第三章 酶的分离纯化

1、第三章第三章 酶的分离纯化酶的分离纯化Contents of chapter 31、酶的提取与分离纯化技术路线2、细胞破碎3、酶的提取4、酶的分离方法5、酶的组合分离纯化策略6、酶的浓缩、干燥与结晶细胞结构与酶分布3.1 3.1 酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。酶酶的纯化过程，约可分为的纯化过程，约可分为三

2、三个阶段个阶段：(1) (1) 粗粗蛋白质蛋白质 (crude (crude protein): protein): 采样采样 均均质质打破细胞打破细胞 抽出全蛋白，抽出全蛋白，多使用多使用 盐盐析析沉淀沉淀法；可法；可以粗略去除蛋白质以外的以粗略去除蛋白质以外的物质。物质。(2) (2) 部分纯化部分纯化 (partially purified): (partially purified): 初步的纯化，使用各钟初步的纯化，使用各钟 柱柱层层析法析法。(3) (3) 均均质酶质酶 (homogeneous): (homogeneous): 目标酶目标酶的的进进一步精制纯化，可用一步精制纯化，

3、可用制备制备式式电泳电泳 或或 HPLCHPLC。酶分离纯化不同阶段酶分离纯化不同阶段3.2 细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂

4、：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理n酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶

5、剂或溶液处理含酶酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。n酶提取时首先应根据酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。溶于酸性溶剂中。n酶都能溶解于水，通常可用酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀

6、碱、稀盐溶液等进行水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。机溶剂提取。 3.3 3.3 酶的提取酶的提取提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、意控制好温度、pHpH值等提取条件

7、。值等提取条件。酶的主要提取方法酶的主要提取方法提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为增加，这称

8、为盐溶现象盐溶现象。 3.4 酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离5、电泳分离6、萃取分离1 1、沉淀分离、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度溶解度降低降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 沉淀分离方法分离原理 盐析沉淀法盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离 等电点沉淀法等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分

9、离 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离（1 1）盐析的机理）盐析的机理破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋于是蛋白质分子周围的水化膜

10、层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。白质分子因热运动碰撞聚集。 破坏水化膜，暴露出疏水区域，破坏水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域由于疏水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，越易沉间作用使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，越易沉淀。淀。 中和电荷，减少静电斥力，中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影在相同离子强度下，盐的种

11、类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱析作用较强，半径大的低价离子作用较弱阴离子盐析效果阴离子盐析效果 ：柠檬酸柠檬酸POPO4 43- 3- SOSO4 42-2- CHCH3 3COOCOO- - ClCl- - NONO3 3- -SCNSCN- -阳离子盐析效果：阳离子盐析效果：NHNH4 4+ + K K+ +NaNa+ + 高价阳离子高价阳离子阴离子的影响大于阳离子阴离子的影响大于阳离子（3）盐析用盐的选择）盐析用盐的选择（4 4）盐析法特点：盐析法特点：n成本低，不需

12、要特别昂贵的设备。成本低，不需要特别昂贵的设备。n操作简单、安全。操作简单、安全。n不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。保持生物活性的纯化蛋白质。1.分离效果不理想，通常只是作为分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯初步的分离纯化化，还需要结合其它的纯化方法。，还需要结合其它的纯化方法。 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法原理原理亲水性有机溶剂加入溶液亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，后降低了介质的介电常数，使溶质使溶质分子之间的静电引分子之间的静电引力增加力增加。水溶性有机溶剂本身的水水溶性有机溶剂本身的水合作用降

13、低了自由水的浓合作用降低了自由水的浓度，度，压缩了溶质分子表面压缩了溶质分子表面原有水化层的厚度，导致原有水化层的厚度，导致溶质分子脱水凝聚。溶质分子脱水凝聚。常用试剂：乙醇、丙酮特点 有机溶剂沉淀法的优点在于其有机溶剂沉淀法的优点在于其分辨率高分辨率高于盐析，加入的有机溶剂于盐析，加入的有机溶剂易除去易除去，且有机溶，且有机溶剂密度低，剂密度低，利于沉淀物分离利于沉淀物分离。其缺点主要是。其缺点主要是比盐析更易比盐析更易使蛋白变性使蛋白变性，需低温操作。，需低温操作。2 2、离心分离、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使

