白降解：减少蛋白降解UBA1编码泛素激活酶编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解Ubc4 - ubc5 双突变型：双突变型： 减少蛋白降解减少蛋白降解七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效二、毕赤酵母（二、毕赤酵母（Pichia pastori

37、s）表达系统）表达系统 1. 1. 启动子启动子 （1） AOX1和和AOX2启动子启动子（2）三磷酸甘油醛脱氢酶（）三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldeyde 3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH）启动子）启动子 （3）甲醛脱氢酶（）甲醛脱氢酶（formaldehyde dehydrogenase, FLD）启动子）启动子2 2 毕赤酵母表达载体类型毕赤酵母表达载体类型胞内表达载体胞内表达载体pPICZ A,B,C 分泌型表达载体分泌型表达载体pPICZa a A,B,C 毕赤酵母表达载体上无酵母复制起点，它是靠毕赤酵母表达载体上无酵母复制起点，它是靠AOX1

38、或或HIS4基因的位置同源重组整合入酵母染基因的位置同源重组整合入酵母染色体色体DNA中，并随酵母的生长传代稳定地存在。中，并随酵母的生长传代稳定地存在。整合的方式可以是单交换插入，亦可双交换插入整合的方式可以是单交换插入，亦可双交换插入，一般来说前一种方式更容易发生，一般来说前一种方式更容易发生 。3 3 载体的整合方式载体的整合方式依据具体整合位点及相应产生的转化子的类型可依据具体整合位点及相应产生的转化子的类型可分为三种情况：分为三种情况：5 AOX1和和3 AOX1与染色体发生同源重组，使受体染色体带有与染色体发生同源重组，使受体染色体带有一个拷贝的外源基因。这种情况有功能的一个拷贝的

39、外源基因。这种情况有功能的AOX1基因被替换而丢基因被替换而丢失后，只能利用弱的失后，只能利用弱的AOX2基因启动合成基因启动合成AOX，就产生，就产生His+MutS表型表型(methanol utilization slow)，在含甲醇的培养基中，在含甲醇的培养基中生长缓慢。此时，甲醇利用率很低，但它表达外源基因的效率生长缓慢。此时，甲醇利用率很低，但它表达外源基因的效率高高染色体染色体HIS4基因与载体的基因与载体的HIS4基因发生置换，使得一个或多个基因发生置换，使得一个或多个表达单位插入在表达单位插入在his4位点，产生的表型也是位点，产生的表型也是His+ Mut+染色体染色体AO

40、X1区与载体质粒的区与载体质粒的AOX1区发生单位点互交换，外源区发生单位点互交换，外源基因的表达单位插入在基因区基因的表达单位插入在基因区AOX1基因的上游或下游，这一过基因的上游或下游，这一过程可重复发生，使得更多拷贝的表达单位插入基因组中。这种程可重复发生，使得更多拷贝的表达单位插入基因组中。这种情况情况AOX1基因仍然有活性，在含甲醇的培养基中生长正常，产基因仍然有活性，在含甲醇的培养基中生长正常，产生的表型是生的表型是His+Mut+。 在毕赤酵母中有在毕赤酵母中有3种方法可以得到多拷贝表达菌株。种方法可以得到多拷贝表达菌株。 第一种方法直接构建含高拷贝外源基因的表达载体，在体第一种

41、方法直接构建含高拷贝外源基因的表达载体，在体外利用同尾酶向载体中多次插入首尾相连的表达盒。此法的优外利用同尾酶向载体中多次插入首尾相连的表达盒。此法的优点是一次整合，即可有多个表达盒插入染色体。但体外基因操点是一次整合，即可有多个表达盒插入染色体。但体外基因操作较繁琐。作较繁琐。 第二种方法是利用含有第二种方法是利用含有kanr基因的载体。细菌来源的卡那霉基因的载体。细菌来源的卡那霉素抗性基因在酵母中赋予宿主抵抗真核抗生素素抗性基因在酵母中赋予宿主抵抗真核抗生素G418。G418的抗的抗性水平大致与载体的拷贝数相关。提高抗生素性水平大致与载体的拷贝数相关。提高抗生素G418的浓度可以的浓度可以

42、得到含高拷贝表达载体的转化菌株。得到含高拷贝表达载体的转化菌株。 第三种方法是用含有第三种方法是用含有Zeocin抗性标记基因抗性标记基因Sh ble的载体来构的载体来构建多拷贝菌株。来源于细菌的建多拷贝菌株。来源于细菌的Sh ble在酵母中赋予宿主对抗生素在酵母中赋予宿主对抗生素zeocin的抵抗能力，通过提高的抵抗能力，通过提高zeocin浓度可筛选出含高拷贝表达浓度可筛选出含高拷贝表达载体的转化菌株。然而与载体的转化菌株。然而与G418筛选相似，大多数能抵抗高水平筛选相似，大多数能抵抗高水平 zeocin 的转化子并不含有多载体拷贝。的转化子并不含有多载体拷贝。 4 4 宿宿 主主 常用

