现代分子生物学总结(朱玉贤、最新版)

1、一、绪论两个经典实验1、 肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验：先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀活性以后、以及活的粗糙型细菌（R型）分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力；当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死亡。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌。实验表明，死细菌DNA进行了可遗传的转化，从而导致小鼠死亡。2、 T2噬菌体感染大肠杆菌：当细菌培养基中分别带有35S或32P标记的氨基酸或核苷酸，子代噬菌体就相应含有35S标记的蛋白质或32P标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌，经过12个噬菌体DNA复制周期后进行检测，子代噬菌体中几乎不含带35S标

2、记的蛋白质，但含30%以上的32P标记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA而不是蛋白质。基因的概念：基因是产生一条多肽链或功能RNA分子所必需的全部核苷酸序列。二、染色体与DNA嘌呤 嘧啶腺嘌呤 鸟嘌呤 胞嘧啶 尿嘧啶 胸腺嘧啶染色体性质：1、分子结构相对稳定；2、能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性；3、能指导蛋白质的合成，从而控制生命过程；4、能产生可遗传的变异。组蛋白一般特性：1、进化上极端保守，特别是H3、H4；2、无组织特异性；3、肽链上氨基酸分布的不对称性；4、存在较普遍的修饰作用；5、富含赖氨酸的组蛋白H5非组蛋白：HMG蛋白；DNA结合蛋白；A24非组蛋白真核生物基

3、因组DNA真核细胞基因组最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能蛋白质所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值，在真核生物中C值一般是随着生物进化而增加的，高等生物的C值一般大于低等动物，但某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大，这就是著名的C值反常现象。真核细胞DNA序列可被分为3类：不重复序列、中度重复序列、高度重复序列。真核生物基因组的特点：1、真核生物基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组；2、真核基因组存在大量的的重复序列；3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90%以上，这是真核生物与细菌和病毒之间的最主要的区别；4、

4、真核基因组的转录产物为单顺反之；5、真核基因组是断裂基因，有内含子结构；6、真核基因组存在大量的顺式元件，包括启动子、增强子、沉默子等；7、真核基因组中存在大量的DNA多态性；8、真核基因组具有端粒结构。原核生物基因组的特点：1、结构简练，绝大部分用来编码蛋白质，只有很少一部分控制基因表达的序列不转录；2、存在转录单元，原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组的一个或者几个特定部位，形成功能单位或转录单元，可以被一起转录为含多个mRNA的分子；3、有重叠基因，所谓重叠基因就是同一段DNA携带两种或以上不同的蛋白质的编码信息。DNA的结构DNA又称脱氧核糖核酸，是deo

5、xyribonucleic acid的简称。L=T+W，L指环形DNA分子两条链间交叉的次数，只要不发生断裂，L是一个常量。T为双螺旋的盘绕数，W为超螺旋数。双螺旋DNA的松开导致负超螺旋，而拧紧则导致正超螺旋。双螺旋碱基间距（nm）螺旋直径（nm）每轮碱基数螺旋方向A-DNA0.262.611右B-DNA0.342.010右Z-DNA0.371.812左DNA的复制半保留复制：Semi -conservative replication；半不连续复制：Semi-discontinuous replication把生物体的复制单位称为复制子，一个复制子只含一个复制起始点。归纳起来，无论是原核生

6、物还是真核生物，复制起点是固定的，表现为固定的序列，并识别参与复制起始的特殊蛋白质。复制叉移动的方向和速度虽是多种多样的，但以双向等速方式为主。复制的几种主要方式双链DNA的复制大都以半包六复制方式进行的，通过“眼”型、型、滚环型或D-环型等以复制叉的形式进行。1、 线性DNA双链进行双向复制时，由于已知的DNA聚合酶和RNA聚合酶都只能从5到3移动，所以，复制叉呈眼型；2、 环状双链DNA复制可分为型、滚环型和D-环形几种类型、型，大肠杆菌染色体DNA是环状双链DNA，它的复制是典型的型复制，从一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制叉相遇时，复制就停止、滚环型，是单向复制的一种特殊

7、方式，在噬菌体中很常见。DNA的合成由对正链原点的专一切割开始，所形成的自由5端被从双链环中置换出来并为单链DNA结合蛋白所覆盖，使其3-OH端在DNA聚合酶的作用下不断延伸、D-环形，也是单向复制的一种特殊方式，双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，最初仅以一条母链作为新链合成的模板，迅速合成出互补链，另一条链则称为游离的单链环。原核生物和真核生物DNA复制的特点原核生物DNA复制特点DNA双螺旋的解旋拓扑异构酶（DNA topoisomerase）：消除解链造成的正超螺旋的堆积，消除阻碍解链继续进行的这种压力，使复制得以延伸。拓扑异构酶，催化DNA链的断裂和重新连接，每

8、次只作用于一条链，不需要辅助 因子如ATP等；拓扑异构酶能同时断裂和连接两条DNA链，通常需要辅助因子。DNA解链酶(DNA helicase)：解开双链DNA（DnaB蛋白：解螺旋酶；DnaA蛋白：辨认复制起始点；DnaC蛋白：辅助DnaB在起始点上结合并打开双链）单链结合蛋白（SSB）：保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构DNA复制的引发所有的DNA复制都是从一个固定起点开始的，而且目前所知的DNA聚合酶都只能延长DNA链而不能从头合成DNA链。DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物3末端开始合成新的DNA链。DNA聚合