14、不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密颗粒大小、密度和特性的不同度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。常速离心机又称为低速离心机常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在其最大转速在8000 r/min以内，相对离心以内，相对离心力（力（RCF）在）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离

15、。胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机高速离心机的最大转速为（的最大转速为（12.5）104 r/min ，相对离心力达到，相对离心力达到 11041105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活温度升高而造成酶的变性失活,有些高有些高速离心机装设有冷冻装置速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。谓之高速冷冻离心机。超速离心机超速离心机的最大转速达的最大转速达 (2.512)104 r/min，相对离心力

16、可以高达，相对离心力可以高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。分子质量的测定等。离心方法的选择（1）差速离心：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。（2）密度梯度离心：密度梯度的离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。（3）等密度离心：当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，在离心

17、力的作用下，不同浮力密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，一直移动到与它们各自浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。也叫平衡等密度梯度。介质为CsCl等。3 3、过滤与膜分离、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性( (根据过滤介质截留的物质颗粒大小

18、不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) ) 类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤粗滤 2m酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤微滤0.22m细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤超滤200.2m病毒、生物大分子等超滤膜反渗透反渗透 Cl- Br- NO3- ClO4- I- SCN-Cations: Mg2+ Li+ Na+ K+ NH4+n蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱低浓度盐溶液洗脱疏水色谱疏水色谱MacroPrep Methyl HICMacroPrep t-Butyl

19、HIC产品产品操作参数选择操作参数选择疏水色谱疏水色谱疏水介质选择：疏水介质选择：甲基，丁基，苯基甲基，丁基，苯基疏水疏水 疏水性强的蛋白质：甲基，丁基疏水性强的蛋白质：甲基，丁基 疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基盐：硫酸铵，醋酸铵等等盐：硫酸铵，醋酸铵等等缓冲体系和缓冲体系和pH洗脱梯度：高盐上样，低盐洗脱洗脱梯度：高盐上样，低盐洗脱影响疏水性吸附的因素：影响疏水性吸附的因素：离子强度及种类：离子强度及种类：离子强度高吸附作用离子强度高吸附作用增大，高价阴离子能增强疏水性吸附作增大，高价阴离子能增强疏水性吸附作用；用；破坏水化作用的物质：破坏水化作用的物质：离子半径大

20、、电离子半径大、电荷密度低的阴离子可减弱疏水性吸附；荷密度低的阴离子可减弱疏水性吸附；表面活性剂：表面活性剂：可与吸附剂和蛋白质的疏可与吸附剂和蛋白质的疏水部位结合，减弱吸附；水部位结合，减弱吸附；温度：温度：温度越高吸附结合作用越大。温度越高吸附结合作用越大。疏水色谱的特点：疏水色谱的特点：可直接分离盐析后的蛋白质溶液；可直接分离盐析后的蛋白质溶液；可通过调节疏水配基链长和密度调节吸可通过调节疏水配基链长和密度调节吸附力；附力；疏水吸附剂种类多，选择余地大，价格疏水吸附剂种类多，选择余地大，价格不贵。不贵。反相色谱 此法的固定相是采用极性较小的键此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如合固

21、定相，如硅胶硅胶-C18H37、硅胶、硅胶-苯基苯基等；等；流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛一水、水和无机盐的缓冲溶液乙睛一水、水和无机盐的缓冲溶液等。等。 多用于分离多环芳烃等低极性化合物；多用于分离多环芳烃等低极性化合物； 若采用若采用含一定比例的甲醇或乙睛的水溶含一定比例的甲醇或乙睛的水溶液为流动相液为流动相，也可用于分离极性化合物；，也可用于分离极性化合物； 若采用若采用水和无机盐的缓冲液为流动相水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。有机碱、酚类等。 反相色谱法具有

22、柱效高，能获得无拖反相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的尾色谱峰的优点优点。 关于反相键合相色谱的分离机理，可关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓用所谓疏溶剂作用理论疏溶剂作用理论来解释来解释。这种理论这种理论把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的胶表面上的十八烷基的“分子毛分子毛”，这种，这种“分子毛分子毛”有较强的疏水特性。当用极性有较强的疏水特性。当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时：机化合物时： 分离机理：分离机理： 一方面一方面，分子中的非极性部分与固定相表，分子中的非极

