生物活性多肽分离与检测的研究进展

1、2008年第6期收稿日期:2008-04-03基金项目:四川省科技厅应用基础项目(0325127。作者简介:王立晖(1981-第6期(总第139期农产品加工学刊No.62008年6月Academic Periodical of Farm Products ProcessingJun.文章编号:1671-9646(200806-0021-040引言生物活性肽又称天然肽(natural peptide ,是生物体内一些具有特殊功能肽的统称,一般为寡肽和较小的多肽。生物活性肽(active peptide 是沟通细胞与细胞之间、器官与器官之间的重要化学信使,通过内分泌、旁分泌、神经内分泌以及神经分泌

2、等作用方式,传递各种特异信息,是由机体构成的一系列严密控制系统,从而可调节生长、发育、繁殖、代谢和行为等生命过程。对生物活性肽的研究,甚至涉及人类的意识、行为、学习、记忆等更高层次的生命形态和活动规律,涉及免疫防御、肿瘤病变、延缓衰老、生殖控制、生物钟节律等一系列理论和实际问题,因而具有重要的理论意义和实践意义1。本文主要研究活性多肽工艺中的下游工程,即分离与检测。1活性多肽的分离与纯化对于生物活性多肽的分离与纯化,普遍采用高效毛细管电泳(HPCE 、反相高压液相色谱(RP HPLC 、超滤和交联葡聚糖凝胶层析(Sephadex 等方法,都取得了不错的效果。高效毛细管电泳(High Perfo

3、rmance Capillary Electrophor_esis ,缩写为HPCE 是指溶质以电场为Eli Zahou 等人在应用HPCE 技术分离肽和蛋白质水解物时,采用异硫氰酸苯酯衍生并在磷酸缓冲液中加入SDS 来提高分离度,缩短分离时间。苯基硫代氮甲酰衍生物的检测在1013mol 时有良好的线性关系,线性相关系数为0.9938。迁移时间和峰面积的变化平均为1.1%2.7%。应用75m 的毛细管分离多肽水解的18种氨基酸,所需时间小于30min ;生物活性多肽分离与检测的研究进展王立晖1,袁永俊2,孙勇民1,李培俊3(1.现代职业技术学院,天津300222;2.西华大学,四川成都6100

4、39;3.温州质量技术监督检测院,浙江温州325000摘要:自从1979年Brantl 等人首先从酪蛋白的水解产物中分离到-酪啡肽-7,对于生物活性肽的制备、分离、纯化等各个方面均有广泛的研究。随着各种生物活性短肽的不断发现,其研究和开发日益受到各国学者的关注。关键词:生物活性肽;分离;检测中图分类号:Q81文献标志码:AResearch on Separation and Examination of Bioactive PeptidesWang Lihui 1,Yuan YongJun 2,Sun Yongmin 1,Li Peijun 3(1.Tianjin M odern Vocati

5、on Technology College ,Tianjin 300222,China ;2.Xihua University ,Chengdu ,Sichuang 610039,China ;3.Wenzhou Institute of Technology and Calibration ,Wenzhou ,Zhejiang 325000,China Abstract :Since separate the -casomorphin-7from hydrolyzed casein by Brantl in 1979,the preparation and separation and ve

6、ry much each of etc all contain extensive research.When more and more new kind of bioactive peptides were discovered ,the studying area for bioactive peptides became a focus of attention in many countries.Key words :bioactive peptides ;separation examination农产品加工学刊2008年第6期而50m毛细管所需时间则小于15min。对10600个

7、氨基酸残基的多肽,该方法的灵敏度比HPLC 高20倍,而比传统的基于茚三酮的方法则高1000倍。M ingliang Ye等人应用强阳离子交换填充物做固定相的离子交换毛细管电色谱(IEcEc对肽的分离进行了研究。实验中的理论板数达到24000460000板/m,且连续10次测定,迁移时间的相对标准差小于0.27%,应用IEcEc可以在3.5min内对10种肽进行快速分离。Sigrid C.等人用毛细管电泳对谷氨酰基三肽及其降解物和异构体进行了分离。Kai Zhang等人则采用加压毛细管电色谱对多肽进行分离。此系统可进行连续梯度洗脱,流动相受压力和电渗的共同驱使,在分离复杂样品时,比等度压力毛细

8、管电色谱具有更好的效果。他们还对电压、压力、离子等试剂对肽分离的影响进行了研究2,3。1.2反相高压液相色谱在多肽分离中的应用反相液相色谱(reverse-phase liquid chromatopa-phy,RPLC是目前液相色谱分离中使用最为广泛的一种模式,它的特点是固定相的极性比流动相弱。与它相对应的是正相液相色谱或极性相液相色谱(nor-mal-phase liquid chromatography,如硅胶、氧化铝或离子交换等极性介质为固定相的色谱,其中流动相的极性低于固定相。由于RPLC比固相载体的疏水性强,它可以根据流动相中被分离物质分子疏水性的不同而发生强弱不同的相互作用,从而

