生物技术制药

1、发酵工程1. 抗生素：是生物在其生命活动过程中产生的，在低微浓度下能选择性地抑制他种生物机能的化学物质。2. 青霉素G的分子结构式3. 前体：能被微生物直接利用，以构成次级代谢产物结构的一部分，而其本身结构没有大的变化的物质。4. 分叉中间体：菌体代谢过程中产生的既可用于合成初级代谢产物，又可用于和成次级代谢产物的中间产物。5. 差异毒力：药物对病原菌和宿主组织的毒力差异。6. 一个链霉素效价单位：规定能抑制1ml标准肉汤的大肠杆菌最小链霉素剂量为一个单位（）。7. 一个青霉素效价单位：规定能抑制50ml标准肉汤的金黄色葡萄球菌最小青霉素剂量为一个单位（）。 8. 抗菌谱：某种抗生素能抑制或杀

2、灭病原体的范围9. 次级代谢的特点是什么？（1） 与消耗碳源无准量关系，产量很低；（2）菌生长速度减低或停止后，产物较快合成，也有例外；（3）合成途径复杂，多不明确。10. 抗生素次级代谢的特点：次级代谢以初级代谢产物为前体，并受初级代谢的调节次级代谢产物一般在菌体生长后期合成次级代谢酶的专一性低次级代谢产物合成酶是初级代谢物诱导产生的次级代谢产物的合成不具有菌株特异性11. 简单介绍抗生素生物合成常用的几种研究方法。（1）喂养实验法（2）静息细胞法（3）阻断变株法（4）互补共合成法（5）同位素标记法(6）无细胞抽提液法（7）酶抑制剂法 12. 医用抗生素应具备的条件是什么？难使病原菌产生耐药

3、性较大的差异毒力副作用小具有较好的理化性能，便于提取、精制、贮藏在人体内应发挥其抗生效能，并不立即遭体内破坏给药后，很快吸收，并分布到被感染的器官或组织。13. 抗生素的作用机制干扰细菌细胞壁合成损伤细菌细胞膜 抑制细菌蛋白质合成抑制细菌核酸合成 增强吞噬细胞的功能。14. 发酵生产中水的作用是什么？构成生物体的成分培养基的组成部分参与代谢反应作为代谢反应介质作为物质传递介质良好的热导体15. 青霉素生产菌在液体培养条件下，根据其生长特征可分为哪几个时期？合成青霉素能力最强在哪几个时期？液体培养条件下其生长特征可分为六个时期：分生孢子发芽形成芽管，原生质未分化，具有小泡。菌丝增值，原生质体具有

4、嗜碱性，类脂肪小颗粒。形成脂肪粒、积累贮藏物，没有空泡，嗜碱性很强。脂肪粒减少形成中小空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。形成大的空胞，出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒。细胞内看不到颗粒，并出现个别自溶的细胞。16. 某生产菌株产青霉素的效价单位达8.2万单位/毫升，发酵液的密度大约为1克/毫升，换算成体积重量百分比（克/100毫升）大约是多少？(8.2X0.6X10-3X10)/100=0.492 g/100ml17. 抗生素剂量表示法有哪几种？举例说明。特定效价单位：如一个链霉素效价单位：规定能抑制1ml标准肉汤的大肠杆菌最小链霉素剂量为一个单位（）。折算重量

5、单位：如1mg青霉素G.Na1667 或10.6ug青霉素G.Na盐重量单位（以抗生素活性部分为一个单位）：如庆大霉素碱1mg1000类似重量单位（以特定纯粹盐为重量单位）：如盐酸金霉素1mg100018. 简述植物组织培养再生植株的途径？器官发生途径：成熟细胞愈伤组织出根出芽完整植株（指在组织培养的过程中，再生植株不是通过胚胎，而是通过分生中心直接分化器官，最终形成完整植株的过程）体细胞胚发生途径：成熟细胞分生细胞胚状体完整植株（指外植体按胚胎发生方式形成再生植株的过程）。19. 植物细胞培养的培养基由哪些主要成分组成？（1）MS培养基成分：大量元素：NH4NO3 、KNO3、CaCl22H