23、性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；在固定相中； 而而另一方面另一方面，被分离物的极性部分受到极，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用（见下图）。显然减小其保留作用（见下图）。显然，两种两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为行为。反相色谱特点：反相色谱特点：反相介质性能稳定，分离效率高；反相介质性能稳定，分离效率高；应用范围广：蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、应用范围广：蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、脂类、糖类等；脂类、糖

24、类等；反相介质与分离对象相比价格较高，多限于实反相介质与分离对象相比价格较高，多限于实验室规模的应用，在大规模工业生产中应用较验室规模的应用，在大规模工业生产中应用较少。少。亲和色谱亲和色谱许多物质都具有和某化合物发生特异性许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性。可逆结合的特性。例如：例如：酶与辅酶酶与辅酶或或酶酶与底物与底物（产物或竞争性抑制剂等），（产物或竞争性抑制剂等），抗抗原与抗体原与抗体，凝集素与受体凝集素与受体，维生素与结维生素与结合蛋白合蛋白，凝集素与多糖凝集素与多糖（或糖蛋白、细（或糖蛋白、细胞表面受体），胞表面受体），核酸与互补链核酸与互补链（或组蛋（或组蛋白、核酸

25、多聚酶、结合蛋白）以及白、核酸多聚酶、结合蛋白）以及细胞细胞与细胞表面特异蛋白与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。（或凝集素）等。亲和作用亲和作用 酶酶底物或底物类底物或底物类似物似物外源凝集素外源凝集素多糖化合物多糖化合物抑制剂抑制剂糖蛋白糖蛋白辅因子辅因子细胞表面受体细胞表面受体蛋白蛋白抗体抗体抗原抗原细胞细胞病毒病毒核酸核酸互补碱基链段互补碱基链段细胞细胞组蛋白组蛋白激素、微生物激素、微生物受体蛋白受体蛋白核酸聚合酶核酸聚合酶载体蛋白载体蛋白核酸结合蛋白核酸结合蛋白生物亲和关系生物亲和关系亲和作用力亲和作用力静电作用：静电作用：相反电荷之间的静电引力；相反电荷之间的静电引力；氢键：氢键：氧

26、原子或氮原子之间可以产生氢键；其产生与否受氧原子或氮原子之间可以产生氢键；其产生与否受结合部位之间位置关系的严格制约；结合部位之间位置关系的严格制约；疏水性相互作用：疏水性相互作用：结合部位的疏水区与芳香环或烃基链等结合部位的疏水区与芳香环或烃基链等疏水基之间的作用；疏水基之间的作用；配位键：配位键：如与组氨酸的咪唑基产生的配位键，形成金属螯如与组氨酸的咪唑基产生的配位键，形成金属螯合结构；合结构；弱共价键：弱共价键：氨基和甲酰基之间形成的氨基和甲酰基之间形成的Schiff碱；醛基和羟碱；醛基和羟基之间形成的半缩醛基。可逆、结合力弱。基之间形成的半缩醛基。可逆、结合力弱。亲和色谱法就是利用化学

27、方法将可与待分亲和色谱法就是利用化学方法将可与待分离物质离物质可逆性特异结合可逆性特异结合的化合物（称配体）的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的蛋白质通过此固相载体装柱，当待提纯的蛋白质通过此色谱柱时，此色谱柱时，此蛋白质便与载体上的配体特蛋白质便与载体上的配体特异的结合异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种蛋白质分出去。然后再用适当方法使这种蛋白质分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。离提纯的目的。亲和色谱的原理

28、亲和色谱的原理亲和色谱的分离过程亲和色谱的分离过程亲和色谱法亲和色谱法亲合色谱法是利用或模拟生物分子之间的专亲合色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物样品中分离和分析特一性作用，从复杂生物样品中分离和分析特殊物质的一种色谱方法。殊物质的一种色谱方法。亲合色谱的概念可以理解为配位体以共价键亲合色谱的概念可以理解为配位体以共价键形式与不溶性载体连接作为色谱介质，高选择形式与不溶性载体连接作为色谱介质，高选择性地吸附分离具有生物活性的物质，它将传统性地吸附分离具有生物活性的物质，它将传统亲合色谱的亲合色谱的专一性专一性与与HPLC的的快速快速，稳定稳定，检测检测方便方便等优点结合起来

