流式细胞术基本原理及应用课件

1、流式细胞术原理流式细胞术原理(yunl)及应用及应用For FCM Training第一页，共一百四十三页。 流式细胞术=流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry, 简称简称FCM）是一种可以快速、）是一种可以快速、准确、客观准确、客观(kgun)，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选= 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等人工合成微球等=研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以

2、定研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量量第二页，共一百四十三页。 流式细胞仪系统(xtng)简介简介通过通过(tnggu)流式细胞仪我们可以得到以下信息流式细胞仪我们可以得到以下信息 -相对细胞大小相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度染色过细胞的相对荧光强度第三页，共一百四十三页。 Injector TipSheath fluid第四页，共一百四十三页。 流式细胞仪的光信号(xnho)散射光信号(xnho)荧光信号第五页，共一百四十三页。 1. 散射光信号散射光信号(xnho)前向角散射光（前向角散射光（FSC,

3、Forward ScatterFSC,Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信号入射激光的同向散射光信号 细胞相细胞相 对大小及其表面积。对大小及其表面积。 侧向侧向(c xin)(c xin)角散射（角散射（SSC, Side ScatterSSC, Side Scatter） 入射激光入射激光9090 角的角的散射光信号散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。细胞粒度及细胞内相对复杂性。第六页，共一百四十三页。 前向角散射光 FSCFALS SensorLaser第七页，共一百四十三页。 侧向(c xin)角散射光SSCFALS Sensor90LS SensorLaser

4、第八页，共一百四十三页。 散射光散射光能被用来散射光能被用来(yn li)区分不同细胞群体的基区分不同细胞群体的基本形态上的差异本形态上的差异 -通常使用通常使用“散点图散点图”来看散射光信号来看散射光信号 -散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据数据第九页，共一百四十三页。 散点图Dot Plotlysed whole blood第十页，共一百四十三页。 Review QuestionDead cells are known to be smaller and to exhibit more internal complexity than live c

5、ells. Which of the populations on this plot would you expect to be dead?第十一页，共一百四十三页。 2. 荧光荧光(ynggung)信号信号=荧光荧光(ynggung)素吸收激光能量素吸收激光能量=荧光素将吸收能量释放，转换为荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子释放较入射光波长更长的光量子=荧光素与特异抗体结合荧光素与特异抗体结合=荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强号越强第十二页，共一百四十三页。 荧光(ynggung)检测

6、器FreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)第十三页，共一百四十三页。 Two-Color Cell AnalysisWhich of the three populations has the most Ab A binding sites?Ab AAb B第十四页，共一百四十三页。 双色荧光(ynggung)散点图第十五页，共一百四十三页。 现代(xindi)流式细胞仪包括液流系统液流系统(xtng) 聚焦细胞以供检测光学系统光学系统 激发和收集光信号 电子系统电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字

7、化以供计算机分析 第十六页，共一百四十三页。 液流系统(xtng)液流系统将样本悬液聚焦在光源(gungyun)的中心处第十七页，共一百四十三页。 Sample Flow in Optical CuvetteSampleLaminarFlowLow Sample Flow Rate12 mL/minSheathSheathSampleLaminarFlowSheathSheathOptical CuvetteHigh Sample Flow Rate60 mL/min第十八页，共一百四十三页。 Review QuestionWhich of the following would cause

8、disturbance in the laminar flow of the optical cuvette? bubblescellular concentrationA.sample flow rate 第十九页，共一百四十三页。 Optics Excitation optics consist of:- Lasers- Lenses and mirrors that route the laser light to the fluidic stream Collection optics consist of:Filters that direct the signals to the

9、appropriate optical detectors第二十页，共一百四十三页。 Optical Filters460 500 540460 500 540460 500 540LongpassShortpassBandpass第二十一页，共一百四十三页。 FACSCalibur光路图第二十二页，共一百四十三页。 OpticsLaserLaserFluorochromesFluorochromesDetector Detector ParameterParameterFilterFilter第二十三页，共一百四十三页。 ElectronicsConverts analog signals