9、酶功能DNA聚合酶DNA聚合酶（修复）DNA聚合酶聚合作用53有有有外切酶活性53有无无外切酶活性35有有有生物学活性10.0515聚合酶部分亚基的功能亚基功能聚合活性35核酸外切酶活性组建核心酶两个亚基形成滑动夹子，提高酶的持续合成能力真核生物DNA复制的特点真核生物DNA复制与原核生物DNA复制有很多不同，例如，真核生物每条染色体上可以有多个复制起点，而原核生物只有一个复制起点；真核生物DNA的复制只能在分裂期进行，原核细胞在整个细胞周期都能进行；真核生物的染色体在全部完成复制前，各个起点上DNA不能再开始，而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的DNA复制，表现虽然只有一个复制

10、单元，但却可有多个复制叉。真核生物DNA复制叉的移动速度不到大肠杆菌的1/20，因此，人类DNA中每隔30000300000个碱基就有一个复制起始点；真核生物DNA聚合酶有15种以上，大肠杆菌中存在的聚合酶有5种DNA复制的调控真核细胞中DNA复制有3个水平的调控：1、细胞生活水平调控，也称限制点调控，决定细胞停留在G1期还是进入S期；2、染色体水平调控；3、复制子水平调控，决定复制的起始与否。DNA的修复错配修复一旦复制通过复制起点，母链就会在开始DNA合成前的几秒至几分钟内被甲基化，此后只要两条DNA链上碱基配对出现错误，错配系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DN

11、A链，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的5位置切开子链，合成新的子链片段。切除修复切除修复是DNA损伤最为普遍的方式，主要分为碱基切除修复和核苷酸切除修复重组修复（复制后修复）先从同源DNA母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口，然后再用新合成的序列补上母链空缺，主要作用是重新启动停滞的复制叉。DNA直接修复DNA直接修复不需要切除碱基或核苷酸，最常见的例子是DNA光解酶把在光下或经外线光照射形成的环丁烷胸腺嘧啶二体及6-4光化物还原成单体的过程。SOS反应细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施，当DNA两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重

12、组修复，这时损伤处的DNA出现空缺，再随机加上核苷酸，容易造成突变。DNA的转座DNA的转座或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排的现象，频率很低。转座子（Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位，原核生物的转座子包含4类：1、插入序列（IS）；2、类转座子因子；3、复合转座子，两端由IS或类IS构成，带有某些抗药性基因或其他宿主基因，一旦形成复合式转座子，IS序列就不能再单独移动；4、TnA转座子家族，两端为IR，可编码转座酶，解离酶和抗性物质。真核生物中的转座子主要包括转座子和反转座子。玉米细胞内存在自主型和非自主型两类转座子，非自主型转座子单独存在时是稳定的，不能转座，

13、当基因组同时含有属于同一家族的自主型转座子时，它才具备转座功能。转座子可分为复制型和非复制型，转座酶和解离酶分别作用于原始转座子和复制转座子。转座作用的遗传学效应1、引起插入突变；2、产生新的基因；3、产生染色体畸变（DNA重复、缺失或倒位）；4、引起生物进化组蛋白的种类、修饰类型及其生物学意义根据电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4，这些组蛋白都含有大量赖氨酸和精氨酸。组蛋白的修饰作用包括甲基化，乙酰化，磷酸化以及ADP核糖基化等。一般来说，组蛋白乙酰化能选择地使某些染色质区域的结构从紧密变的松弛，开放某些基因的转录，增强其表达水平；而组蛋白甲基化即可抑制也可增强基因表达

14、，乙酰化修饰和甲基化修饰往往是相互排斥的。简述DNA聚合酶和Klenow的结构和功能占DNA聚合酶蛋白2/3的C端区域，相对分子质量68000，具有DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性，即可合成也可降解DNA，保证DNA复制的准确性；占DNA聚合酶蛋白1/3的N端区域，相对分子质量35000，具有53核酸外切酶活性，可做用于双链DNA，又可水解5端或距5端几个核苷酸处的磷酸二酯键。DNA聚合酶在DNA直接修复、除去冈崎片段5端RNA引物方面具有重要作用。Klenow大片段是用蛋白酶水解DNA聚合酶所得的大片段区域，具有53聚合酶活性和35核酸外切酶活性，在基因工程中有广泛应用，主要有：修复反应

15、、制备平末端；标记DNA3突出末端；双脱氧末端终止法进行DNA序列分析等。三、生物信息的传递（上）RNA转录的基本过程模板识别真核细胞中的模板识别与原核细胞不同，真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区，需要转录因子的辅助蛋白质按特定的顺序结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之相合并形成复杂的前起始复合物（PIC），以保证有效的起始转录。转录起始转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生，该过程不需要引物，RNA聚合酶通过启动子的时间代表一个启动子的强弱，时间越短，该基因的转录起始频率越高。转录延伸RNA聚合酶释放因子离开启动子后，核心酶沿模板DNA链移动并使新生的RNA链不断延长的过程。

