人工种子与脱毒ppt课件

1、第第4章章 人工种子人工种子 与植物脱毒与植物脱毒1.人工种子人工种子2.植物脱毒植物脱毒1 1 人工种子人工种子 农业消费中运用的天然种子，普通都是由种皮、胚乳和农业消费中运用的天然种子，普通都是由种皮、胚乳和胚三部分构成。种皮通常在种子的外层起维护作用；胚乳胚三部分构成。种皮通常在种子的外层起维护作用；胚乳含有大量的营养物质，是种苗萌生生长不可短少的营养来含有大量的营养物质，是种苗萌生生长不可短少的营养来源；胚由胚芽、胚轴、胚根和子叶构成，未来发成植株。源；胚由胚芽、胚轴、胚根和子叶构成，未来发成植株。 农业生物技术的开展，经过组织培育技术，可把植物组农业生物技术的开展，经过组织培育技术，

2、可把植物组织的细胞培育成在形状及生理上与天然种子胚类似的胚状织的细胞培育成在形状及生理上与天然种子胚类似的胚状体，也叫作体细胞胚。这种体细胞胚有于叶、根、茎分生体，也叫作体细胞胚。这种体细胞胚有于叶、根、茎分生组织的构造。科学家把体细胞胚包埋在胶囊内构成球状构组织的构造。科学家把体细胞胚包埋在胶囊内构成球状构造，使其具备种子机能。所以，人工种子是一种人工制造造，使其具备种子机能。所以，人工种子是一种人工制造的替代天然种子的颗粒体，可以直接播种于田间。的替代天然种子的颗粒体，可以直接播种于田间。 人工种子的概念人工种子的概念 l 人工种子人工种子artificial seeds)又称合成种子又称

3、合成种子synthetic seeds)或体细胞种子或体细胞种子somatic seeds)。是将植物离体培育产。是将植物离体培育产生的体细胚包埋在含有营养成分生的体细胚包埋在含有营养成分和维护功能的物质中，在适宜的和维护功能的物质中，在适宜的条件下发芽出苗。条件下发芽出苗。l 人工种子的概念首先是人工种子的概念首先是1978年由年由Murashige在第四届国际植在第四届国际植物组织细胞培育大会上提出的。物组织细胞培育大会上提出的。他以为随着组织培育技术的不断他以为随着组织培育技术的不断开展，可以用少量的外植体同步开展，可以用少量的外植体同步培育出众多的胚状体，这些胚状培育出众多的胚状体，这

4、些胚状体被包埋在某种胶囊内使其具有体被包埋在某种胶囊内使其具有种子的功能，可以直接用于田间种子的功能，可以直接用于田间播种。播种。 人工种子的优点人工种子的优点l1 1培育条件可以人为控制，具有省地省工可直接在培育条件可以人为控制，具有省地省工可直接在田间播种等优点。田间播种等优点。l2 2在人工种子制造中，可参与营养物质、植物生长在人工种子制造中，可参与营养物质、植物生长调理剂、固氮菌、杀虫剂等。调理剂、固氮菌、杀虫剂等。l3 3用于制造人工种子的体细胞胚，可利用生物反响用于制造人工种子的体细胞胚，可利用生物反响器大规模培育，大大提高了效率。器大规模培育，大大提高了效率。l4 4一些难以得到

5、天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于消费。因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于消费。以体细胞胚为繁衍体的人工种子以体细胞胚为繁衍体的人工种子以器官为繁衍体的人工种子以器官为繁衍体的人工种子1.1 人工种子的制造人工种子的制造 人工种子制备包括胚状体的诱导与同步化、人工种子制备包括胚状体的诱导与同步化、人工种子的包埋、人工胚乳的制造、人工种皮人工种子的包埋、人工胚乳的制造、人工种皮的制造、人工种子贮藏等步骤内容。的制造、人工种子贮藏等步骤内容。 1.1.1 胚状体的诱导与同步化发育胚状体的诱导与同步化发育 不论是哪一