10、to proportional digital signals Computes Height for each pulseCalculates width and area Interfaces with the computer for data transfer 第二十四页，共一百四十三页。 Creation of a Voltage Pulse - Analog SignalTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltage第二十五页，共一百四十三页。 Quantification of a Voltage PulseTimeVoltsPulse AreaPulse H

11、eightPulse Width0 Height is a measurement for all parameters. Width = Area/Height第二十六页，共一百四十三页。 Effect of the Instrument Controls on the Data第二十七页，共一百四十三页。 Review FL2FL1SSCFSCFL4FL3第二十八页，共一百四十三页。 Review Questions Which of the following fluorochromes cannot be used with the FACSCalibur?DAPI (ex. 345

12、nm, emits 455 nm)Propidium Iodide (ex. 536 nm, emits 617 nm)Alexa Fluor 647 (ex. 650 nm, emits 668 nm)What are the three measurements of a particle that can be determined by FACSCalibur?Briefly describe the functions of the fluidics, optics, and electronics systems.第二十九页，共一百四十三页。 Review Questions Wh

13、at would happen to the population below if you increased the Red parameter value in the Instrument controls?第三十页，共一百四十三页。 Review Questions Which instrument components ensure that the fluorescence signal of a specific fluorochrome is only measured by a designated detector? For example, APC is only me

14、asured by the FL4 detector. 第三十一页，共一百四十三页。 样本(yngbn)处理第三十二页，共一百四十三页。 细胞(xbo)悬液的制备细胞悬液：细胞悬液： 分离分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差并可能引入某些误差 直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小 灌洗液、体腔积液灌洗液、体腔积液 培养细胞、细胞系培养细胞、细胞系实体组织实体组织(zzh)： 病理组织：新鲜样本病理组织：新鲜样本

15、/石蜡包埋样本石蜡包埋样本针吸组织：新鲜样本针吸组织：新鲜样本 鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质第三十三页，共一百四十三页。 步骤一： 选择合适的荧光(ynggung)染料必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发(jf)激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内荧光素光谱的重叠应当尽量减少第三十四页，共一百四十三页。 荧光产生(chnshng)过程第三十五页，共一百四十三页。 Propidium Iodide400 nm500 nm600 nm700 nmPIExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm第

16、三十六页，共一百四十三页。 Fluorescein (FITC)400 nm500 nm600 nm700 nmWavelength300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm第三十七页，共一百四十三页。 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nmPhycoerytherin (PE)Protein第三十八页，共一百四十三页。 Allophycocyanin (APC)300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm第三十九页，共一百四十三页。 FITC和和PE荧光荧光(ynggung)光谱光谱第四十页，共一百四十三页。 补

17、偿补偿(bchng)模型图模型图第四十一页，共一百四十三页。 补偿补偿(bchng)调节前后对比调节前后对比FL1FL2第四十二页，共一百四十三页。 步骤(bzhu)二： 染色体积温度(wnd)孵育时间对照第四十三页，共一百四十三页。 直接(zhji)染色 Fluorescent probe attached to antibody Specific signal: weak Nonspecific binding: low第四十四页，共一百四十三页。 间接(jin ji)染色 Fluorescent probe attached to a 2nd antibody Specific sign

18、al: strong, 5-6 2nd Ab/each 1st Ab; Nonspecific binding: high第四十五页，共一百四十三页。 Avidin-Biotin method Ibiotinylated primary Abbiotinavidinbiotinylated dye第四十六页，共一百四十三页。 示意图第四十七页，共一百四十三页。 步骤(bzhu)三： 数据收集和分析画图寻找目标细胞调整仪器设置到合适的状态我们可以得到(d do)怎样的结果？它们意味着什么？第四十八页，共一百四十三页。 仪器仪器(yq)设置调节设置调节1. 用未染色用未染色(rns)细胞调整仪器细