16、一旦聚合酶启动了基因转录，它就会一直移动合成RNA，直到遇到终止信号时才释放新生的RNA链。转录终止RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合体分开，转录泡瓦解。转录机器的主要成分RNA聚合酶RNA聚合酶以DNA双链为模板（若以单链为模板，活性大大降低），以4种核苷三磷酸为底物，并以Mg2+/Mn2+为辅因子，催化RNA链的起始、延伸和终止，不需要任何引物。原核生物RNA聚合酶大肠杆菌RNA聚合酶由两个亚基、一个亚基、一个亚基、和一个亚基组成核心酶，加上一个亚基后则成为聚合酶全酶，转录的起始过程需要全酶，由因子辨认起始点，延长过程仅需要核心酶催化。和亚基组成了聚合酶的催化中心，亚基

17、能与模板DNA、新生RNA链以及核苷酸底物相结合；亚基的作用是负责模板链的选择和转录的起始，它是酶的别构效应物，使酶专一性识别模板上的启动子。真核生物RNA聚合酶酶定位转录产物与功能对-鹅膏覃减RNA聚合酶核仁45SrRNA（5SrRNA）不敏感RNA聚合酶核质hnRNA（mRNA）敏感RNA聚合酶核质tRNA、5SrRNA、snRNA存在物种特异性转录复合物模板的识别阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物，此时DNA仍处于双链状态。然后封闭复合物转变成开放复合物，聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一段双链被解开。真核生物转录起始至少还需要7中辅助因子参与

18、，这些蛋白辅助因子统称为转录因子（TF）启动子与转录起始启动子区的基本结构启动子是一段位于结构基因5端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确结合并具有转录起始的特异性。1、 转录单元是一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。转录起始位点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为嘌呤。把起点5末端的序列称为上游，把3端称为下游，起点为+1，下游方向依次为+2、+3上游方向依次为1、22、 Pribnow区（TATA box）是一个由5个核苷酸（TATAA）组成的保守序列，其中央大约位于起点上游10bp处又称10区3、 35序列（Sexfama box）在

19、转录开始位点上游35区域也有一段保守序列，共同序列是TTGACA，称为35区大部分原核生物启动子都存在位于-10bp的TATA盒和位于-35bp的TTGACA盒，这两个区域是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与因子相互识别而具有很高的亲和力。4、 Hogness区，在真核基因中发现，位于转录起始-25-35bp处的TATAAA，也称TATA区5、 CAAT区，在-70-80bp处的共同序列CCAAT，称为CAAT区，是与原核生物中-35区相对应的序列启动子区的识别RNA聚合酶不能识别碱基本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。RNA聚合酶与启动子区的结合聚合酶首先与启动子区闭合双链DNA结合，形

20、成二元闭合复合物，然后经过解链得到二元开链复合物，因此，RNA聚合酶既是双链DNA结合蛋白，又是单链DNA结合蛋白。-10区与-35区的最佳距离在原核生物中，-35区与-10区之间的距离大约是1619bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。在细菌中常见两种启动子突变，一种叫下降突变，一种叫上升突变（增加其共同序列的同一性）。增强子及其功能增强子是DNA上能提高转录起始效率的序列，可位于5或3末端，可能是通过影响染色质DNA-蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结构，从而使得RNA聚合酶更容易与模板DNA结合，起始基因转录，增强子具有下列特点：1、 远距离效应；2、无方向性

21、；3、顺式调节，只调节位于同一染色体上的靶基因，对其他染色体上的基因没有作用；4、无物种和基因特异性；5、具有组织特异性；6、有相位性，其作用和DNA的构象有关；7、有的增强子可对外部信号产生反应；（8、大多为重复序列，其内部常有一个核心序列（G）TGGA/TA/TA/T（G），该序列是产生增强效应所必需的）真核生物启动子对转录的影响真核基因启动子在-25-35区含有TATA序列，在-70-80区含有CCAAT序列，在-80-110区含有GCCACACCC或GGGCGGG序列，习惯上将TATA区上游的保守序列称为启动子元件（UPE）或上游激活序列（UAS）。TATA区的主要作用是使转录精确起始

22、，CAAT和GC区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。尽管3种UPE序列都有重要功能，但并不是每个基因的启动子区都包含这3种序列。转录的抑制抑制剂靶酶抑制作用类别放射线素-D真核生物RNA聚合酶与DNA结合，阻止延伸DNA模板功能抑制物利福霉素细菌全酶与亚基结合，抑制起始RNA聚合酶抑制物利迪链霉素细菌核心酶与亚基结合，抑制起始-鹅膏覃碱真核生物RNA聚合酶与RNA聚合酶结合原核与真核生物mRNA的特征比较原核生物mRNA的特征1、原核生物mRNA半衰期短，细菌基因的转录与翻译是紧密相连的；2、许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在，多顺反子mRNA是一组相邻或相互重叠基因的转录