6、种方式产生的胚状体，在发生不论是哪一种方式产生的胚状体，在发生和发育过程中普通是不同步的。所以在一个资和发育过程中普通是不同步的。所以在一个资料中同时可以见到各个不同发育时期的胚状体。料中同时可以见到各个不同发育时期的胚状体。因此，控制胚状体同步发育是人工种子制备的因此，控制胚状体同步发育是人工种子制备的关键环节之一。关键环节之一。l 1胚状体的诱导：l 胚状体可从悬浮培育的单细胞得到，也可经过试管培育的愈伤组织、花粉或胚囊获得。胚状体普通在培育物的外表产生，其外形与合子胚类似，但胚状体却是无性繁衍的产物。实践操作中，普通在试管中诱导出愈伤组织，并在含生长素的培育液中悬浮培育，然后置于含生长素

7、的发酵罐中，使细胞迅速扩增，再将细胞移入无生长素的发酵罐中诱导出大量胚状体。l2胚状体同步化处置或分选：l胚状体的同步化是指促使一切培育的细胞或发育中的细胞团块进入同一个分裂时期。只需同步化了细胞才能够成批地产出成熟胚胎。常用的方法有：l1化学方法：饥饿法将培育基中的一些重要成分反复去除和添加；阻断法在培育初期加如DNA合成抑制剂，如5-氨基脲嘧啶，阻断细胞分裂的G1期。l2物理方法：低温处置法、过滤挑选法、浸透压分别法、密度梯度离心法(体胚不同的发育阶段密度有差别)等到胚状体胎成熟以后，就可以进展人工种子的包埋了。其中过滤挑选法较适用、快速。1.1.2 人工种皮制备人工种皮制备l分内种皮和外

8、种皮分内种皮和外种皮l对人工种皮的要求：具有维护胚的功能，并且无毒性、通气对人工种皮的要求：具有维护胚的功能，并且无毒性、通气好、抗污染、抗压性好、不粘连、适于贮藏和运输。好、抗污染、抗压性好、不粘连、适于贮藏和运输。l内种皮常用资料：聚氧乙烯、海藻酸钠、明胶、琼脂等。内种皮常用资料：聚氧乙烯、海藻酸钠、明胶、琼脂等。l外种皮常用资料：外种皮常用资料：l Elvax 4260(乙烯、乙烯基乙酸和丙烯酸乙烯、乙烯基乙酸和丙烯酸共聚物，共聚物，1987，美国，美国)涂膜，价高，操作涂膜，价高，操作复杂，效果不佳。复杂，效果不佳。l Tullanox和和Cab-0-sil(二氧化硅化合物，二氧化硅化

9、合物，以粉末状包裹在人工种子胶囊外层，操作以粉末状包裹在人工种子胶囊外层，操作时只需将胶囊在资料中滚动即可。时只需将胶囊在资料中滚动即可。l 硅酮种衣，能抗真菌，渗入水蒸汽和氧气，硅酮种衣，能抗真菌，渗入水蒸汽和氧气，处于实验之中。处于实验之中。1.1.3 人工胚乳配制l成分：无机盐混合物、碳水化合物糖和淀粉、蛋白质、成分：无机盐混合物、碳水化合物糖和淀粉、蛋白质、植物生长调理剂。植物生长调理剂。l 糖分存在容易导致微生物感染而腐烂，所以人工胚乳糖分存在容易导致微生物感染而腐烂，所以人工胚乳中也要参与防腐剂、抗菌素、有益菌类等。中也要参与防腐剂、抗菌素、有益菌类等。l 选用无毒、透气和吸水性强