19、胞调整仪器PMT电压电压2. 用单染色用单染色(rns)的细胞调节仪器补偿的细胞调节仪器补偿第四十九页，共一百四十三页。 关于(guny)同型对照例：一个双色染色的实验 抗体A FITC，抗体B PE 对应(duyng)的同型对照是IgG1 FITC,IgG1 PE那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE单阳性对照： FITC: 细胞加上Ab A FITC, IgG1 PE PE: 细胞加上Ab B PE, IgG1 FITC第五十页，共一百四十三页。 数据分析数据分析设门设定阴性与阳性群体的界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对

20、数或抗体(kngt)结合数第五十一页，共一百四十三页。 如何设定阴性与阳性如何设定阴性与阳性(yngxng)的界限的界限第五十二页，共一百四十三页。 第五十三页，共一百四十三页。 第五十四页，共一百四十三页。 直方图第五十五页，共一百四十三页。 散点图第五十六页，共一百四十三页。 细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小(dxio)=细胞粒度细胞粒度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量=染色体分析染色体分析 细胞细胞(xbo)功能功能=细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的特异核的特异性抗原性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细

21、胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体=细胞凋亡细胞凋亡在上述信号在上述信号(xnho)基础上的细胞分选基础上的细胞分选流式细胞术的细胞学应用第五十七页，共一百四十三页。 流式细胞仪的临床(ln chun)应用= HIV免疫分型，免疫分型，CD4绝对计数绝对计数(j sh)= 白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=肿瘤的细胞周期和倍体分析肿瘤的细胞周期和倍体分析= 网织红细胞计数网织红细胞计数= 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测细胞移植的交叉配型和免疫状态监测= 干细胞计数干细胞计数=残量白血病细胞检查残量白血病细胞检查=HLA-B27检查检

22、查=血小板功能及相关疾病血小板功能及相关疾病第五十八页，共一百四十三页。 流式细胞仪的科研(k yn)应用=免疫功能研究免疫功能研究=癌症病人的多药耐药性癌症病人的多药耐药性=细胞动力学功能研究细胞动力学功能研究=动物性别筛选动物性别筛选=海洋海洋(hiyng)与环境微生物分析与环境微生物分析=染色体分选染色体分选第五十九页，共一百四十三页。 流式细胞仪的遗传学应用(yngyng)细胞细胞DNA, RNA 含量的测定含量的测定染色体倍体分析染色体倍体分析染色体分离染色体分离基因表达产物的生物活性研究基因表达产物的生物活性研究基因转染表达的生物效应基因转染表达的生物效应基因表达调控研究基因表达调

23、控研究细胞内基因定位细胞内基因定位酵母转基因株的筛选酵母转基因株的筛选(shixun)报告基因的定性定量检测报告基因的定性定量检测植物遗传学研究植物遗传学研究 第六十页，共一百四十三页。 Flow Cytometry in clinics and research第六十一页，共一百四十三页。 What can Flow Cytometer tell us about a cell?Cell Lineage/Subset PhenotypeCytokine/ChemokineProduction RepertoireCytokine/ChemokineReceptor RepertoireMig

24、ration/Homing PhenotypreCell cycle status第六十二页，共一百四十三页。 细胞细胞(xbo)增殖（细胞增殖（细胞(xbo)周期）周期） 细胞内DNA含量增殖相关基因的表达(biod)BrdU的结合 示踪染料第六十三页，共一百四十三页。 DNA 探针探针(tn zhn)DNA探针最主要的特点是，它们与DNA含量是成化学化学(huxu)正比正比关系的这样，带有的探针荧光分子的数目就和DNA分子的含量相当，从而检测DNA含量第六十四页，共一百四十三页。 Nucleic acid Probes菲啶基Propidium IodideEthidium Bromide苯