29、。等优点结合起来。名词解释名词解释亲和色谱操作过程：亲和色谱操作过程：平衡平衡 上样清洗上样清洗 目标产物洗脱目标产物洗脱 色谱柱再生色谱柱再生间隔臂含有间隔臂含有68个亚甲基时亲和吸附作用最大，当亚甲基个亚甲基时亲和吸附作用最大，当亚甲基数超过数超过8时，亲和吸附作用下降。时，亲和吸附作用下降。 纯化效率极高：亲和色谱由于配体与待纯化效率极高：亲和色谱由于配体与待分离物质进行特异性结合，所以分离提纯的分离物质进行特异性结合，所以分离提纯的效率极高，提纯度可达几千倍。效率极高，提纯度可达几千倍。 AC中适宜的脱附剂往往难以得到，在中适宜的脱附剂往往难以得到，在洗脱时常引起欲纯化的蛋白质不同程度

30、的变洗脱时常引起欲纯化的蛋白质不同程度的变性；同时，由于它们比较难以确认和纯化，性；同时，由于它们比较难以确认和纯化，成本高，不易大规模制备，对溶剂敏感，易成本高，不易大规模制备，对溶剂敏感，易降解，限制了它们的应用。降解，限制了它们的应用。亲和色谱的特点亲和色谱的特点Ni金属螯合纯化金属螯合纯化His-Tag 蛋白质常见问题蛋白质常见问题A、目标蛋白挂不住，在流穿组分、目标蛋白挂不住，在流穿组分 1、降低样品、结合和清洗缓冲液的咪唑浓度，可用线性梯度摸索以寻找最佳清、降低样品、结合和清洗缓冲液的咪唑浓度，可用线性梯度摸索以寻找最佳清洗的咪唑浓度；洗的咪唑浓度； 2、检查样品的、检查样品的pH

31、值，在某些样品处理或细菌培养过程中值，在某些样品处理或细菌培养过程中pH可能会下降，需将可能会下降，需将pH调到调到78后再上柱后再上柱 3、His标签可能没有暴露在分子外面：加入微量变性剂（低浓度盐酸胍或尿标签可能没有暴露在分子外面：加入微量变性剂（低浓度盐酸胍或尿素），或在素），或在C端构建端构建His标签的重组载体，重新表达标签的重组载体，重新表达 4、在培养或样品处理中目标蛋白降解：加入蛋白酶抑制剂、在培养或样品处理中目标蛋白降解：加入蛋白酶抑制剂B、洗脱过程中目标蛋白沉淀聚集、洗脱过程中目标蛋白沉淀聚集 1、纯化温度太低：在室温纯化、纯化温度太低：在室温纯化 2、形成聚合体：加入增溶

32、剂、形成聚合体：加入增溶剂(0.1% Triton X-100, Tween 20, 20mM beta巯基乙巯基乙醇，醇，20以内浓度的甘油以内浓度的甘油)，以防止聚合，以防止聚合Ni金属螯合纯化金属螯合纯化His-Tag 蛋白质常见问题蛋白质常见问题C、目标蛋白不够纯、目标蛋白不够纯 1、杂蛋白与目标蛋白一起洗脱：提高清洗缓冲液的咪唑浓度，延长清洗时间，、杂蛋白与目标蛋白一起洗脱：提高清洗缓冲液的咪唑浓度，延长清洗时间，柱体积太大，减小柱体积柱体积太大，减小柱体积 2、更强结合力的组分：当用太高咪唑浓度洗脱时，一些更强结合的组分也一起、更强结合力的组分：当用太高咪唑浓度洗脱时，一些更强结合