10、的木薯淀粉与选用无毒、透气和吸水性强的木薯淀粉与1.5%1.5%海藻酸钠海藻酸钠(1/2MS(1/2MS培育基配制培育基配制) )混合制造的胚乳可改善单一海藻酸钠混合制造的胚乳可改善单一海藻酸钠人工胚乳的透气性、吸水性和发芽率，人工胚乳中参与人工胚乳的透气性、吸水性和发芽率，人工胚乳中参与赤霉素赤霉素 GA3GA3有利于人工种子的发芽，参与有利于人工种子的发芽，参与CaCl2 CaCl2 有利有利于向培育物供氧，提高人工种子发芽率和耐贮藏性，加扩于向培育物供氧，提高人工种子发芽率和耐贮藏性，加扩活性炭可改善营养固定和缓释，提高人工种子在土壤中的活性炭可改善营养固定和缓释，提高人工种子在土壤中的

11、成苗率。成苗率。 1.1.4 包埋包埋l水凝胶法水凝胶法l 是最常用的一种方法。是最常用的一种方法。即用海藻酸钠等水溶性凝即用海藻酸钠等水溶性凝胶经与钙离子进展离子交胶经与钙离子进展离子交换后凝固，用于包埋单个换后凝固，用于包埋单个胚状体。种子硬度由凝胶胚状体。种子硬度由凝胶浓度与络合物离子交换时浓度与络合物离子交换时间决议。间决议。lCaCl2CaCl2浓度：浓度：2.0%-2.5%2.0%-2.5%l离子交换时间：离子交换时间：20min-20min-30min30minl无菌水漂洗无菌水漂洗20min20min1.2 贮藏贮藏l1.2.1 贮藏条件：贮藏条件：l 47低温、相对湿度小于低

12、温、相对湿度小于67%l1.2.2 贮藏中存在的问题：贮藏中存在的问题：l 种胚质量不高、后期停顿生长、胚腐烂、种种胚质量不高、后期停顿生长、胚腐烂、种子失水干缩等。子失水干缩等。l1.2.3 处理措施：处理措施：l 胚乳中添加防腐剂、抗生素、控制糖含量、胚乳中添加防腐剂、抗生素、控制糖含量、低温贮藏，种皮外包裹滑石粉、液体石蜡等成低温贮藏，种皮外包裹滑石粉、液体石蜡等成分。分。存在问题l许多重要的植物目前还不能靠组织培育快速产许多重要的植物目前还不能靠组织培育快速产生大量的、出苗整齐一致的、高质量的体细胞生大量的、出苗整齐一致的、高质量的体细胞胚或不定芽。胚或不定芽。l包埋剂的选择及制造工艺

13、方面尚需改良，以提包埋剂的选择及制造工艺方面尚需改良，以提高体胚到正常植株的转化率，并到达加工运输高体胚到正常植株的转化率，并到达加工运输方便、防干防腐耐贮藏的目的。方便、防干防腐耐贮藏的目的。l如何进展大量制种和大田播种，实现机械化操如何进展大量制种和大田播种，实现机械化操作等方面配套技术尚需进一步研讨。作等方面配套技术尚需进一步研讨。 小结小结n人工种子是在实验室人工控制条件下消费的繁人工种子是在实验室人工控制条件下消费的繁衍体。衍体。n人工种子繁衍体包括体细胞胚、微型器官和微人工种子繁衍体包括体细胞胚、微型器官和微芽，根据植物种类不同可适中选择。芽，根据植物种类不同可适中选择。n人工种子

14、运用的根本条件是繁衍体的工厂化消人工种子运用的根本条件是繁衍体的工厂化消费和配套技术的成熟。费和配套技术的成熟。n无性繁衍植物的人工种子有望最先得以运用。无性繁衍植物的人工种子有望最先得以运用。2. 植物脱毒植物脱毒l 植物病毒病是作物的重要病害种类之一植物病毒病是作物的重要病害种类之一,目目前已发现的植物病毒病害已超越前已发现的植物病毒病害已超越 700种种,几乎每几乎每种作物上都有一种、几种甚至十几种病毒危害种作物上都有一种、几种甚至十几种病毒危害,它们防治困难它们防治困难,危害严重危害严重,给农业消费带来了宏大给农业消费带来了宏大的损失的损失,特别是木本植物和靠营养繁衍的植物特别是木本植