25、甲亚胺Hoechst 33342抗生素Mithramycin, Chromamycin A3Acridine Orange - AOPyronyn Y第六十五页，共一百四十三页。 0 200 400 600 8001000DNA contentCountNormal Cell Cycle 第六十六页，共一百四十三页。 A typical DNA HistogramG0-G1SG2-MFluorescence Intensity# of Events第六十七页，共一百四十三页。 红色为正常(zhngchng)二倍体细胞；黄色为异倍体细胞第六十八页，共一百四十三页。 第六十九页，共一百四十三页。

26、增殖相关增殖相关(xinggun)基因基因PCNA(Proliferating cell nuclear antigen) 一种蛋白质，在DNA复制(fzh)和核苷酸的切除修复中起到作用Ki-67 - proliferation related antigenKi-S1 - proliferation related antigenPhospho-histoneCyclin D1, E, A, B1 第七十页，共一百四十三页。 BrdUrd Incorporation Bromodeoxyuridine (BrdU) 是一个胸腺核苷的类似物 能够在细胞增殖和细胞周期状态分析中起作用BrdU能与

27、正在复制周期内的细胞相结合使用(shyng)BrdU抗体能够检测到BrdU第七十一页，共一百四十三页。 BrdUrd Incorporation第七十二页，共一百四十三页。 细胞分裂的分析(fnx) 哺乳动物的免疫系统需要有大量的增殖，能够确保抗原(kngyun)特异性的T细胞和B细胞具有足够的增殖速度，能够对付治病生物造成的感染CFSE是一种示踪染料，能够均等地在两个子代细胞中分布，其结果可以区分出8-10代的子细胞。 第七十三页，共一百四十三页。 Tracing Dye(CFSE)第七十四页，共一百四十三页。 Apoptotic Cell Death - a genetically enc

28、oded cell death program, which is morphologically, biochemically and molecularly distinct from necrosis第七十五页，共一百四十三页。 Flow cytometry of apoptotic cell death细胞散射光 在细胞调亡中，细胞收缩，从而FSC下降，SSC上升(shngshng)或是没有明显变化第七十六页，共一百四十三页。 第七十七页，共一百四十三页。 Flow cytometry of apoptotic cell death 荧光吸收 细胞的胞膜对于(duy)DNA染料的通透性

29、和细胞的活性、死亡和凋亡相关，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用来区分活细胞、死细胞和凋亡细胞第七十八页，共一百四十三页。 Flow cytometry of apoptotic cell death FCM of Caspases 通过抗体和活化的caspase-3片断相结合来检测 使用特异性的caspase-3荧光(ynggung)底物 新的抗原决定基CK18第七十九页，共一百四十三页。 第八十页，共一百四十三页。 Flow cytometry of apoptotic cell death TMP会在调亡中产生，可以通过一些标记(bioj)用流式细胞仪检测。使用有膜穿透性

30、的亲脂性阳离子荧光染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos等，可作为流式检测的探针。 当细胞发生调亡时，一个线粒体膜表面蛋白7A6抗原会出现 Bcl-2/bax family of proteins. 第八十一页，共一百四十三页。 第八十二页，共一百四十三页。 第八十三页，共一百四十三页。 Flow cytometry of apoptotic cell death 胞浆内Ca2+ 水平(shupng)的上升和由于细胞内环境酸化造成的选择性的pH值的调节降低是伴随着细胞凋亡产生的后果之一。 使用Ca2+ 选择性荧光探针，如 Quin-2, Fluo-3, Indo-1 通过流

31、式检测是测定细胞内Ca2+浓度的最佳方案 酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等进行检测 第八十四页，共一百四十三页。 Flow cytometry of apoptotic cell death第八十五页，共一百四十三页。 第八十六页，共一百四十三页。 Flow cytometry of apoptotic cell deathDNA 链的断裂链的断裂 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。 断裂的末端(m dun)可以

32、通过末端(m dun)转脱氧核苷酰酶(TdT)连接上dUTP。第八十七页，共一百四十三页。 第八十八页，共一百四十三页。 第八十九页，共一百四十三页。 第九十页，共一百四十三页。 Flow cytometry of apoptotic cell death细胞DNA含量 在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种(y zhn)亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。第九十一页，共一百四十三页。 Flow Cytometry of Apoptotic CellsPI - Fluoresc

