实验六植物组织基因组DNA的提取与分析(SDS法)

1、1实验六实验六 植物组织中植物组织中DNA的提取与分析的提取与分析（SDS法）法） 温馨提示：实验中温馨提示：实验中-20冰浴时，请将样品放冰浴时，请将样品放入入6309室冰箱冷冻层。室冰箱冷冻层。2 （1）掌握植物组织中DNA提取的原理和方法。 （2）掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳检测方法一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理 高浓度的SDS在EDTA存在下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，PVP与多酚类物质结合形成复合物，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用氯仿等抽提，反复抽提后用异丙醇沉淀水相中的DNA。4三、仪器和试剂三、仪器和试剂1、仪器、仪器： 高速离心机、水平电

2、泳槽、电泳仪。高速离心机、水平电泳槽、电泳仪。2、试剂、试剂： 抽提缓冲液（抽提缓冲液（50mM Tris-HCl pH8.0、0.25M NaCl、20mM EDTA、0.5%SDS、2%PVP）、）、-巯基巯基乙醇、无水乙醇、氯仿乙醇、无水乙醇、氯仿:异戊醇（异戊醇（24:1）、异丙醇、）、异丙醇、70%乙醇、乙醇、TE缓冲液、上样缓冲液（缓冲液、上样缓冲液（0.5%溴酚蓝溴酚蓝+40%蔗糖）、蔗糖）、1TAE电泳缓冲液。电泳缓冲液。四、实验步骤四、实验步骤称取30mg植物幼苗放入研钵中加入300ul抽提缓冲液+75ul无水乙醇+20ul巯基乙醇，充分研磨匀浆液全部转入1.5ml离心管中用

3、200ul抽提缓冲液冲洗研钵，然后倒入离心管中加入600ul氯仿:异戊醇，上下颠倒轻轻充分混匀，-20放置10min12000r/min离心10min上层水相移入另一新离心管加600ul预冷的异丙醇，混匀后-20静止30min12000r/min离心10min弃上清，沉淀用600ul 70%乙醇漂洗弃上清，加20LTE溶解沉淀，即得DNA溶液12000r/min离心10min1、DNA的提取的提取6四、实验步骤四、实验步骤2、DNA电泳检测电泳检测（1）1%琼脂糖凝胶：称取琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖，加入琼脂糖，加入30mL 1TAE缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡缓冲液，在微波炉中

4、加热，反复加热、振荡2-3次，使琼次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至脂糖充分融化。待凝胶冷却至60左右，倒入插入梳子的左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。（2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。加样孔靠近阴极的一端。7四、实验步骤四、实验步骤2、DNA电泳检测电泳检测（3）上样电泳：将）上样电泳：将20LDNA样品溶液和样品溶液和5L上样缓冲液

5、混上样缓冲液混匀后，上样，匀后，上样，100V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。（4）照胶、拍照：将凝胶泡在）照胶、拍照：将凝胶泡在EB溶液（溶液（注意：注意：EB溶液为剧溶液为剧毒物，需带上一次性手套拿取凝胶毒物，需带上一次性手套拿取凝胶）中）中10min左右，进入暗左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。8五、实验结果与分析五、实验结果与分析 1 2 3 1 2 3 4 4图图1 植物组织基因组植物组织基因组DNA提取结果提取结果 将凝胶图片打印出将凝胶图片打印出来，需要说明：来，需要说明：1、小组点样孔号；、小组点样孔号；2、DNA质量分析。质量分析。六、注意事项六、注意事项（1）叶片磨得）叶片磨得越细越好越细越好。（2）移液器的使用。）移液器的使用。（3）由于植物细胞中含有大量的）由于植物细胞中含有大量的DNA酶酶，因此，因此，除在抽提液中加入除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一抑制酶的活性外，第一步（研磨）的操作应步（研磨）的操作应迅速迅速。101、在在DNA抽提过程中造成抽提过程中造成DNA分子断裂的主分子断裂的主要因素