15、物和靠营养繁衍的植物,危危害性更大一些。在植物病毒病害防治上害性更大一些。在植物病毒病害防治上,植物脱植物脱毒技术得到广泛运用。毒技术得到广泛运用。 2.1 2.1 脱毒方法脱毒方法 物理法：热处置脱毒物理法：热处置脱毒 化学法：药剂处置化学法：药剂处置 生物法：茎尖培育脱毒生物法：茎尖培育脱毒 1热处置脱毒原理：热处置脱毒原理： 病毒是病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后，随大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞植物细胞DNA一同复制。热处置并不能杀死细胞，一同复制。热处置并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停顿，而

16、失去病毒的侵染才干。或增殖停顿，而失去病毒的侵染才干。热处置是一种物理效应，可加速植物细胞分热处置是一种物理效应，可加速植物细胞分裂，在猛烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，裂，在猛烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁衍的竞争中取胜。因此加速使植物细胞在与病毒繁衍的竞争中取胜。因此加速分生组织细胞的分裂，可以获得无病毒植株。分生组织细胞的分裂，可以获得无病毒植株。 2.1.1 物理方法热处置脱毒 根据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用这一差别，选择适当的温度和处置时间，进展高温处置，就能使寄主体内病毒浓度降低，传送速度减慢或失去活性，而寄主细胞依然存活，并加快分裂和生长。热

17、处置区热处置区低低温温高高温温生长区生长区寄主无损伤寄主无损伤病原微生物被消除病原微生物被消除寄主被杀死寄主被杀死BAC2热处置脱毒方法热处置脱毒方法(1) 温汤浸渍处置温汤浸渍处置 适用于休眠器官，在适用于休眠器官，在50左右的温水左右的温水中浸渍中浸渍10min至数小时，方法简便易行，至数小时，方法简便易行，但易使资料受伤。但易使资料受伤。2热空气处置热空气处置 热空气处置对活泼生长的茎尖效果较好。热空气处置对活泼生长的茎尖效果较好。将生长的盆栽植株移入温热治疗箱内，将生长的盆栽植株移入温热治疗箱内，普通普通35-40。处置时间因植物而异，短。处置时间因植物而异，短那么几非常钟，长可达数月

18、。那么几非常钟，长可达数月。热处置广泛运用于葡萄、草莓、马铃薯热处置广泛运用于葡萄、草莓、马铃薯和菊花等植物。如：葡萄置于和菊花等植物。如：葡萄置于38 可去除扇可去除扇叶病毒。叶病毒。热处置对葡萄扇叶病毒、草莓斑驳病毒、热处置对葡萄扇叶病毒、草莓斑驳病毒、苹果花叶病毒等球形病毒有作用，而对另一苹果花叶病毒等球形病毒有作用，而对另一些病毒不起作用，因此，必需与茎尖培育相些病毒不起作用，因此，必需与茎尖培育相结合脱毒效果更好。结合脱毒效果更好。2.1.2 化学方法脱毒化学方法脱毒l 又称化学疗法。一些化学药品如嘌呤和嘧啶；类似物、氨基酸、抗生素处置，可在某种程度上抑制植物体内或离体叶片内病毒的合

