HPLC实验步骤和方法开发

1、碳水化合物类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇脂肪酸和有机酸蛋白、肽、氨基酸酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂抗氧化剂、防腐剂颜料和染料（色素维生素霉菌（黄曲霉毒素农药残留和兽药残留多环芳烃（PAHS和亚硝酸 在无机离子分析中应用在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析 Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 26:

2、1NS通用检测器通用检测器 RI ELSDMS灵敏度ugngpg线性范围104否103流速敏感是否是温度敏感是否否破坏性否是是选择性检测器选择性检测器 ABSFLEC Cond MS灵敏度ngpgfgpgpg线性范围105103106105103流速敏感否否是是是温度敏感否否是是是破坏性否否是否是大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的检测器检测器 -多数公司售出的检测器中多数公司售出的检测器中75%以上是吸以上是吸光度检测器（其中光度检测器（其中50%以上是紫外以上

3、是紫外/可见检可见检测器，测器，25%是是PDA）实际浓度浓度理想10吸光度吸光度210光电二极管矩阵检测器光电二极管矩阵检测器（ PDA ）的特点和用途）的特点和用途 一种一种三维水平的吸光度检测器三维水平的吸光度检测器-采集三维谱图采集三维谱图 兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息在收集色谱图的同时，得到光谱图在收集色谱图的同时，得到光谱图 提供许多有用的功能提供许多有用的功能 - -色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认 - -可以发现单波长检测时未测到的峰可以发现单波长检测时未测到的峰 - -任意波长的色谱再处理任意波长的色谱再

4、处理 - -光谱信息光谱信息- -光谱库的建立检索和拟合光谱库的建立检索和拟合 氨基甲酸酯类杀虫剂OOOOOOCH3黄曲霉毒素多环芳烃（PAH）OHCH3CH3CH3CH3CH3维生素OOONHCH3CH3CH3返回 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 加入“对离子”，使样品呈中性请记住请记住 每次改变一个参数 每次改变一个参数 色谱柱：C18，4.6mm15mm 流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度） 举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：1ml/min 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl P

5、araben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)60/4050/5040/60谱图62:38 / 42:58 / 72:28 / 2322OHCNCHOHMeOHOHTHFCHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH31234烷基长度不同，形成对离子的能力不同 抗组胺及减充血剂药物的分析抗组胺及减充血剂药物的分析NCONH2NH3CHOCH2OHCH2OHNNNNH3CH3COOCH2CHCHCHHOHOHOCH2OHNNH3CNH2CH2NSCH2CH2OHCH3 Cl-+1. Niacinamide 烟酰胺2. Pyridoxine 吡哆素， VB63. Riboflav

6、in 核黄素， VB24. Thiamine 硫胺素，VB1长度=内径，L=DL)(DL)(DLoad=进样量(Load)初始2初始现在2现在初始内径=D)(D)(DF=流速(F)2初始2现在初始溶剂 A溶剂 B泵 A泵 B混合器A 高压梯度溶剂 A泵溶剂 B比例阀（溶剂混合点）混合器B 低压梯度（溶剂混合点）死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意注意 滞后体积包括进样器、阻尼滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱色谱柱溶剂输送系

7、统(泵)低压梯度 阻尼器 混合器实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受梯度百分比保留时间梯度曲线好的梯度滞后曲线保留时间梯度百分比不好的梯度滞后曲线固定滞后体积，改善了梯度性能普通的低压梯度系统P680A LPG without pulse damperBack-pressure:60 bar, 85 bar and 105 barVariation: 2%Acclaim 120, C18, 5 m, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25C; 5 L injection volume; UV detection at 256

8、 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L eachn早流出峰的分离度差.n迟流出峰的峰宽增加而峰高降低.n由于k范围宽，所以分析时间长.n强保留组分造成柱污染.等梯度洗脱等梯度洗脱 - 在洗脱样品的整个过程中，流动相的组成保持不变.优点优点 改善分离度 提高检测性能 能够分离复杂样品 缩短分析时间 降低由于强保留组分而使色谱 柱性能变差的可能性其他应用其他应用 柱清洗 方

9、法开发中的尝试运行 梯度洗脱梯度洗脱 - 在分离过程中改变流动相组成.% Org02550751000102030Time (min)k增加有机改性剂的含量增加有机改性剂的含量分配转移到流动相分配转移到流动相增加化合物的流速增加化合物的流速5%有机相100%有机相从尝试运行开始 - 一个平缓的梯度您必须确定: 有机溶剂 初始组成 梯度时间 梯度陡度 梯度形状 流速 柱长 柱重新平衡时间010203040min.100% B100% B0% B0% BtG = 40tG = 20100% B100% B0% B0% BtG = 10tG = 5010陡陡平缓平缓%Btime线性步进凹形凸形线性梯

10、度线性梯度线性梯度选凹形梯度曲线选凹形梯度曲线用步进梯度或流速梯度用步进梯度或流速梯度选凸形梯度曲线选凸形梯度曲线10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复平衡时间6分钟平衡时间7分钟平衡时间8分钟平衡时间9分钟 平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。02468101214Time (min)5%/min1 ml/min- 5%/ml5%/min2.5 ml/min- 2%/ml011 01 0 001 02 03 04 05 0% O r gk0102030time (min)迁移距离10 cm开始25 cm保留时间 (min)柱长化合物 A化合物 B10 cm14.215.325 cm18.217.9 k 和有机改性剂百分含量之间的关系和有机改性剂百分含量之间的关系 - 等梯度条件等梯度条件(n.b. k 为对数坐标为对数坐标)梯度洗脱过程中的迁移梯度洗脱过程中的迁移Ghost Peaks0% MeOH100