23、产物，这样的一组基因可被称为一个操纵子；3、原核生物mRNA5端没有帽子结构，3端也没有多聚A尾巴或者很短，原核生物起始密码子AUG上游712个核苷酸处与一个被称为SD序列的保守区，该序列与16SrRNA3端反向互补，被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。真核生物mRNA特征1、真核生物mRNA5端有帽子结构（不包括叶绿体和线粒体mRNA），mRNA5端加“G”反应是由腺苷酸转移酶完成的，新加上的G与mRNA链上所有其他核苷酸方向相反，像一顶帽子扣在mRNA上，故而得名。mRNA的帽子结构常被甲基化，第一个甲基化出现在所有真核细胞的mRNA中，称为零类帽子，帽子结构可能使mRNA免遭核酸

24、酶的破坏，其甲基化是翻译所必需的；2、绝大多数真核生物3-端有PolyA结构，除组蛋白基因外，真核生物mRNA3端都有这个结构，PolyA是在转录后加上去的（需要AAUAAA特定序列），在细胞核中的hnRNA阶段就已经加上去。它是mRNA有细胞核进入细胞质所必须的形式，大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性；3、凡是编码功能蛋白的真核基因都通过RNA聚合酶进行转录，真核基因几乎都是单顺反子mRNA，只包含一个蛋白质信息。终止和抗终止依赖因子的终止（穷追模型）因子能使RNA聚合酶在DNA模板上准确地终止转录，它能水解各种核苷酸，是六聚体蛋白，通过催化NTP水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离

25、出来不依赖因子的终止模板上存在终止转录信号，即内在终止子，这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构，会导致RNA聚合酶暂停。内在终止子有两个明显的特点，1、终止位点上游一般存在一个富含GC的二重对称区；2、在终止位点前有一段由48给个A组成的序列，因此转录产物的3端为寡聚U，寡聚U的存在使杂合链的3端部分出现不稳定的rU·dA区域，决定了转录的终止。抗终止破坏终止位点RNA的茎-环结构；依赖于蛋白因子的转录抗终止内含子的剪接、编辑、再编码及化学修饰RNA中的内含子由DNA转录生成的原始转录产物核不均一RNA（hnRNA）即mRNA的前体，经过加5端帽子和3端尾巴，再经过RNA的剪

26、接，编码蛋白质外显子部分就连接称为一个可译框架（ORF），通过核孔进入细胞质。mRNA前体中内含子的两端边界存在共同的序列，这些序列结构可能是产生mRNA前体剪接的信号。多数细胞核mRNA前体中内含子的5边界序列为GU，3边界序列为AG，因此GU表示供体衔接点的5端，AG代表接纳体3端，这种保守序列模式称为GU-AG法则，又称Chambon法则。mRNA的剪接类内含子剪接的主要特点类内含子剪接转要是转酯反应，剪接反应实际上是发生了两次磷酸二酯键的转移。第一个转酯反应由一个游离的鸟苷或鸟苷酸介导，其3-OH作为亲核基团攻击5端的磷酸二酯键，从上游切开RNA链；在第二个转酯反应中，上游外显子的自由

27、3-OH作为亲核基团攻击内含子3位核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子完全被切开，上下游两个外显子通过新的磷酸二酯键重新连接类内含子剪接的主要特点类内含子切除体系中，转酯反应无需游离鸟苷或鸟苷酸，而是由内含子本身的靠近3端的腺苷酸2-OH作为亲核基团攻击内含子5端的磷酸二酯键，从上游切开RNA后形成套索状结构，再由上游外显子的自由3-OH作为亲核基团攻击内含子3端的磷酸二酯键，使内含子完全被切开，上下游两个外显子通过新的磷酸二酯键重新连接RNA的编辑、再编码及化学修饰RNA的编辑RNA的编辑是某些RNA，特别是mRNA的一种加工方式，编辑的结果导致DNA所编码的遗传信息改变，RNA的编辑虽然不是很普

28、遍，在真核生物中也时有发生，介导RNA编辑的机制有两种：1、位点特异性脱氨基作用，载脂蛋白mRNA中UA，谷氨酸受体蛋白中AI，都属于脱氨基作用的结果，分别由胞嘧啶和腺嘌呤脱氨酶所催化；2、尿嘧啶插入或删除，由于指导RNA上存在一些未能配对的腺嘌呤，形成缺口，为插入尿嘧啶提供了模板，反应完成后。指导RNA从mRNA上解离下来。RNA编辑具有重要的生物学意义：1、校正作用，有些基因在突变过程中丢失的遗传信息可能通过RNA编辑得到修复；2、调控翻译，通过编辑可以构建或去除起始密码子和终止密码子，是基因表达调控的一种方式；3、扩充遗传信息，能使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物进化RNA再编码m

29、RNA在某些情况下不是以固定的方式被翻译，而可以改变原来的编码信息，以不同的方式进行翻译RNA化学修饰甲基化、去氨基化、硫代，碱基的同分异构化、二价键的饱和化、核苷酸的替代核酶核酶是指一类具有催化功能的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达，可分为两类：1、剪切型核酶，只剪不接；2、剪接型核酶，如类和类内含子其他SnRNA具有保守性RNA聚合酶识别的启动子比较特殊，启动子不位于编码基因的上游，而在编码基因的转录区内外显子的序列多保守，内含子序列变化较大多顺反子优点：调控方便、基因结构简练；缺点：前面的顺反子对后面的顺反子表达有影响；