19、成，但仍不能是病毒失活。l 近年发现三氮唑核苷1D呋喃核糖1，2，4三氮唑用于防治一系列动物DNA和RNA病毒，对植物也有效。将感染了马铃薯Y型病毒PVY、黄瓜花叶病CMV)或烟草花叶病毒TMV的叶柄，培育在三氮唑核苷的MS培育基上，子代植株那么除去病毒，而对照那么无效，阐明三氮唑核苷抑制病毒的增殖。 2.1.3 2.1.3 生物法生物法茎尖脱毒茎尖脱毒 茎尖微体嫁接茎尖微体嫁接 愈伤组织诱导脱毒愈伤组织诱导脱毒珠心胚培育法珠心胚培育法花药培育脱毒花药培育脱毒1 1茎尖培育脱毒原理茎尖培育脱毒原理2 2培育基培育基3 3茎尖培育方法茎尖培育方法4 4影响微茎尖培育的要素影响微茎尖培育的要素外植

20、体大小外植体大小 培育条件培育条件 外植体的生理形状外植体的生理形状1 1茎尖培育脱毒茎尖培育脱毒 1茎尖培育脱毒原理 病毒在植物体内分布不均匀，其数量随植株部位及年龄而异，越接近茎顶端区域，病毒感染的程度越低，生长点即分生组织约0.1-1mm几乎不含或含病毒很少。 植物的去病毒技术，本质上就是采取不含病毒颗植物的去病毒技术，本质上就是采取不含病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的粒或病毒颗粒含量甚少的0.10.5mm带带12个叶原基的茎尖作为外植体，进展微繁衍，使个叶原基的茎尖作为外植体，进展微繁衍，使其培育成完好的无病毒小植株的技术。其培育成完好的无病毒小植株的技术。 1、植物体病毒的挪动的2条途径

21、：维管系统和胞间连丝。 2、植物细胞分裂和病毒繁衍之间存在相互竞争 3、茎尖中存在高程度内源激素，可抑制病毒的增殖。 4、在植物体内存在有一种“病毒钝化系统，在分生组织中的活性最高，因此使分生组织不受侵染。 分生组织不带病毒，能够有分生组织不带病毒，能够有4方面的缘由：方面的缘由：2培育基 普通以White、MS为根本培育基，提高钾盐和铵盐含量有利于茎尖生长。MS培育某些植物茎尖时，有些离子浓度过高应稀释。在双子叶植物中，激素能够在第2对叶原基中合成，所以茎尖的圆锥组织生长激素不能自给，必需参与生长素与细胞分裂素，浓度要适宜。在生长素中应防止用易促进愈伤组织化的2，4-D，宜用NAA或IBA；

22、细胞分裂素用KT或BA；GA3对某些植物茎尖培育有用。3茎尖的培育方法 需求一台解剖镜8-40倍。 剥离茎尖要迅速并尽快接种，或在一个衬有无菌湿滤纸的培育皿内进展操作，以防茎尖变干。 消毒：叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹、马铃薯等，那么要用0.1%次氯酸钠外表消毒10min。离体茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响离体茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响 切取茎尖越小脱毒效果越好，但太小不易切取茎尖越小脱毒效果越好，但太小不易成活，过大又不能保证完全出去病毒，所以茎成活，过大又不能保证完全出去病毒，所以茎尖大小要适宜。尖大小要适宜。The Apica

23、l Meristem 剥取茎尖过程剥取茎尖过程: 解剖镜下用解剖针将叶片剥掉，解剖针要常消毒。当解剖镜下用解剖针将叶片剥掉，解剖针要常消毒。当一个半圆球的顶端分生组织充分暴显露来之后，用解剖刀一个半圆球的顶端分生组织充分暴显露来之后，用解剖刀片将带片将带1-2个叶原基的分生组织切下，接到培育基上。个叶原基的分生组织切下，接到培育基上。 将接种的茎尖置于将接种的茎尖置于22左右温度下。左右温度下。 2000-3000lx 16h/d 光照下培育。由于在低温暖短日照下，茎尖有能够光照下培育。由于在低温暖短日照下，茎尖有能够进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必需保证。进入休眠；所以较高的温度和

