特定序列脱氧核糖核酸电化学生物传感器进展

1、特定序列脱氧核糖核酸电化学生物传感器进展杨丽菊彭图治3(浙江大学西溪校区化学系,杭州310028摘要对当今电分析化学中的研究热点之一脱氧核糖核酸(DNA 的电化学生物传感技术的最新进展进行了综述,评述了其发展前景。关键词脱氧核糖核酸,电化学生物传感器,评述2000202227收稿;2000207230接受本文系国家自然科学基金(N o.29975024和浙江省自然科学基金及分析测试基金资助项目1引言脱氧核糖核酸(DNA 是遗传信息的承担者,具有贮存和传递信息的功能。绝大多数生物体的遗传信息储存在DNA 分子中,DNA 的复制构成了遗传的分子基础。DNA 是多聚脱氧核苷酸,其组成可简述如下 :D

2、NA 分子的一级结构是核苷酸通过3,52磷酸二酯键连接成没有支链的直线形或环形结构。1953年,Wats on 和Crick 提出了DNA 双螺旋模型的二级结构,即DNA 分子是由两条多脱氧核糖核酸链组成,链的内侧是碱基,两条链以反平行方向盘绕同一条轴形成右旋的双螺旋结构,两条链上的碱基是匹配的,称为碱基互补,腺嘌呤和胸腺嘧啶以两个氢键连接,鸟嘌呤和胞嘧啶以3个氢键连结。在DNA 分子中互补碱基的含量相等。在二级结构的基础上,DNA 分子还可以扭曲或卷曲形成超螺旋三级结构1。DNA 被称为生命体内的基因物质,人类基因组含有3109个碱基对,它的全序列的测定已经提前完成,这一宏伟目标的实现不仅能

3、使人们从根本上对人体的所有生命活动有全面的了解,而且会对某些现在还不能控制的疾病,找到根本的治疗方法2。研究发现,DNA 分子中碱基序列的变异与人类的许多遗传疾病有关,这些变异的复杂程度各不相同3。例如,2珠蛋白基因的点突变中,一个胸腺嘧啶被腺嘌呤替代,从而引起氨基酸替代,导致镰状红血球盆血症4。70%的囊性纤维变性病人和携带者与转移膜控制蛋白质基因编码中的一种三碱基残缺有关5。亨廷顿氏症是因为正常基因插入了重复的多碱基单位而增长6。因此,对人体的血液、组织及体液等样品中所含的特定DNA 序列的测定结果,可用于确证感染疾病的细菌和病毒根源。检测与疾病有关的变异对基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治

4、疗具有十分深远的意义。由于DNA 序列测定的传统方法操作繁琐费时,且使用放射性同位素作标记7,已不适用于常规分析。各种新的技术不断发展,并逐渐代替传统分析法,其显著改进在于采用了非放射性的生物素、地谷新配基及荧光染料作标记物810。基于荧光信号的测定是目前DNA 测定的最准确方法,但所需的仪器昂贵,且难以实现自动化。此外,聚合酶链反应(PCR 也已广泛用于感染病毒的测定11。该方法虽具第29卷2001年3月分析化学(FE NXI H UAX UE 评述与进展Chinese Journal of Analytical Chemistry 第3期355360有很高的灵敏度,但需要复杂的样品预处理过

5、程,分析时间较长,且难以定量测定目标基因。各国专家和学者投入这一领域12。2DNA 生物传感器的基本结构及类型DNA 生物传感器的基本组成包括一个DNA 探针和一个换能器。DNA 探针是合成的DNA 片段,其碱基序列与被测DNA 片段的碱基序列互补。换能器的功能是将DNA 杂交信息转换为可测定信号,且对固定化的单链DNA (ssDNA 和双链DNA (dsDNA 具有选择性响应。换能器的不同形成了各种DNA 生物传感器。其一大类型是采用质量敏感性换能器,包括表面声波(S AW 13,14和基于压电效应的石英晶体微天平(QC M 15,16。表面声波直接测定法是将单链DNA 直接或间接地固定在换