33、的组分也一起洗脱下来，可降低洗脱的咪唑浓度，或者用线性梯度洗脱，寻找最佳洗脱浓度洗脱下来，可降低洗脱的咪唑浓度，或者用线性梯度洗脱，寻找最佳洗脱浓度 3、杂质蛋白与目标蛋白以二硫键结合：加入浓度、杂质蛋白与目标蛋白以二硫键结合：加入浓度90% vs. 99.9%) 活性，Activity (active vs. inactive) 含量，Quantity (ng or mg levels) 关键杂质的对数减少，Log reductions of key contaminants 必须了解的蛋白特性必须了解的蛋白特性 分子量与等电点 pH、温度稳定性，pH, temp stability 盐、去

34、污剂、有机溶剂和金属离子的影响 Effects of salt, detergents, organic solvents, metal ions 后转录修饰，Post-translational modifications 选择色谱类型选择色谱类型 变性/非变性，Denaturing/non-denaturing 分辨率，Resolution 得率，Yield 速度，Speed 蛋白质纯化策略蛋白质纯化策略工艺策略工艺策略样品准备样品准备 技术手段：离心，沉淀（硫酸铵、等电点、有机溶剂），技术手段：离心，沉淀（硫酸铵、等电点、有机溶剂），过滤，超滤过滤，超滤包涵体表达的样品：菌液分离，包涵体

35、提取和清洗，包包涵体表达的样品：菌液分离，包涵体提取和清洗，包涵体溶解，复性涵体溶解，复性细胞周质表达的样品：菌液分离，反渗透破菌，沉淀和细胞周质表达的样品：菌液分离，反渗透破菌，沉淀和超滤分离超滤分离细胞和酵母等真核分泌表达的样品：菌液分离，超滤或细胞和酵母等真核分泌表达的样品：菌液分离，超滤或直接捕获纯化直接捕获纯化天然生物材料样品纯化未知蛋白质：不同来源样品处理天然生物材料样品纯化未知蛋白质：不同来源样品处理方法不同：方法不同： 各种微生物发酵液和细胞培养液、动物天然样品（蛇毒、蟾毒、昆虫）、植物天然样品等等工艺策略工艺策略重组蛋白质样品分析重组蛋白质样品分析 表达丰度表达丰度-胞内，胞

36、外胞内，胞外 表达量：样品纯度表达量：样品纯度样品蛋白质浓度样品蛋白质浓度样品体积样品体积 主要杂蛋白：白蛋白，血清蛋白，培养基蛋白，胞内各种杂蛋白，内毒素等等主要杂蛋白：白蛋白，血清蛋白，培养基蛋白，胞内各种杂蛋白，内毒素等等包涵体包涵体 菌液分离，破菌，提取，含量和纯度分析菌液分离，破菌，提取，含量和纯度分析 洗涤：洗涤：1%的中性去垢剂，如的中性去垢剂，如Tween、Triton X-100等，加等，加EDTA和还原剂和还原剂2-巯巯基苏糖（基苏糖（DTT）、）、-巯基乙醇等等，低浓度盐酸胍或尿素巯基乙醇等等，低浓度盐酸胍或尿素 捕获捕获: 快速去除关键杂质，例如能降解目标蛋白的组快速去

37、除关键杂质，例如能降解目标蛋白的组分，如分，如蛋白酶蛋白酶等，浓缩样品，去除高峰度杂质蛋白。等，浓缩样品，去除高峰度杂质蛋白。 中间纯化中间纯化: 去除大部分残留的杂质蛋白。去除大部分残留的杂质蛋白。 精细纯化：精细纯化： 去除与目标蛋白性质接近的残留少量或去除与目标蛋白性质接近的残留少量或微量杂质蛋白。微量杂质蛋白。工艺策略工艺策略工艺策略工艺策略菌液分离，澄清菌液分离，澄清脱盐脱盐捕获捕获中间纯化中间纯化精纯精纯浓缩浓缩离子交换离子交换亲和亲和CHT羟基磷灰石羟基磷灰石疏水疏水亲和亲和离子交换离子交换凝胶过滤（分子筛）凝胶过滤（分子筛）亲和亲和HPLC80120um4080um1050um