33、ence# EventsApoptotic cellsNormal G0/G1 cells第九十二页，共一百四十三页。 An Integrated Approach to Cell Immunology第九十三页，共一百四十三页。 Immune Function assay 免疫免疫(miny)细胞亚群检测细胞亚群检测 Antigen-peptide specific T cells 检测检测 T-cells 活化活化 Treg Cells 细胞内细胞因子细胞内细胞因子/趋化因子检测趋化因子检测 磷酸化磷酸化第九十四页，共一百四十三页。 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析(fnx)(fnx)根据

34、功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控(jin kn)功能， 能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。第九十五页，共一百四十三页。 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析(fnx)(fnx)根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+）T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）Th/Ts 评价那些自身免疫(miny)失调或被怀疑是免疫(miny)失调或已知患有免疫(miny)缺陷的病人的免疫(mi

35、ny)状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻击 Th/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLE） Th/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血第九十六页，共一百四十三页。 第九十七页，共一百四十三页。 Traditional Analysis - Percent positivePositive cellNegative Cell CD4 PECD4 PE第九十八页，共一百四十三页。 Absolute Counts - Cells per m mLPositive CellAbsolute Count BeadsNegative CellCD4 PE

36、CD4 PE第九十九页，共一百四十三页。 抗原抗原(kngyun)特异性特异性T细胞细胞 提供检测者一个强有力的工具用于研究对病毒抗原的免疫应答和疫苗(ymio)的开发第一百页，共一百四十三页。 MHC: Class I and Class II Gene ProductsT cell受体不直接受体不直接(zhji)和可溶性抗原相连和可溶性抗原相连 抗原必须通过MHC由抗原呈递细胞传递给T细胞 (Macrophages, Dendritic cells, B cells)MHC Class I Gene Products 呈递抗原给 CD8+ T cells 诱导细胞毒应答MHC Class

37、II Gene Products 呈递抗原给 CD4+ T cells 诱导细胞因子产生，免疫球蛋白的分泌第一百零一页，共一百四十三页。 MHC/TCR Signaling第一百零二页，共一百四十三页。 二聚体可溶性MHC类似物与四聚体的比较(bjio)第一百零三页，共一百四十三页。 Quantitation of antigen-specific T lymphocytes in peripheral blood HAMControlHIVCD8Tax-A2/IgGag-A2/Ig第一百零四页，共一百四十三页。 Treg细胞(xbo)的检测Treg细胞与自身免疫耐受相关，通常的检测方法用CD

38、4阳性细胞中CD25高表达，同时结合(jih)胞内FoxP3含量来判断最新发现人的Treg细胞低表达CD127。CD127的表达模式与Foxp3很接近，说明低表达CD127，高/中表达CD25的CD4阳性的T淋巴细胞就是Treg细胞（调节性T细胞）。该方法比胞内检测Foxp3的优点在于，检测后的细胞可用于后续的培养及其他的体外试验。另外的优点是用这种检测方案分选的Treg细胞得率更高。 第一百零五页，共一百四十三页。 第一百零六页，共一百四十三页。 Immune Function Assays - A Powerful Research Tool for Answering Basic Bio

39、logical Questions in.AIDS或癌症机理的研究或癌症机理的研究(ynji)T cell亚群对于病毒和细菌抗原的反应亚群对于病毒和细菌抗原的反应细胞介导的对机会感染的免疫反应细胞介导的对机会感染的免疫反应药物药物/疫苗的效果评价疫苗的效果评价 免疫调节免疫调节移植监控移植监控毒理研究毒理研究第一百零七页，共一百四十三页。 第一百零八页，共一百四十三页。 第一百零九页，共一百四十三页。 第一百一十页，共一百四十三页。 Traditional Cytokine Flow CytometryIL-2 PhycoerythrinCD4 FITC第一百一十一页，共一百四十三页。 细胞因