6、能器的表面,这些换能器对杂交后双链DNA 而引起的其表面质量的增加相当敏感。间接测定法是在导波器表面采用一个只能与双链DNA 结合的荧光团,由此感应DNA 的杂交信息17。石英晶体微天平能检测因多相混合物中的质量变化而引起的频率改变。Y.Okahata 等16以低聚核苷酸修饰的喷金QC M 检测DNA 的杂交反应。目前,这些换能器很难检测小于10-9g 的质量变化,因此,与临床医学所需的要求尚有差距。另一大类型是采用光学换能器,即DNA 光学传感器1821。可采用发光法、椭圆光度法及假布儒斯物角反射法等作为光学检测手段。Bard 等18采用化学发光检测了DNA 在烷基二磷酸铝Al 2(C 4B

7、P 膜电极表面的固定化程度和杂交程度。他们将未标记的ssDNA 先固定到Al 2(C 4BP 膜电极表面,然后将电极浸入含有已用Ru (bpy 2+3的标记的互补DNA (cDNA 的溶液中,由于杂交作用而使电极表面形成标记了Ru (bby 2+3的dsDNA ,通过测定在含有三正丙胺溶液中(Ru (bpy 2+3的氧化产生的电致化学发光而检测DNA 的杂交程度。第三大类型是采用电化学换能器。即DNA 电化学生物传感器。其基本原理是:当一条ssDNA 与样品中与之互补的另一条cDNA 相遇时,两者发生杂交反应,反应体系的电压、电流或电导等电化学信号会发生变化,通过对此类变化的检测可对样品中DN

8、A 的结构和含量等信息加以测定。这是目前人们寄信号代替荧光对DNA 杂交进行快速测定不仅可行,并且极具优势。因为不管样品的清澈或混浊,电信号都可以被测定,且不需要激光诱导或分光检测器。F.G arnier 认为:用直接的电信号来分析DNA 序列,将更加精确,更加灵敏。3DNA 电化学生物传感器的研究现状311DNA 电化学生物传感器的设计DAN 电化学生物传感器测定DAN 的整个过程包括以下四步:一是DNA 探针的固定,这是一个有关表面的问题,即要将ssDNA 连接或者固定到一个固体电极的表面,形成DNA 探针电极。二是杂交过程,DNA 探针电极放入被测溶液,当互补的目标ssDNA 与之相遇时

9、,它们将在电极表面杂交形成dsDNA ,这一过程中必须控制合适的杂交条件。三是杂交的指示,即如何将杂交信息转化为可测定的电化学信号。四是电化学信号的检测,可将电流、电压或电导作为检测信号。DNA 探针的固定和杂交的指示是此类传感器的两大关键问题。653分析化学第29卷312DNA 探针的固定方法DNA 探针的固定是DNA 电化学传感器制作中的首要问题,固化量和活性直接影响传感器的灵敏度,为了把DNA 牢固连结在电极表面,往往需要借助有效的物理或化学方法。就目前研究者所采用的DNA 探针固定方法而言,大致可以分为以下4类。(1共价键合法这种方法中大多采用碳质电极作为基体电极,其优点是表面易于产生

10、各种功能硬脂酸,然后在高浓度DNA 的水溶性碳化二亚胺体系中,使DNA 键合到电极表面,由此制成DNA 探针电极,检测了囊性纤维变性基因F 508的序列。他们还曾以玻碳电极为基体23,24,用1232二甲胺2两基232乙基碳化二亚胺盐酸盐和N 2羟基硫代琥珀酰胺活化电极,使其与脱氧鸟嘌呤核苷残基结合,从而使DNA 连结电极表面。方禹之等2527用乙基2(32二甲基丙基碳二亚胺盐酸盐和羟基丁二酰亚胺活化已被氧化的光谱纯石墨电极,将含75个碱基的DNA 共价固定到电极表面。(2吸附法这种方法是将DNA 直接或恒电位吸附到电极表面。J.Wang 等28,29采用恒电位吸附法将DNA 固定到碳糊电极(

11、CPE 上,CPE 先在含有DNA 探针或肽核酸(PNA 探针的011m ol/L pH5乙酸缓冲液中117V 预处理1min ,随后在20110V 吸附PNA 探针2min ,或在015V 吸附DNA 探针2min ,再用0101m ol/L 的磷酸缓冲液清洗电极,即可分别固定PNA 和DNA 至电极表面,对肿瘤抑制基因p53进行检测,获得了满意的结果。K.Hashim oto 等30,31将抛光处理后的平面热解石墨电极直接放入100的含有DNA 探针NaCl 溶液中30min ,DNA 即被吸附至石墨电极表面,再用100的水洗去多余的DNA 。(3自组装法一般以金电极为基体电极,并在DNA