43、的毕赤酵母受体菌株有：组氨酸缺陷型常用的毕赤酵母受体菌株有：组氨酸缺陷型GSl15和和SMD1168，腺，腺嘌呤缺陷型嘌呤缺陷型PMAD11，PMAD16， 其中其中SMD1168为蛋白酶缺陷型，以为蛋白酶缺陷型，以其作为宿主表达蛋白可以降低表达产物的降解。这些表达宿主都是由野其作为宿主表达蛋白可以降低表达产物的降解。这些表达宿主都是由野生品系生品系NRRL-Y11430衍生来的。最常用的受体菌是衍生来的。最常用的受体菌是Cregg在在1985年建立年建立的的GS115，它含有一个组氨醇脱氢酶缺陷型基因，它含有一个组氨醇脱氢酶缺陷型基因His4，可接受含，可接受含His4 的的载体而具有载体而

44、具有 His+表型来筛选转化子。表型来筛选转化子。 根据对根据对甲醇利用的情况甲醇利用的情况，毕赤酵母可划分为三种表型。菌株含有，毕赤酵母可划分为三种表型。菌株含有AOX1和和AOX2基因，在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似，称基因，在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似，称为为甲醇利用正表型（甲醇利用正表型（Mut+），），如如GS115；当；当AOX1被其他基因取代，则被其他基因取代，则需依赖需依赖AOX2，但其甲醛代谢速度慢，称为，但其甲醛代谢速度慢，称为甲醇利用慢表型（甲醇利用慢表型（Muts），），如如KM71。当。当AOX基因全部缺失，则不能利用甲醇，称为基因全部缺失，则不能利

45、用甲醇，称为甲醇利用负表甲醇利用负表型（型（Mut-），如，如MC100-3。后两者胞内表达外源蛋白质有时优于野生株。后两者胞内表达外源蛋白质有时优于野生株，且需甲醇较少。，且需甲醇较少。 此外为增加分泌蛋白质稳定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋此外为增加分泌蛋白质稳定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如白酶缺陷型菌株，如SMD1168(his4, prb1)。 第三节第三节 影响外源基因表达的因素影响外源基因表达的因素外源基因稳态外源基因稳态mRNA的浓度的浓度优化翻译起始区前后优化翻译起始区前后mRNA的二级结构，提高的二级结构，提高外源基因外源基因mRNA的翻译活性的翻

46、译活性酵母菌对密码子的偏爱性酵母菌对密码子的偏爱性在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶ADH）中中96%以上的氨基酸是由以上的氨基酸是由25个密码子编码的个密码子编码的一、转录水平控制一、转录水平控制二、表达载体的拷贝数和稳定性二、表达载体的拷贝数和稳定性三、其他因素三、其他因素优化工程菌发酵工艺优化工程菌发酵工艺 避免表达产物在细胞内的降解，选择或改造宿主，如避免表达产物在细胞内的降解，选择或改造宿主，如：采用二倍体宿主、采用酿酒酵母以外的酵母菌作为：采用二倍体宿

47、主、采用酿酒酵母以外的酵母菌作为宿主宿主第三节第三节 影响外源基因表达的因素影响外源基因表达的因素 利用重组利用重组酵母生产乙肝疫苗酵母生产乙肝疫苗第四节第四节 酵母基因工程应用实例酵母基因工程应用实例 由由乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约有的传染病，每年约有200万万病人死亡，并有病人死亡，并有3亿亿人成为人成为HBV携带者，其携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对

48、预防病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。广泛应用提供了可靠的保证。 利用重组利用重组酵母生产乙肝疫苗酵母生产乙肝疫苗产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，病毒颗粒呈病毒，

49、病毒颗粒呈乙型肝炎病毒的结构乙型肝炎病毒的结构球面状，直径为球面状，直径为42 nm，基因组仅为基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要病毒颗粒的主要结构蛋白是表面抗原多肽（结构蛋白是表面抗原多肽（HBsAg）或）或S多肽，它具有糖基化多肽，它具有糖基化和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白包括核心抗原（和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白包括核心抗原（ HBcAg ）、 此外，被乙肝病毒感染的人肝脏还能合成并释放大量的此外，被乙肝病毒感染的人肝脏还能合成并释放大量的22病毒病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。聚合酶、微量病毒蛋白。nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是各种未装配的包装蛋白的的空壳亚病毒颗粒，其免

50、疫原性是各种未装配的包装蛋白的1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽多肽。乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因ATGATGATGTAA108 aa55 aa226 aapreS1preS2SS 多肽226 aaM 多肽281 aaL 多肽399 aa乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的传统乙肝疫苗的制备乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞膜上提取出来的。这种来源的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞

51、膜上提取出来的。这种来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 20世纪世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括主要工作包括将将S多肽的编码置于多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为均颗粒直径为 22 nm，其结构和形态

52、均与慢性乙肝病毒携带者血清中其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。的病毒颗粒相同。 目前，由酿酒酵母生产的重组目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAgHBsAg颗粒的最终产量可达细胞颗粒的最终产量可达细胞总蛋白量的总蛋白量的1%-2%1%-2%。 进一步的研究表明，进一步的研究表明，M M多肽和多肽和L L多肽对多肽对S S型疫苗型疫苗具有显著的增效作具有显著的增效作用，由三者（或两者）构成的用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对还可以诱导那些对 S抗抗原缺乏响应的人群的免疫反应。原缺乏响应的人群的免疫反应。产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝

53、表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建PARS2Bgl II5 AOX1HBsAgPHIS43 AOX1Bgl IIpBSAG15111 kbBgl II5 AOX1 HBsAgPHIS43 AOX1his+的转化子重组分子转化his-的受体细胞染色体DNA产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 由于巴斯德毕赤酵母染色体由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因上还拥有第二个乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。 重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，