30、后面几个顺反子翻译的起始会受其上游顺反子结构的调控，不能独立进行在mRNA前体剪接的过程中，参加剪接的外显子可以不按其线性次序剪接，内含子也可以不被切除而保留，即一个外显子或内含子是否出现在成熟mRNA中是可以选择的，这种剪接方式称为选择性剪接，使一个基因可以产生不同类型的mRNA分子。选择性剪接的方式有四种：1、拼接产物缺失一个或几个外显子；2、拼接产物保留一个或几个内含子作为外显子的编码序列；3、外显子中存在5或3拼接点，从而部分缺失该外显子；4、内含子中存在5拼接点或3拼接点，从而使部分内含子变为编码序列转录单位不同于基因，转录单位可能同时包含一个或多个基因，另外，转录单位还包含启动子、

31、非编码序列等，其范围比基因广RNA的种类和生物学功能转运RNAtRNA氨基酸转运核糖体RNArRNA核蛋白组成成分信使RNAmRNA蛋白质合成模板核不均一RNAhnRNA成熟mRNA前体小核RNAsnRNA参与hnRNA剪接小胞浆RNAscRNA/7SL-RNA蛋白质内质网定位合成信号识别体的组成成分反义RNAAnRNA/micRNA对基因表达起调节作用核酶Ribozyme RNA有酶活性的RNAmRNA直接负责蛋白质的生产，翻译完成后即可降解；rRNA参与核糖体组装，是一个相对稳定的结构；tRNA携带氨基酸到核糖体，完成一次携带后继续下一轮氨基酸转运工作，所以mRNA不如其他两者稳定多聚A尾

32、的生成是在多聚A聚合酶的催化下，由ATP聚合而成，需要镁离子或锰离子及蛋白质参与作用封闭复合物：RNA聚合酶全酶与DNA组成的复合物，DNA仍处于双链状态，不能起始RNA的合成；开放复合物：RNA聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一小段双链被解开，形成转录泡，酶的构象也发生改变，这种由启动子与RNA聚合酶的复合物在这里能进行RNA的起始合成；三元复合物：由开放复合物与最初的两个NTP结合并在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后所形成的包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的复合物原始转录产物RNA转录后的加工有三种形式：1、减少部分片段，如切除5端前导序列，3端拖尾序列和中部的内含子；2、增加部分片段：

33、5端加帽。3端加PolyA，通过归巢和编辑加入一些碱基；3、修饰，对某些碱基进行甲基化等核酶结构特点：1、三个茎区形成局部的双链结构，其中含一个由1113个保守的核苷酸构成的催化中心；2、具有催化中心的核酶和含有剪切位点的底物部分共同构成锤头结构，底物部分是切割区部位两端的核苷酸，与核酶茎和茎结合核酶的生物学意义：1、RNA为生物催化剂，具有重要的生物学意义；2、打破了酶是蛋白质的传统观念；3、在生命起源上，为先有核酸提供了依据；4、为治疗有害基因、肿瘤等提供了手段生物信息的传递（下）遗传密码三联子性质：1、遗传密码的连续性，即密码子间没有空格，阅读mRNA时是以密码子为单位，连续阅读，一次阅

34、读三个核苷酸，不能跳过任何mRNA中的核苷酸；2、遗传密码的简并性，除AUG（Met）和UGG（Try）外，每个氨基酸都有一个以上的密码子，同一氨基酸的不同密码子称为同义密码子；3、遗传密码的通用性与特殊性，所有生物都有相同的遗传语言，遗传密码子是通用的，但也有少数例外。如支原体中终止密码子被用来编码色氨酸；4、密码子与反密码子的相互作用，在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定自由度，可以摆动，当反密码子第一位是A或C时只能识别一种密码子，为G（C/U）或U(A/G)时，能识别2种密码子，为I(A/U/C)时，能识别三种密码子;5、密码子有起始密码子和终止密码

35、子，起始密码子AUG（Met）和GUG（缬氨酸），终止密码子又称无义密码子，UAA（赭石密码）、UAG（琥珀密码）、UGA（蛋白石密码），它们没有相应的tRNA存在，只供释放因子识别来实现翻译终止。eg.(反密码子GCU可以识别的密码子是AGU或AGC)tRNA共性：存在经过特殊修饰的碱基，tRNA的3端都以CCA-OH结束，该位点是tRNA与相应氨基酸结合的位点，稀有碱基丰富。二级结构：1、受体臂，主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3端未配对的34个碱基组成，其3端的最后3个碱基序列永远是CCA，最后一个碱基的3或2自由羟基（连接氨基酸的部位）可以被氨酰化；（其余手臂均由碱基配对产生的