12、 探针分子上接上硫醇基团,利用-SH 基团可自组装至电极表面。K.Hashim oto 等32将预处理过的金电极浸入与v -myc 致癌基因互补的含有20个碱基且连有巯基已基的DNA 探针溶液中,在4时持续12h ,制成的DNA 电极对目标DNA 的检测限达10-13m ol/L 。(4电聚合法利用导电化合物在电极表面的电聚合作用将DNA 探针固定在电极表面。F.G arnier 等33以聚(32乙酸吡咯/(32N 2羟基苯邻二甲酰亚胺吡咯为前体共聚物,将带有胺基的含有14个碱基的DNA 或低聚核苷酸(ODN 嫁接到电极表面,对目标ODN 片段的测定灵敏度达1000A/m ol ,检测限为10

13、-11m ol/L 。313杂交的指示在合适的条件下,DNA 探针电极浸入含有目标cDNA 链的溶液时,cDNA 即与电极表面的DNA 探针杂交形成dsDNA ,为了检测所发生的杂交信息,必须采用一种电活性分子,称之为杂交指示剂,它能选择性地与dsDNA 结合,且仍然保持电活性,能在电极上产生某种可被测定的电信号从而反映DNA 的杂交信息。DNA 电化学生物传感器的灵敏度直接依赖于杂交指示剂对dsDNA 的选择性。就目前研究者所采用的杂交指示剂与DNA 的作用方式而言,基本上可分为以下几类。(1嵌入剂(Intercalator 通常是具有电活性的小分子物质,它们能选择性地与电极表面的dsDAN

14、 结合。通常是将杂交反应后的电极浸入含有嵌入剂的溶液中反应一定时间,或在杂交反应之前,先加入一种电活性分子再进行杂交,然后进行电化学检测,所得信号的大小或变化值可以反映电极表面dsDNA 的多少,从而测定被测溶液中目标DNA 片段的含量。嵌入剂与DNA 分子的作用一是通过分子嵌入dsDNA 双螺旋的碱基之间,二是通过分子与DNA 骨架上的磷酸基团之间的静电作用。K.Hashim oto等33对二十多种不同类型的染料、抗体、抗菌素、金属离子络合物及其他分子作为嵌入剂的性质作了研究。许多DNA 电化学传感器研究者已采用了多种分子作为嵌入剂2223,2629。J.Wang 等28,29采用C o(p

15、hen 2+3作为杂交指示剂,将杂交后的电极先在0102mol/L pH710的Tris 2HCl 溶液中清洗10s ,然后插入含有012m ol/L C o (phen 2+3的Tris 2HCl 溶液中,在015V 反应1min ,C o (phen 2+3即与电极表面的dsDNA 结合,采用计时电位法检测杂交前后C o (phen 2+3的峰面积变化,从而测得特定序列DNA 的含量。也有采用吖啶橙等染料、柔毛霉素等抗菌素作嵌入剂34。由于这些嵌入剂与DNA 分子之间存在上述两种作用,因此,它们往往可以同时与ssDNA 和dsDNA 相结合,只是结合力大小不同,因此,嵌入剂作为杂交指示剂其

16、选择性并不十分理想。例如用伏安法测定柔毛霉素对电极上dsDNA 和ssDNA 的选择性753第3期杨丽菊等:特定序列脱氧核糖核酸电化学生物传感器进展纹型的嵌入剂3538。例如,他们将萘二酰亚胺的两端分别接上两个电活性的二茂铁基团,利用萘二酰亚胺与dsDNA 分子形成稳定的化合物,而所带的二茂铁基团可在电极发发生氧化还原而产生可被检测图1两端带二茂铁基团的萘二酰亚胺螺纹型嵌入剂Fig.1Threading intercalator with ferrocenyl groups at each end的电化学信号,其结构如图1所示。由于这种分子两端所带的两个体积庞大的二茂铁基团,使其从DNA 分子