40、子检测细胞因子检测(jin c)细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞免疫功能(gngnng)调节方面发挥重要作用。细胞因子可以调节多种细胞的生长、分化和功能(gngnng)，调节正常与病理状态下的免疫应答，研究生理或病理免疫调节因素所致细胞因子合成的应答与改变是研究疾病病因与免疫状态的重要工具。第一百一十二页，共一百四十三页。 T细胞细胞(xbo)的细胞的细胞(xbo)因子分型因子分型=型细胞介导免疫反应=引起迟发过敏反应、巨噬细胞活化、2型反应下调=刺激来源：病毒、某些细菌=型体液(ty)介导免疫反应=引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反应下调=刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源第一百一十三

41、页，共一百四十三页。 细胞因子细胞因子第一百一十四页，共一百四十三页。 Biological Variation Among CMV-seropositive Donors in Response to CMV第一百一十五页，共一百四十三页。 CFC & Proliferation使用温和的方法进行细胞(xbo)破膜和固定，在中性pH值条件下，使细胞和BrdU结合，可以同时检测到： S期 细胞周期 表型 活化状态 核型决定基 胞浆内决定基 细胞因子/趋化因子 其他. 第一百一十六页，共一百四十三页。 CFC & ProliferationAllows the correlati

42、on of: Phenotype Cytokine expressionCell CycleProliferation第一百一十七页，共一百四十三页。 BD Phosflow磷酸化检测(jin c)系统更好的特异性的抗体建立在单个细胞基础上的检测可以同时检测多个参数(cnsh)快速、灵敏、样本量更少第一百一十八页，共一百四十三页。 YYYY非磷酸化特异性抗体检测全部(qunb)的相关蛋白 unphosphorylated + phosphorylated亚型 抗原：重组的蛋白质片断磷酸化特异性抗体 仅仅检测磷酸化亚型 抗原：合成的 4-10mer磷酸化肽段Y磷酸化特异性和非磷酸化特异性抗体(k

43、ngt)的差异第一百一十九页，共一百四十三页。 BD PhosFLOW和和Western blot 的比较的比较(bjio)A theoretical experiment comparing Western blot and flow cytometry with three samples and a protein of interest at 1, 10, or 50 copies per cell. Sample 2 and 3 look the same via Western blot, but when stained with fluorescently labeled an

44、tibodies, the differences between the samples become more relevant. (Source: P.O. Krutzik et al. / Clinical Immunology 110 (2004) 206221)第一百二十页，共一百四十三页。 BD PhosFlowGenomics & Proteomics - Single Cells Have Big Proteomics Story to Tell. BD PhosFlow not only tells you activation of a single cell f

45、or one particular phospho protein and pathway, but allows you to study multiple phosphorylation events and pathways simultaniously.第一百二十一页，共一百四十三页。 100101102103104100101102103104PBMC050100150200250FSC-H050100150200250SSC-HCD20 PerCP-Cy5.5CD3 PE Zap70 (Y319)/Syk (Y352) Alexa 647 100101102103104020406

46、080100100101102103104020406080100100101102103104020406080100100101102103104100101102103104CD3 PE 100101102103104020406080100100101102103104020406080100100101102103104020406080100CD3-/CD20+ CD3+/CD20- CD3-/CD20-CD20 PerCP-Cy5.5Whole Blood CD3 CrossLink 050100150200250FSC-H050100150200250SSC-H21.8Mult

47、i-Color PhosFlow in CD3/CD28 or CD3 crosslinked human PBMCs or Whole BloodCD3/CD28 CrosslinkUntreated cells (unshaded) vs treated cells (shaded)第一百二十二页，共一百四十三页。 BD CBA 一种一种“三明治三明治”免疫测定法免疫测定法 使用结合有高亲和性抗体的小球(xio qi)，用来特异性地捕获可溶性的抗原. 用荧光检测抗体来检测被捕获的抗原 使用流式细胞仪进行检测分析第一百二十三页，共一百四十三页。 第一百二十四页，共一百四十三页。 Multip