9、使不同分子在反相柱中彼此分离。疏水性较弱的样品分子和固定相间的相互作用较弱,因此较快流出;反之,疏水性相对较强的分子和固定相间存在较强的相互作用,在柱内保留时间相对较长。RPLC在20世纪50年代就已用于许多有机小分子的分离和分析,20世纪80年代后逐步应用于生物大分子如蛋白质、多肽、核酸的鉴定,并用于制备规模的分离。与其他色谱方法相比,RPLC具有分辨率和回收率高、重复性好和操作简便等优势。由于RPLC可使用挥发性体系,如水溶三氟乙酸(TFA乙腈(ACN,纯化产物不必进行脱盐,因此,可大大简化操作步骤。另外,在其他模式的色谱中,保留时间主要决定于天然蛋白质分子表面的某些基团与固定相配基间的相

10、互作用。而在RPLC中,蛋白质分子通过色谱柱时会发生或多或少的去折叠,内部某些疏水残基暴露并与固定相相互作用,从而表现出与其他色谱及电泳方法不同的选择性,提供其他方法不能提供的信息,这成为RPLC在蛋白质及多肽分离分析中的一个有利因素。由于以上种种原因,RPLC已经成为广泛使用的一种分离模式,普遍用于多肽和蛋白质的分离分析45。RPLC可用于绝大多数的多肽纯化。RPLC流动相以水为基本组成部分,与肽的生物学性质相适应,虽然流动相中的酸、有机溶剂以及固定相,均可能使肽的天然构相发生变化,但当这些因素除去后,肽的构相一般能恢复原状。因此在RPLC中,肽的回收率一般在80%以上。早在1986年,人们

11、就用RPLC对神经肽进行了纯化。Boyes等人也报道了用连续RPLC对细菌原液中的重组淀粉状蛋白前体多肽片段进行分离。1984年加利福尼亚大学的Kwen-Jen Chang等人对Bio-Gel P-2,Amberlite XAD-2,RP-HPLC,氨基酸分析仪,质谱进行了分析,通过峰值比较得到-酪啡肽样物质6。日本学者Yunden Jinsmaa和M asaaki Yoshikawa 通过反相HPLC十八烷醇酯硅胶(ODS柱,用线性梯度的乙腈,含有0.1%三氯乙酸,在流速为10mL/min进行洗脱。阿片肽片断可以通过苯乙基硅胶柱和氰基丙烷硅胶进一步纯化。在流速1mL/min下,这种阿片肽片断

12、得到分离。单个的消化物纯化得到的阿片肽产量可以从280nm HPLC吸收区域而得到计算7。南京农业大学的张源淑等人对酪蛋白经胃蛋白酶水解的水解液,用SephadexG15进行粗分离,再利用RPLC进行纯化和检测可以得到-Casomorphin-7。同时利用-Casomorphin-7的竞争抑制酶联免疫分析方法(ELISA,对水解产生的-Casomorphin-7样物质进行了定量分析,是国内最早从事酪啡肽研究的学者6。近年来,关于多肽RPLC纯化也取得了许多成功,如Krusa等人用RPLC对大豆蛋白进行了纯化和定量分析,HPLC纯化多肽举例见表17。1.3超滤在多肽分离中的应用超滤原理近似机械筛

13、分,是利用膜的选择性,在膜两侧存在的一定量能量差作为推动力,通过溶液中各组分透过膜的迁移速率的不同而实现非均相物系的分离。由于超滤膜具有不对称微孔结构,且采用薄层流道和湍流促进结构,减少膜的污染,在分离过程中,使得大分子溶质和微粒(如胶体或淀粉等随溶液切向流经膜表面,而小分子物质和溶剂则在压力驱动下穿过致密层上的微孔而进入膜的另一侧,因而超滤膜可以长期连续使用并保持较恒定的产量和分离效果。与传统工艺相比较,超滤不仅可以提高产品的纯度、节约溶剂或试剂的耗用量,而且能够实现连续化分离纯化,缩短生产周期8。222008年第6期表1RPLC纯化多肽举例多肽Peptide反相柱Reversed-phas

14、e column洗脱液A,BEluent A,B梯度Gradient神经肽Neuropeptides Bondapak ODS H2O,ACN12%30%B,070min;30%100%B,7080min;抗菌肽Antimicrobial peptide HIAsil300C180.083%TFA in H2O0.06%TFA in ACN100%B,8090min25%75%B,035min血管紧张素转换酶抑制肽Angiotensin-1-converting enzyme inhibitory peptide Devolosil ODS-50.1%TFA in H2O0.1%TFA in8

15、0%CAN0%B,020min;0%40%B,2080min;40%B,80110min;100%B,110120min蝎毒素多肽Bmk4112PeptideBmk4112from Scorpionvenom Alltech C180.01%TFA in10%H2O0.1%TFA in80%ACN20%50%B,030min华南理工大学食品与生物工程学院陈山等人用板框型超滤器,以全回流的方式对大豆粗肽进行处理,通过测定不同浓度的大豆肽液,在不同循环时间内滤出液的膜通量变化,及截留液中固形物的含量,对超滤膜效能及其选择性进行了评价和分析。试验结果表明,超滤技术不仅能直接从发酵产物中分离出纯度较高