6、2O、MgSO47H2O、KH2PO4 微量元素：KI、H3BO3、MnSO44H2O、ZnSO47H2O、Na2MoO42H2O、CuSO45H2O、CoCl26H2O铁盐：FeSO47H2O、Na2-EDTA2H2O有机物质：肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇（维生素B6）、盐酸硫胺素（维生素B1）、甘氨酸（2）无机盐（大量元素、微量元素）、有机物（糖类、氨基酸、维生素、醇类、肌醇）、调节物质（生长素、细胞分裂素）20. 无血清培养基有何优点。可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染避免血清组分对实验研究的影响有利于体外培养细胞的分化可提高产品的

7、表达水平并使细胞产品易于纯化21. 简述动物细胞体外生长特点贴附：贴附并伸展是贴壁型细胞体外培养最基本特点细胞接触性抑制：由细胞接触而抑制细胞运动的现象密度抑制：细胞汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增值分裂，数量仍在增多，当细胞密度进一步增大后，培养液营养成分减少，代谢产物增多时，发生密度抑制，导致细胞分裂停止22. 举例说明动物细胞培养在生物制药中的应用。不仅可以通过直接培养动物细胞制备相关药用产品，而且还可以作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用物质。许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些分子量较大、结构较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选

8、的生产方式23. 写出青霉素G的分子结构式，并说明与其理化性质之间的关系及存在问题，以及半合成青霉素改进的机理是什么？（1）青霉素的理化性质：不溶于水，溶于醋酸丁酯其钠盐和钾盐溶于水水溶液在室温下易分解用粉针，注射前新鲜配制（2）存在问题：过敏反应不耐酸，不可口服只对G+菌有效，抗菌谱窄不耐酶，产生耐药性 (3)改进机理：耐酸原因：是由于青霉素V侧链上的苯氧基具有吸电子作用，使羰基氧原子上的孤电子对作为亲核试剂进攻-内酰胺环的能力减弱的结果耐酶原因：在6位侧链酰胺基上引入具有较大空间位阻的基团阻止药物与酶的活性中心作用，保护药物分子中的-内酰胺环广谱的半合成青霉素：在酰基-位上引入极性亲水性基

9、团-NH2、-COOH、-SO3H等侧链上的羧基、氨基是产生对革兰氏阴性菌活性的重要基团。24. -内酰胺酶抑制剂克拉维酸作用机理是什么？如何应用？（1）作用机理：从化学结构上来看克拉维酸是由-内酰胺和氢化异噁唑并合而成，在氢化异噁唑氧原子的旁边有一个sp2杂化的碳原子，形成乙烯基醚结构，C-6已无酰胺侧链存在， -内酰胺环周围的立体位阻比青霉素要小得多，因此，极易受到-内酰胺酶结构中亲核基团的进攻。克拉维酸遇亲核试剂进攻-内酰胺环时，可导致其-内酰胺环开环，形成亚胺结构，再经互变异构生成克拉维酸的异构体。正是这种高度不稳定性决定了克拉维酸是-内酰胺酶的不可逆抑制剂。它能对-内酰胺酶的活性部位

10、如羟基或氨基进行不可逆酰化。使-内酰胺酶彻底失活，因此可以说克拉维酸是一种自杀机制的酶抑制剂。 本品仅有微弱的抗菌活性，但可与多数-内酰胺酶牢固结合，生成不可逆的结合物，是有效的-内酰胺酶抑制剂，对无论是革兰阳性菌或革兰阴性菌产生的-内酰胺酶均有效。（）应用方法：常与青霉素类药物配伍使用，提高疗效。细胞工程植物细胞1. 植物组织再生的途径：体细胞再生愈伤组织再生2. 植物愈伤组织：脱分化后的植物细胞经过细胞分裂，产生无组织、无明显极性的松散细胞团（细胞排列疏松、无规则）3. 细胞工程制药：是细胞工程技术在制药工业方面的应用4. 细胞工程：是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的

11、理论与方法,按照人们的需要和设计,在细胞水平上的遗传操作,重组细胞结构和内含物,以改变生物的结构和功能，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术.5. 褐变（酶促、非酶促）：是指食品在加工过程中或长期贮存于湿热环境下，其所含的氨基化合物与还原糖相遇经过一系列反应生成褐色聚合物的现象（1） 酶促褐变：由过氧化物酶引起的褐变、由酚酶引起的褐变（2） 非酶促褐变：羰胺反应（美拉德反应）、焦糖化作用、抗坏血酸氧化褐变6. 外植体消毒所用试剂和浓度：75%乙醇、1%NaClO4、0.1%洁尔灭7. MS培养基：大量元素：NH4NO3 、KNO3、CaCl22H2O、MgSO47H2O、KH2PO