36、杆状结构和无法配对的套索状结构所组成）2、TC臂是根据3个核苷酸命名的，其中表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有不常见核苷酸；3、反密码子臂是根据位于套索中央的三联反密码子命名的；4、D臂是根据它含有二氢鸟嘧啶命名的。三级结构：呈L形折叠，靠氢键维持，TC和受体臂是倒L的一横，反密码子臂和D臂是倒L的一竖，其中受体臂顶端的碱基位于L的一个端点，反密码子臂的套索状结构生成了L的另一个端点。因为tRNA上所运载的氨基酸必须靠近位于大亚基上的多肽合成位点，而反密码子必须与小亚基上的mRNA相配对，所以分子中两个不同的功能基团是最大程度分离的。功能：运输的工具，运载氨基酸，mRNA只能特异识别tRNA而

37、不是氨基酸；解读mRNA的遗传信息种类：1、起始tRNA和延伸tRNA，能特异地识别mRNA上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他的统称为延伸tRNA。原核生物的起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸，真核生物的起始tRNA携带甲硫氨酸；2、同工tRNA，代表同一种氨基酸的tRNA为同工tRNA；3、校正tRNA，校正tRNA分为无义突变及错义突变校正。无义突变：一个核苷酸的改变使某个氨基酸的密码子变成终止密码子，使蛋白质合成提前终止；错义突变：某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。酰胺-tRNA合成酶催化氨基酸与tRNA结合，既能识别tRNA，又能识别氨基酸。副密码子决定tRN

38、A上所携带的氨基酸种类。核糖体核糖体结构核糖体蛋白：核糖体上有不止一个的活性中心，每个活性中心都有一组特殊的核糖体蛋白质构成。蛋白质本身具有催化功能，但若将它们从核糖体上分离出来，催化功能就会完全消失。核糖体RNA：1、5SrRNA，有两个保守序列，CGAAC是其与tRNA相互识别的序列；GCGCCGAAUGGUAGU与23SrRNA的一段序列互补，是5SrRNA与50S核糖体大亚基相互作用的位点；2、16SrRNA，有两个保守序列，ACCUCCUUA是与mRNA的5端SD序列互补的序列；在靠近3端处有一段识别23SrRNA的序列，在30S与50S亚基的结合中起作用；3、23SrRNA，大亚基

39、23SrRNA可能与tRNAMet的结合有关；4、5.8SrRNA，是真核生物特有的rRNA，可能与原核生物的5SrRNA有相似的功能；5、18SrRNA及28SrRNA核糖体功能：1、合成蛋白质的场所，选择对信息专一的AA-tRNA，容纳另一种携带肽链的RNA，即肽酰tRNA；2、核糖体至少包括5个活性中心，即mRNA结合部位、结合或接受AA-tRNA部位（A位）、结合或接受肽酰tRNA的部位（P位）、肽酰基移部位、形成肽键的部位（转肽酶中心）。此外，还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。核糖体小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别，如起始部分的识别、密码子与反密码子的作用等，mRN

40、A的结合位点也位于小亚基上；核糖体大亚基负责携带氨基酸及tRNA的功能，肽键的形成、AA-tRNA、肽酰-tRNA的结合等，A、P位点、转肽酶中心也主要位于大亚基上。蛋白质的生物合成机制氨基酸的活化氨基酸必须在氨酰-tRNA合成酶(AARS)的作用下生成活化氨基酸AA-tRNA，活化的场所是细胞质，其中AARS具有三个位点，分别是tRNA识别位点、氨基酸识别位点、校正位点。翻译的起始作为多肽合成起始信号的密码子有两个，即甲硫氨酸的密码子和缬氨酸的密码子，在大肠杆菌中，起始密码子AUG编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身，而是甲酰甲硫氨酸，起始tRNA为fMet-tRNAfMet。真核生物无甲酰化，起

41、始氨基酸是Met，起始tRNA是Met-tRNAMet。第一步，30S小亚基与翻译起始因子IF-1和IF-3结合，通过SD序列与mRNA模板结合；第二步，在IF-2起始因子和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子配对；3、带有tRNA、mRNA和三个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。肽链的延伸（三个延伸因子）1、 后续AA-tRNA与核糖体结合：起始复合物形成以后，第二个氨酰-tRNA首先与EF-Tu·GTP形成复合物，进入核糖体A位，水解产生GDP并在EF-Ts的作用下释放GDP

42、并使EF-Tu结合另一分子GTP，进入新一轮的循环；2、 肽键的生成：在mRNA、氨酰tRNA、核糖体复合物中，氨酰tRNA占据A位，fMet-tRNAfMet占据P位，在肽基转移酶的催化下，A位上的氨酰tRNA转移到P位，与fMet-tRNAfMet上的氨基酸生成肽键，起始tRNA离开核糖体P位；3、 移位：核糖体通过EF-G（起移位酶作用）介导的GTP水解所提供的能量向mRNA模板3端移动一个密码子，使二肽基-tRNA完全进入P位，准备开始新一轮的肽链延伸。肽链的终止肽链延伸过程中，当终止子密码子出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与其结合，而释放因子（RF）能识别这些密码子并