38、色谱介质色谱介质颗粒大小颗粒大小各步骤的评价参数各步骤的评价参数 纯度纯度 得率得率 生物活性生物活性 工艺时间工艺时间载量流速分辨率得率工艺策略工艺策略各步骤的评价方法各步骤的评价方法 电泳：电泳：SDS-PAGE，PAGE 蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定 生物活性测定生物活性测定 HPLC分析分析IECCHTHICIECACSECAmmoniumsulfateIECCHTACSECHICIECSECACCHT工艺路线选择工艺路线选择5 5、电泳分离、电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。动的过程称为电泳。电泳

39、方法按其使用的支持体的不同，可以分为： 纸电泳纸电泳 薄层电泳薄层电泳 薄膜电泳薄膜电泳 凝胶电泳凝胶电泳 自由电泳自由电泳 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身本身所带的净电荷量所带的净电荷量，同时受颗粒形状颗粒形状和颗粒大颗粒大小小的影响。此外，还受到电场强度电场强度、溶液溶液pH值值、离子强度离子强度及支持体的特性支持体的特性等外界条件的影响。 n电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同因

40、此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。进而达到分离目的。EtdmABC+-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 （SDS学名为十二烷基磺酸钠）学名为十二烷基磺酸钠）SDSSDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基多肽链中的氨基酸残基按大约按大约1 1 2 2比例结合。比例结合。这样，每一个蛋白质分这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的子都因为结合了许多的SDSSDS而带有大量的负电而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有荷，而蛋白质分子原

41、有的电荷则可以忽略。由的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大且它们的电荷密度也大体相同，因此，体相同，因此，E E q q值接值接近一个常数。所以该法近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白量大小不同而分离蛋白质。质。 等电聚焦电泳：两性电解质载体由多烯多胺与丙烯酸加合得等电聚焦电泳：两性电解质载体由多烯多胺与丙烯酸加合得到，在电场作用下能形成连续的梯度。到，在电场作用下能形成连续的梯度。 电场作用下，毛细管柱中出现：电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现电泳现象和电渗流现象。

42、象和电渗流现象。（一）（一） 电泳电泳 指带电离子在电场中的定向移动，不同指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，离子具有不同的迁移速度，电泳分离是依电泳分离是依据样品在电场中迁移速率的不同。据样品在电场中迁移速率的不同。一一 毛细管电泳概述毛细管电泳概述（二）电渗流现象（二）电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液- -固界固界面形成双电层，二者之间存在电位差。面形成双电层，二者之间存在电位差。 当液体两端施加电压时

43、，当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫表面的移动的现象叫电渗现象电渗现象。 电渗现象中整体移动着的电渗现象中整体移动着的液体叫液体叫电渗流电渗流（electroosmotic flow ，简称，简称EOF）。）。 （三）（三） CE中电渗流的方向中电渗流的方向 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带内表面带负电荷负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；阴极； 内表面带内表面带正电荷正电荷，溶液带负电荷，电渗流

44、流向，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；阳极； 石英毛细管；石英毛细管；内表面带负电荷，电渗流流向阴极；内表面带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：改变电渗流方向的方法： （1 1）毛细管改性）毛细管改性 表面键合阳离子基团；表面键合阳离子基团； （2 2）加电渗流反转剂）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。 (四四)CE中电渗流的流形中电渗流的流形 电荷均匀分布，整体移动，电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流电

45、渗流的流动为平流，塞式流塞式流动动（谱带展宽很小）；（谱带展宽很小）； 液相色谱中的溶液流动为层流，液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型抛物线流型，管壁处，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的流速为零，管中心处的速度为平均速度的2 2倍（引起谱带展倍（引起谱带展宽较大）。宽较大）。 （五）（五）CE中电渗流的作用中电渗流的作用 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5 57 7倍；倍； 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： + + = =电渗流电渗流 + + +ef +ef 阳离子运动方向与电渗流阳离子运动方向与电渗流一致一致； - - = =电渗流电渗流 - - -ef -ef 阴离子运动方向与电渗流阴离子运动方向与电渗流相反相反； 0 0 = =电渗流电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；中性粒子运动方向与电渗流一致；（1 1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2 2）改变电渗流的大小改变电渗流的大小和方向可改变和方向可改变分离效率分离效率和选择性，和选择性，如同改变如同改变L