48、lexed BeadsShades of a colorAntibody coupled beads, emitting at distinct FL3 intensitiesVarious analytesAntibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.第一百二十五页，共一百四十三页。 Multiplexed Beads0 pg/mL80 pg/mL1250 pg/mL5000 pg/mLFL3 Beads FL2 (PE)第一百二十六页，共一百四十三页。 使用 BD Cyto

49、metric Bead Array(CBA) 系统(xtng)你可以: 从单一小体积样本中得到多项检测结果 对所有的检测项目(xingm)，只需要制备一个标准混合物来绘制标准曲线 避免人为造成的酶联放大的假阳性信号产生 用更少的时间和精力，却得到大量的结果 如果是用488nm和635nm两根激光器来实验，实验条件更容易建立 使用配有HTS选件的BD流式细胞仪可以做到自动平板上样和高通量检测第一百二十七页，共一百四十三页。 目前CBA主要(zhyo)提供的检测内容可溶性细胞因子细胞(xbo)凋亡相关蛋白磷酸化蛋白第一百二十八页，共一百四十三页。 BD CBA Flex SetABCDEFGHI1

50、 2 3 4 5 6 7 8 9FL4-H or Red-AFL3-H or NIR-AOld Format BD CBA BeadsBD CBA Flex Set Beads第一百二十九页，共一百四十三页。 更为(n wi)灵活强大的CBA Flex Set最多可同时检测72个项目(xingm)可自由选择搭配检测项目检测项目范围更广泛需要488nm和635nm两种波长的激光器ABCDEFGHI1 2 3 4 5 6 7 8 9FL4-H or Red-AFL3-H or NIR-A第一百三十页，共一百四十三页。 9 9个指标同时检测个指标同时检测(jin c)(jin c)活化活化T T细胞

51、细胞1234567891. Itk (Y511)2. ERK (T202/Y204)3. JNK (T183/Y185)4. P38 (T180/Y182)5. PLCg g (Y783)6. ZAP70 (Y319)7. LAT (Y171)8. c-Jun (S63)9. RSK (S380)第一百三十一页，共一百四十三页。 Kinetics of Jurkat Cell Activation With Anti-Kinetics of Jurkat Cell Activation With Anti-CD3/CD28CD3/CD28110100FOLD INCREASE IN UNITS

52、/ML05101520TIME (MINUTES)RSK (S380)Jun (S63)LAT (Y171)Itk (Y511)ZAP-70 (Y319)PLCg g (Y783)P38 (T180/Y182)JNK (T183/Y185)ERK (T202/Y204)P-Specific Antibodies第一百三十二页，共一百四十三页。 Monitoring the T Cell Activation Pathway by Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA (Control)CBA (Control)LckZAP-70PItk

53、PPMAPKKKPIKKPNF-kBRasGrb2SOSRacPPPLCPPDAGPKCPVAVSLP-76PLATPPPPPP PPPPPPRasMEKERKJNKp38MKK4,7MKK3,6MEKK1-4ElkJunATF2MEKK4LATPPRSKSpecificitySpecificity UnstimulatedUnstimulatedAnti-CD3Anti-CD3Change Change % of Control% of ControlZAP-70108763655100Itk3711477100LAT42212170100PLCg609881272100ERK1043050

54、2946100JNK131272141100p3852729252398100c-Jun209351142100RSK55440385100Cells were activated with anti-CD3/CD28 for 2 minutes. SDS was added to a final concentration of 1% and the material was placed in a boiling water bath for 5 minutes.第一百三十三页，共一百四十三页。 Monitoring the T Cell Activation Pathway by Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA (PD-98059)CBA (PD-98059)SpecificitySpecificity UnstimulatedUnstimulatedAnti-CD3Anti-CD3ChangeChange% of Control%