12、4 微量元素：KI、H3BO3、MnSO44H2O、ZnSO47H2O、Na2MoO42H2O、CuSO45H2O、CoCl26H2O铁盐：FeSO47H2O、Na2-EDTA2H2O有机物质：肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇（维生素B6）、盐酸硫胺素（维生素B1）、甘氨酸。8. 人工种子构成的三大因素：人工胚乳、人工种皮、胚。9. 毛状根培养（1） 毛状根是由发根农杆菌含有的Ri质粒引起的。Ri质粒有两个主要功能区：T-DNA区和Vir区。T-上有生长素合成基因和，指导的合成。（因此转化产生的毛状根，在培养时不需要添加外源生长素，为激素自养型）在通常状态下，质粒上区的基因处于抑制状态，当发根农杆菌感染

13、寄主植物时，受损伤的植物细胞合成的乙酰丁香酮使区处于抑制状态的基因被激活，产生一系列限制性核酸内切酶，在酶的切割作用下产生链，DNA进入植物细胞核内，整合进植物细胞的基因组。T-DNA在植物细胞中得到转录和翻译，刺激植物细胞形成毛状根（）毛状根培养生产次级代谢产物有何优点：由Ri质粒转化的毛状根生长快、激素自养型，在培养时不需要添加外源激素，易于培养毛状根分化程度高，产生次级代谢产物能力强。能大量合成某些悬浮培养的细胞不能或者很少合成的次级代谢产物。通过T-改造，易于采用基因工程途径提高次级代谢产物产量10. 体外细胞培养可以传50代PH：7.27.411. 生物制药：采用现代生物技术,借助某

14、些微生物、植物、动物生产医药品的系列工业化生产过程 动物细胞1. 动物细胞培养：是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。（1） 器材：培养基（氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅酶、激素、生长因子）包括天然、合成（DMEM、）、无血清培养基三种（2） 取材（3） 细胞消化液：胰蛋白酶溶液：水解细胞间的蛋白质，加血清终止反应0.25%EDTA消化液：解离细胞（两者常结合使用，增加效果）传代培养时从组织块消化分散得到单个细胞（4） 离心（）培养培养板用之前先浸酸（中和电荷、杀菌）洗消毒灭菌2. 举例说明动物细胞培养在生物技术制药中的作用杂交瘤技术产生单克隆抗体、病毒疫苗的生

15、产、重组蛋白生产3. 贴壁培养：大多数哺乳动物细胞必须附着在带适量正电荷的固体表面才能生长，属于贴壁依赖性细胞4. 接触抑制现象：是指由于细胞互相接触而抑制细胞运动性的现象。5. 细胞重组：指从活细胞中分离出细胞器及其组分，在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞及其组分重组，使其重新装配成具有生物活性的细胞或细胞器。6. 微载体:微载体是直径60-250um的适用于贴壁依赖型细胞生长的微珠，一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成7. 细胞工程：指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的的利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性学科8. 细胞

16、系：是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。9. 细胞株：指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。10. 原代培养：接种组织块直接长出单层细胞或将组织分散成单个细胞再进行培养，在首次传代前的培养称为原代培养。11. 传代培养：指将原代培养的细胞继续转接培养的过程（细胞的体外大量增殖以及细胞系的建立是通过传代培养实现的）12. 细胞融合有哪些方法：（） 物理法：离心、震动、电融合诱导法（） 化学法：用聚乙二醇（）诱导（） 灭活的病毒（生物法）：仙台病毒、疱疹病毒

17、等13. 动物细胞培养应用（1） 杂交瘤技术产生单克隆抗体（2） 重组蛋白的生产应用：哺乳动物细胞培养生产重组蛋白药物：中国仓鼠卵巢细胞、鼠源骨髓瘤、小鼠骨髓瘤细胞动物细胞培养生产重组人红细胞生长素（3） 红细胞生成素（）：是细胞因子的一种，在骨髓造血微环境下促进红细胞的生成，是对红细胞的生成有增强作用的体液性因子（4） 病毒疫苗的生产方法：动物接种鸡胚、鸭胚接种细胞培养法14. 促红细胞生成素（）：属于基因兴奋剂，可以增加人体内的红细胞数量，从而使肌肉获得更好的氧供，增强运动员的耐力。(长期食用可使人体血液粘稠，增加心脏负担，导致血液凝固、血栓等心血管疾病，甚至死亡）15. 组织工程的三大要