43、与之结合，水解P位上多肽链与tRNA之间的二酯键，然后新生的肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体大小亚基解体，蛋白质合成结束。释放因子有两类，类释放因子识别终止密码子，并能催化新合成的多肽链从P位点的tRNA中水解释放出来；类释放因子能在多肽链释放后刺激类释放因子从核糖体中解离出来。细菌内存在三种不同的释放因子（RF1、RF2、RF3），真核生物有两种（eRF1、eRF3）。蛋白质前体加工新生的多肽链大多数是没有功能的，必须经过加工修饰才能转变成为有活性的蛋白质，蛋白质前体的加工主要包括：N端fMet或Met的切除；二硫键的形成；特定氨基酸的修饰；新生肽中非功能片段的切除等。真核生物蛋白质翻译

44、后的加工1、信号肽的切除：蛋白质除游离于胞浆内发挥作用外，还有一部分要分泌到细胞外和定位于膜系统中起作用。被运输的多肽含有信号肽，需要被切除；2、二硫键的形成：在mRNA分子中，没有胱氨酸的密码子，而不少蛋白质分子中含有胱氨酸的二硫键，它是通过两个半胱氨酸的巯基氧化而成的，有的在切除肽段前就已形成；3、蛋白质的折叠：肽链折叠在肽链合成结束之前就已经开始，核糖体可以保护3040个氨基酸长的肽链，当肽链从核糖体中暴露出来后便开始折叠，三级结构的形成几乎和肽链合成的终止同时完成，蛋白质的折叠是从N端开始的；4、糖基化作用使多肽变成糖蛋白，糖基化作用分为两类，一是N-糖基化，二是O-糖基化；5、非末端

45、氨基酸的修饰：丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，赖氨酸、谷氨酸等的甲基化，谷氨酸和天冬氨酸的羧基化；6、末端修饰：N端Met的切除；7、前体修饰：有些蛋白质生物合成是以前体蛋白质或多蛋白质形式出现的，经过蛋白酶的切割，称为较小的活性分子蛋白质合成抑制剂主要是一些抗生素，如嘌呤霉素、链霉素、四环素、氯霉素、红霉素等。抗生素对蛋白质合成的抑制作用可能是阻止mRNA与核糖体结合（氯霉素），或阻止AA-tRNA与核糖体结合（四环素），或干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生误读，或作为竞争性抑制剂抑制蛋白质合成。青霉素、四环素、和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，而氯霉素、嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合又能与真

46、核细胞核糖体结合，妨碍细胞内蛋白质的合成，因此前三种抗生素广泛被应用于人类医学蛋白质转运机制信号肽的特点：1、一般有1015个疏水氨基酸；2、常常在靠近该序列N-端疏水氨基酸区上游带有1个或数个带正电荷的氨基酸；3、在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链信号肽作用：1、完整的信号肽是保证蛋白质转运的必要条件；2、仅有信号肽不足以保证蛋白质转运发生；3、信号序列的切除并非转运所必需的；4、并非所有的转运蛋白都有可降解的信号肽线粒体蛋白质跨膜转运特征：1、通过线粒体膜的蛋白质在转运之前大多以前体形式存在；2、蛋白质通过线粒体内膜的转运是

47、一种需要能量的过程；3、蛋白质转运时，首先由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与Hsp或MSF等分子伴侣相结合的待转运多肽，通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。所需能量来自线粒体Hsp70引发的ATP水解和膜电位差。前导肽的性质：带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量比较丰富，分散于不带电荷的氨基酸之间；缺少带负电荷的酸性氨基酸；羟基氨基酸（特别是丝氨酸）含量较高；有形成两亲螺旋结构的能力叶绿体蛋白质跨膜转运叶绿体多肽在胞质中的游离核糖体上合成后脱离核糖体并折叠成具有三级结构的蛋白质分子，多肽上某些特定位点结合于只有叶绿体膜上才有的特异受体位点。叶绿体定位信号肽有两部分，一是决定蛋白质

48、是否进入叶绿体基质，二是决定蛋白质是否进入类囊体。蛋白质前体与叶绿体膜上特异性受体结合，进入叶绿体基质，第一部分跨膜信号被切除；在第二部分信号肽的引导下，跨过类囊体膜，第二部分信号肽也被切除，从而成为成熟的叶绿体蛋白质。核定位蛋白的转运机制NLS：核定位序列大肠杆菌蛋白质降解通过依赖于ATP的蛋白酶（Lon），Lon蛋白酶每切除一个肽键消耗2分子ATP；真核生物蛋白质的降解依赖于泛蛋白蛋白质多亚基形式的优点：亚基对DNA的利用来说是一种经济的方法；可以减少蛋白质合成过程中随机的错误对蛋白质活性的影响；活性能够非常有效和迅速地被打开和关闭。蛋白质由二十种氨基酸合成，其中不包括胱氨酸，很多蛋白质中

49、都含有二硫键，这是蛋白质合成后，通过两个半胱氨酸的氧化作用生成的。（胱氨酸是由两个半胱氨酸通过其侧链巯基氧化成二硫键后形成的产物）为什么真核生物中转录与翻译无法偶联？真核生物mRNA是在细胞核内合成的，而翻译是在细胞质中进行的，因此mRNA只有被转运到细胞质部分，才能翻译合成蛋白质。真核生物mRNA在开始时是不成熟的hnRNA，需要通过一系列加工才能成为成熟的mRNA，这些过程包括内含子剪接、5端加帽子结构、3端加多聚尾巴等，因此转录与翻译无法偶联。蛋白质合成中如何保证其翻译的正确性1、 氨基酸与tRNA的专一结合，保证了tRNA携带正确的氨基酸；2、校正作用：氨酰-tRNA合成酶和tRNA的