24、充足的日照时间必需保证。微茎尖需数月才干胜利。微茎尖需数月才干胜利。 茎尖培育的继代培育和生根培育和普通器官的培育一样。 茎尖培育脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。 4 4影响微茎尖成活及脱毒的要素影响微茎尖成活及脱毒的要素首先是母体资料病毒侵染程度首先是母体资料病毒侵染程度被单一病毒感染的植株脱毒较容易，复合被单一病毒感染的植株脱毒较容易，复合感染的较难。感染的较难。 外植体大小外植体大小 在最适培育条件下，外植体的大在最适培育条件下，外植体的大小决议茎尖的存活率，外植体越大，产生小决议茎尖的存活率，外植体越大，产生再生植株的时机也就越多。除了

25、外植体的再生植株的时机也就越多。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织构成植株的才干，普通以为，叶原基组织构成植株的才干，普通以为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。长素和细胞分裂素。 培育条件培育条件 在茎尖培育中，光下培育的效果通常比暗培育效果在茎尖培育中，光下培育的效果通常比暗培育效果好，如马铃薯茎尖培育时，当茎已长到好，如马铃薯茎尖培育时，当茎已长到1cm高时，光高时，光照强度便添加到照强度便添加到4000 lx。 外植体的生理形状外植体的生理形状 茎尖最好要由活泼生长的芽上

26、切取。茎尖最好要由活泼生长的芽上切取。 取芽的时间也很重要，普通选萌动期较好。否取芽的时间也很重要，普通选萌动期较好。否那么采用适当的处置，突破休眠才干进展。那么采用适当的处置，突破休眠才干进展。 茎尖与热处置相结合方法茎尖与热处置相结合方法 能抑制单独茎尖培育时，茎尖过小成活率太低，能抑制单独茎尖培育时，茎尖过小成活率太低，茎尖太大又脱除不掉病毒的缺陷。茎尖太大又脱除不掉病毒的缺陷。 1、热处置后取较大茎尖培育获得脱毒苗。、热处置后取较大茎尖培育获得脱毒苗。 2、取茎尖或茎段培育获得无菌苗。然后将试管、取茎尖或茎段培育获得无菌苗。然后将试管苗热处置，再取茎尖培育获得脱毒苗。苗热处置，再取茎尖

27、培育获得脱毒苗。 2茎尖微体嫁接 木本植物茎尖培育难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培育基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.4-1mm茎尖，在砧木上进展试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。3 3愈伤组织培育脱毒愈伤组织培育脱毒 愈伤组织细胞带病原菌愈伤组织细胞带病原菌不均一，部分细胞不带病毒，由不均一，部分细胞不带病毒，由这些细胞再生的植株是无病毒的。这些细胞再生的植株是无病毒的。多次继代的愈伤组织中病毒含量多次继代的愈伤组织中病毒含量下降，甚至检测不出病毒。下降，甚至检测不出病毒。 愈伤组织的某些细胞不带病毒缘由：愈伤组织的某些细胞不带病毒缘由： 1、病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；、病

28、毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度； 2、有些细胞经过突变获得了抗病毒的抗性。、有些细胞经过突变获得了抗病毒的抗性。 愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，能够会愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，能够会产生变异植株。产生变异植株。4珠心培育法脱毒珠心培育法脱毒l 柑橘类多胚种类中除了一个受精胚以外，尚有多个由珠心细胞构成的无性胚，称为珠心胚。珠心胚与维管束系统无联络，因此由珠心胚产生的植株全部均无病毒。但珠心胚 大多是不育的，必需分别培育才干发育成正常的幼苗。珠心胚培育技术对除去柑橘主要病毒，如引起银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、柑橘速衰病等的病毒，都非常有效。 5花药培育脱毒花药培育脱毒l 花药培育实践上是单倍体培育，由此获得单倍体植株，再经过染色体加倍获得无病毒植株。2.2 2.2 脱毒植物的鉴定脱毒植物的鉴定 利用生长点培育无毒苗的成苗