18、素：种子细胞、支架材料、细胞因子16. 骨组织修复的支架材料：天然生物聚合物（蛋白质支架、多糖支架）、无机类生物材料支架（磷酸钙基生物材料、硫酸钙基生物材料）17. 引起细胞凋亡的因素：（） 有毒物质或抑制因子产生氨：来自培养基和代谢，积聚影响细胞生长乳酸：来自细胞的糖代谢，抑制乳酸脱氢酶，抑制糖酵解，能量产生减少，抑制细胞生长甲基乙二醛：脂类、氨基酸的代谢产物，对细胞有潜在的损伤作用：毒性（） 营养成分耗尽：如谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因，而且凋亡一旦发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物在无血清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为脆弱，更易发生凋亡（） 其它物理因素：渗透压、

19、PH、温度、载体、搅拌等18. 包埋：是人工种子制作的重要一环（干燥法、水凝胶法）海藻酸盐包埋：包埋液（人工胚乳）制备：的海藻酸钠和营养物、生长因子等将成熟的健康的体细胞胚胎与包被液相混合，然后将其滴入适当浓度的氯化钙溶液中，经过胶复合作用的造型过程，在分钟内形成内含细胞胚、有一定硬度的雏形人工种子。基因工程1. 基因克隆过程：分：从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段切：用限制性核酸内切酶分别将外源（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开a) 酶切反应温度：b) 使用酶：限制性核酸内切酶连：在体外,将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自

20、我复制的并具有选择记号的载体分子上,形成重组DNA分子 a) 温度：b) 使用酶：连接酶转：将重组DNA分子转移到适当的寄主细胞，并与之一起增殖选：短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子，或使其整合到受体细胞的基因组中鉴：从这些筛选出来的受体细胞克隆中,提取出已经得到扩增的目的基因,供进一步分析研究使用。筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞将目的基因克隆到表达载体上,导入寄主细胞,使之在新的遗传背景下实现功能表达,产生出人类所需要的物质.2. 限制性核酸内切酶（37）（1） 定义：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶（

21、2） 寄主控制的限制与修饰现象：限制功能：外源的切割功能；修饰功能：自身的甲基化（3） 活性单位：反应体系中，含底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1ugDNA完全降解所需的酶蛋白即为一个酶单位，用U表示（4） 类限制性内切酶：从流感嗜血菌中分离出来识别位点序列：未甲基化修饰的双链上的特殊靶序列切割位点：在识别位点处切开双链。形成黏性末端或平末端条件：不能用水稀释，以免变性失活；预先加入除酶以外的其他试剂；取酶后立即放于冰上（5） 限制酶酶切反应的终止：大多数酶可用温育分钟3. 限制性内切酶：是微生物细胞中用于专门水解外源的一类酶，其功能是避免外源的干扰或噬菌体的感染，是细胞中

22、的一种防御机制4. 同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶（1） 完全同裂酶：识别位点和切点完全相同（2） 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同5. 同尾酶：两种限制性内切酶的识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端注：同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别6. 星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性7. 连接酶：能够催化中相邻的羟基和磷酸基末端之间形成，磷酸二酯键（14-16）（） 连接酶：平末端、粘性末端（） 大肠杆菌连接酶：粘性末端（） 连接条件必须是两条双链端有游离的，端有一个磷酸集团（）需要能量：动物或噬

23、菌体中：大肠杆菌中：8. DNA聚合酶：把dNTPs连续的加到引物的3-OH端的酶（1） DNA聚合酶在基因工程中的用途：主要用来制备带标记的探针大肠杆菌聚合酶：端补平；DNA3末端标记聚合酶：端补平；末端标记（2） DNA聚合酶的酶活性：5 3的聚合酶活性5 3的外切酶活性3 5的外切酶活性（较低）（3） 5 3的聚合酶活性DNA聚合酶发挥作用的条件：底物： 四种脱氧核苷5-三磷酸（dNTP）Mg离子带有3-OH游离基团的引物链DNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断裂）。（4） 3 5 核酸外切酶活性能催化DNA链发生水解作用，从DNA链3-OH末端开始向5的方向水解DNA，并