50、校正作用；对占据核糖体A位的氨酰-tRNA的校对；变异校对即基因内校对与基因间校对等多种校正作用可保证翻译的正确；3、携带氨基酸的tRNA对mRNA的识别，mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子的相互识别；4、起始因子及延长因子的作用，起始因子保证了只有起始氨酰-tRNA能进入核糖体P位与起始密码子结合，延长因子的高度专一性，保证了起始tRNA携带的fMet不进入肽链内部；5、核糖体三位点模型的E位与A位的影响，可以防止不正确的氨酰-tRNA进入A位，从而提高翻译的正确性原核生物与真核生物蛋白质翻译过程的差异1、核糖体不同：原核为70S型，真核为80S型；2、模版不同：原核生物的多为多顺反子

51、，而真核生物多为单顺反子；3、起始氨酰-tRNA不同，原核的是fMet-tRNAMe，真核生物是Met-tRNAMet；4、原核生物mRNA上有能与16SrRNA配对的SD序列，真核生物没有；5、原核生物起始复合物形成的过程中，30S小亚基先与翻译起始因子IF-1、IF-3结合，通过SD序列与mRNA模板结合。而在真核生物翻译起始过程中，GTP首先与eIF2结合，增加了eIF2与起始tRNA的亲和力，然后三者结合成一个三元复合物。三元复合物直接与40S亚基结合，40S亚基-三元复合物在eIF3的存在下与mRNA结合，由ATP提供能量；6、延伸因子不一样：原核生物有三个延伸因子，EF-Tu、EF

52、-Ts、EF-G，真核生物是EF-1和EF-2；7、终止因子不同：细菌有三种分别是RF1、RF2、RF3，真核生物只有一个eRF。核定位序列的功能【见细胞总结】分子生物学研究法重组DNA 实验中常用的工具酶限制性内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶按5到3方向加入核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH末端末端转移酶在双链核酸的3末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶从DNA链的3末端逐个切除单核苷酸噬菌体DNA外切酶从DNA

53、链的5末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸脂酶切除位于DNA链5或3末端的磷酸基团类限制性内切酶只由一条肽链构成，仅需Mg2+,切割DNA特异性最强，且就在识别位点切断DNA，是分子生物学中应用最广的限制性内切酶；类和类限制性内切酶由于切割序列是随机的，与识别序列不统一，因此没有什么应用价值。限制性内切酶有三种切割方式：对称轴5侧切割；对称轴3侧切割；对称轴处切割DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被链接的DNA分子必须是双螺旋或双螺旋DNA分子的一部分。逆转录酶是一种多功能酶，他具有以RNA为模版的DNA聚合酶活性和以DNA为模板的DNA聚合酶活性以及RNaseH（降解RN

54、A）、DNA内切酶、DNA拓扑异构酶、DNA解链酶和tRNA（作为引物）结合的活性载体的特点：具有多克隆位点；能自我复制；基因筛选标记；在细胞内稳定存在。质粒除复制起点外还包括以下部分：抗菌素抗性基因；多克隆位点；启动子；前导序列；加尾信号Southern blotting：DNA印迹杂交； Northern blotting：RNA印迹杂交；Western blotting：蛋白质印迹杂交DNA序列分析常用的方法有：Sanger双脱氧链终止法和MaxamGilbert化学修饰法持家（管家）基因：指对所以类型组织细胞在任何时候都需要其表达的基因，通常都是维持细胞基本生存所必须的基因，其表达常保

55、持在固定水平奢侈基因：只在某些特定细胞类型中表达或者只在发育阶段的某些时期表达的基因重组DNA（基因工程）的主要步骤：目的基因的获得：目的基因与载体分子在体外进行连接反应，形成重组体；将人工重组的DNA分子导入能进行正常复制的寄主细胞，从而得到复制；重组体分子的转化子克隆的选择和筛选基因组DNA文库和cDNA文库的构建原理、差异及用途基因组DNA文库的构建：从生物组织细胞提取出全部DNA将其切成预期大小的片段，分别与载体连接，转入受体细菌或细胞，形成克隆。这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体

56、，就称为基因组DNA文库，如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组DNA文库。用途：分离特定的基因片段、分析特定基因结构、研究基因表达调控、全基因组序列测定等cDNA文库的构建：cDNA文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库用途：筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等区别：1、基因组文库包含了所有的基因，而cDNA文库只包含表达的基因，缺乏内元和调节序列，因此在研究基因结构时没有多大用处；2、cDNA文库代表了mRNA的来源，其中一些特定的一些转录本丰富而另一些很少，丰富度存在差别；而基因组DNA文库在理论上代表了所有基因序列；3、从不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表达的基因。基因组文库不能；4、基因组文库含有不表达序列，比cDNA文库大；5、mRNA在不同组织之间存在丰