17、上脱开的速度大大减慢,因而易于电化学信号的测定,能获得更高的灵敏度36。(2DNA 分子小沟结合剂(DNA minor groovebinder 这类物质的作用与嵌入剂相类似,但是它们与DNA 分子结合的方式与上述嵌入剂有所差别,它们并不嵌入dsDNA 分子的碱基中间,而是与DNA分子扭曲区的小沟相结合。这种小沟只存在于dsDNA 分子中,ssDNA 并不具备,因此,这种结合剂对dsDNA 的选择性优于上述嵌入剂。这类物质大多是一类平面结构的药物分子,如纺缍素、偏端霉素等,或是二苯并酰亚胺类染料32,39。各种小分子与DNA 分子相互作用的电化学研究是上述嵌入剂和小沟结合剂的选择基础,这类研究

18、在国内外已有不少文献报道4047。(3电活性DNA 标记物直接在DNA 链上引入导电性分子作为标记物。G arnier 等已在这方面进行了多年的研究。最近的研究中33,他将一个含13个碱基的低聚核苷酸连接到聚吡咯上,这样不仅可以增加电导,还使其在水溶液中具有更高的电活性。实验发现,当杂交反应发生时,电流强度会降低,并且他认为这是由于聚合物骨架形态的改变而引起的。目前,这种方法的灵敏度为10-13m ol/L 。法国的一家生物医药公司对此很有信心,正在发展一个基于此实验结果的原型装置。P.Bauerle 等48已在实验中观察到当连结在聚噻吩的冠醚与碱金属离子络合时,有电信号的改变。他们首先研究了

19、单个碱与聚噻吩作用的效果。目前,他们正在研制在水中具有更好电活性的聚噻吩,以试验它与15个碱基DNA 的作用情况,并认为此项研究的前景非常乐观。方禹之等49研制了醛基二茂铁标记的DNA 探针,对小牛胸腺DNA 有良好的响应。314DNA 电化学传感器的新动向(1提高选择性J.Wang 实验室进行了一些新的试验,期望能有效地增加选择性。他们采用肽核酸(PNA 而不是DNA 作探针,PNA 可以和DNA 进行碱基配对,并且由于它是中性的、具有类肽骨架,因此它甚至能比DNA 更好地选择性识别特定的DNA 链28,29。(2提高灵敏度为了取得更高的灵敏度,J.Wang 使用具有树叉状支链的DNA 代替

20、ssDNA 连接到电极上,制成探针。目前,用了含有30个臂的树叉状DNA ,已将信号增加10倍,而且大大扩展了线性范围。设计具有数百个臂的树叉状DNA 也是完全可能的50。(3无杂交指示剂或标记物这类传感器的基本依据是:DNA 碱基中的鸟嘌呤很容易被氧化,由此引起的电信号的变化可用于直接检测杂交的发生。这一技术已与一次性碳纤维电极和便携式分析仪结合应用51。(4传感器的微型化加州临床微传感器(C MS 公司在1998年美国创新尖端技术大会上首次展示了手提式DNA 传感器的原型。含有细胞和病毒的样品可以直接加到所设计的装置中被测定。由于采用自组装烷烃硫醇单分子绝缘层于电极表面,已标记的DNA 采

21、用苯乙炔导线分子透过绝缘层连接到电极表面。由于绝缘保护层的存在,使金电极免除溶液中其它氧化还原类物质的干扰,可在血液等很复杂的环境中直接进行测定,操作简单省时,而且具有极高的灵敏度。853分析化学第29卷4DNA 电化学生物传感器的问题与展望采用电化学生物传感器测定DNA 时,主要干扰在于:部分ssDNA 与其它物质相结合,形成杂交假象,因此必须十分仔细地防止这种现象的出现,这些干扰的物质必须除去。另外,温度也是影响选择性的一个重要因素。有些DNA 链可能会与不完全互补的DNA 链结合,但是其产物的稳定性比与互补DAN 结合产物的稳定差得多,并且受温度影响很大12。因此,合适的温度,对实验结果

22、很重要。DNA 电化学生物传感器的研究将不断的深入,其主要发展目标是实现在医学和临床诊断领域的实际应用,这要求传感器具有快速、灵敏、价廉、便携等特点。因此,电化学DNA 芯片技术的研究将是一大发展方向,这要求传感器具有小型和多道化的特点,可同时获得数以千万计的信号。R eferences1Jin Wenrui (金文睿,Wang Naixing (汪乃兴,Peng Tuzhi (彭图治,Zhao X in (赵昕.Bioelectroanalytic Chemistry (生物电分析化学.Jinan (济南.Shandong University Press (山东大学出版社,1994:194

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