24、释放出单核苷酸分子。对酶活的影响： 反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶的3 5核，在具有dNTPs时，这种降解活性将会被5 3 的聚合酶活性所抑制（5） DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。DNA缺口转移9. Taq DNA聚合酶（1） 活性：聚合最适温度为，具 外切活性（2） 用途：反应用于大量扩增DNA片段。（3） 来源：从耐热细胞中纯化10. 回文序列：是一种旋转对称结构，在轴的两侧序列相同而反向11. 基因工程药物制药的主要程序：目的基因的克隆构建DNA重组体重组体转入宿主菌构建工程菌工程菌发酵表达产物的分

25、离纯化产品的检验12. 基因工程的载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些分子（能在宿主细胞中进行自我复制和表达）（） 表达载体具备的条件：复制起点（ori）多克隆位点（MCS）标记基因具有启动子（promoter）具有终止子（terminator）具有核糖体结合位点（RBS）翻译起始密码子和终止密码子（） 噬菌体：是病毒中的一种，一般把侵染细菌、放线菌的病毒叫噬菌体13. 质粒载体：染色体外的遗传因子，能进行自我复制；大多数为双链，闭环分子，少数为线性；大小，也有更大质粒DNA的复制类型：（拷贝数的多少） 严谨型：拷贝数有限，大约1-几个 松弛型：拷贝数转多，几十

26、至几百质粒的不相容性：是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象质粒的构建：加入合适的选择标记基因增加或减少合适的酶切位点，便于重组缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量改变复制子，变严紧为松弛根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件质粒载体必须具备的基本条件：具有复制起点、具有筛选标签（新陈代谢特性，抗菌素抗性、互补、插入失活）、具有若干限制酶切单一位点、具有较小的分子量和较高的拷贝数标记基因：抗性筛选、蓝白斑筛选、互补、插入失活（） 插入失活：当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后, 使这个基因丧失了原有的功

27、能叫插入失活1外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子2通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。（） 蓝白斑筛选（质粒）： 在LacZ的大肠杆菌中，在有IPTG诱导物和X-gal生色底

28、物的平板培养中，菌落是白色的。若在该细胞中引入pUC质粒，其上有LacZ，质粒和大肠杆菌DNA可实现互补， 表达出-半乳糖苷酶，可降解生色底物使菌落呈蓝色。如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因，则LacZ基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的-半乳糖苷酶，因此菌落呈白色（有外源基因插入）。-互补：lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补-半乳糖苷酶：酶学功能可由两个多肽片段重建。一个是N- 端()，另一个是-端()，这两个蛋白亚片段本身无功能，组合在一起时具有完整的-半乳糖苷酶活性，这种酶学功能重建叫 互

29、补。这个互补系统用来监测质粒上有无插入序列。自主复制性：它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制14. 大肠杆菌表达载体：（1） 原核强启动子： T7噬菌体启动子：具有高度特异性，只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别并启动转录 Plac：受Lac阻遏蛋白负调控，受乳糖或类似物IPTG（乳糖操纵诱导剂）的诱导（2） 表达的控制诱导表达 ： IPTG（乳糖操纵诱导剂）的化学诱导-Plac、Ptac利用噬菌体启动子的表达载体的诱导原理（3） 类型：融合型表达载体非融合型表达载体分泌型表达载体（4） 原核生物（大肠杆菌）表达真核基因的优缺点：优点：不存在基因的非特异性激活或抑制；可严格调控基因表达；真

30、核蛋白在表达时方便、高速、有效、易得缺点： 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化；融合蛋白易生成包涵体，复性后才有活性；很难表达大量的可溶性蛋白15. 目的基因制备方法：化学合成法基因组DNA文库.cDNA文库 （逆转录法）聚合酶链式反应（PCR）16. 分子杂交（碱基互补配对）：基因文库、CDNA文库17. （） 定义：是用一对寡聚作为引物，通过加温变性（） 退火（）延伸（）的多次循环，使目的基因得到特异性扩增（） 原理：DNA半保留复制的机理体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质（） 物料：4种dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+（） 过程：高温变性、低温退火（复性）及适温延伸 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右30s后，使模板DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至4060（55）左右30s，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合（退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度）引物的延伸：在Taq酶（在72左右）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，