16、的大豆肽,而且可以作为一种检测手段用来分析发酵产物中组分的相对分子质量分布7。华南理工大学食品与生物工程学院林伟锋等人,用根式超滤装置以全回流方式对沙丁鱼粗肽溶液进行处理,通过测定不同水解度的沙丁鱼粗肽溶液在超滤过程中组分的透过速率、截留液和透过液中肽的含量,以及SDS聚丙烯酰胺电泳检测组分分子质量的分布,对超滤膜的选择性及分离效果进行了评价和分析。试验结果表明,超滤膜对沙丁鱼粗肽溶液中不同分子质量的组分具有分离纯化作用,超滤技术可以作为一种初步检测沙丁鱼粗肽溶液组分分子质量分布的手段9。江南大学食品学院陈季旺等人,采用超滤法从米糠可溶性蛋白酶解物中,初步分离提取类阿片拮抗肽,研究了错流方式的

17、根式膜组件时间、压力、温度和料液质量浓度对膜通量的影响。采用截留分子量为10000的超滤膜,在料液质量浓度为10mg/mL,膜压差为0.14MPa,温度为15的操作条件下,由离体豚鼠回肠(GPI检定法鉴定表明,类阿片拮抗肽活性得到提高10。1.4凝胶过滤层析在多肽分离中的应用凝胶过滤层析法又称凝胶排阻层析或分子筛层析,是20世纪60年代初发展起来的一种简便而有效的液相柱层色谱技术。利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质(凝胶为填料,通过洗脱液的连续洗脱,使混合物中的各种物质按其分子大小不同得到分离。凝胶过滤层析所需设备简单,具有操作方便、分离迅速,以及不影响样品的生物活性等优点,广泛应用于大分子

18、物质的分离纯化,也应用于蛋白质去盐及分子量的测定。交联葡聚糖凝胶是具有多孔性三度空间网状结构的高分子化合物,属于软性凝胶,其微孔能吸入大量的溶剂。凝胶能溶胀至其干体积的许多倍,并得到与吸入溶剂体积成比例的孔隙度,在生物化学中,广泛用于蛋白质、核酸、酶和多糖类高分子物质的分离,是生物大分子分离纯化技术中不可缺少的一类介质,其分离基础是根据溶液中这些物质分子体积大小进行过筛。交联葡聚糖凝胶可起分子筛的作用,很少涉及表面吸附问题。20世纪80年代中期,在分析化学、无饥化学和物理化学领域,人们开展交联葡聚糖凝胶表面吸附性能的研究,发现它是一种优良的固体吸附剂,从而广泛用于色谱分离、固相吸附及分析等领域

19、11。中国农业大学食品学院邓勇等人利用葡聚糖凝胶(Sephadex G-25柱层析和高压液相色谱(HPLC测定大豆多肽分子质量、水解度,以及分子质量与苦味之间的关系。试验结果表明,随着水解度的增加。大豆蛋白水解物分子质量变小。当水解度为25%时,其分子质量绝大多数为5001000u。分子质量为5001000u的大豆多肽苦味较强12。青海大学农牧学院农学系焦迎春等人采用两次葡聚糖凝胶色谱法,从姬松茸菌丝体中提取肽类物质,初步分离获得肽,继而分析了肽的氨基酸组成和分子量。结果表明,姬松茸菌丝体中的活性肽含有丰富的氨基酸,是一种具有高F值(22.5的寡肽,其分子量为150030000u13。2多肽的

20、检测与鉴定2.1电泳用于多肽的检测Eunmi Ban等人结合毛细管电泳和免疫测定,以及激光诱导荧光法,对重组水蛭素进行了测定。将水王立晖,等:生物活性多肽分离与检测的研究进展23农产品加工学刊2008年第6期蛭素先用荧光物质异硫氰酸标记,HPLC纯化,然后与多克隆抗体孵育20min,再应用未涂层毛细管进行分析。实验表明,毛细管免疫测定(CEIA可以用于生物体系中水蛭素的定量测定。Gordana等人采用毛细管区带电泳,应用间接吸收对30种游离氨基酸和肽进行了检测。该研究采用氨基水杨酸和碳酸钠混合物作流动电解质,未涂层熔融石英毛细管(87cm×75m,电压15kV,间接检测波长254nm

21、,其分离时间小于30min,检测极限为1.9320.08mol/L3。熊少祥等人使用毛细管电泳激光诱导荧光增强型电荷耦合器件(CELIFICCD系统,用异琉氰酸荧光素(FTTC柱前衍生了亮脑啡肽、甲硫脑啡肽、血管紧张肽、P物质等4种生物活性肽, 8min内进行了快速分离检测,血管紧张肽的质量检出极限可达2.8×(1018mol。所用毛细管(内径50m,外径375m,河北永年光导纤维厂产品总长60cm,有效电泳长度40cm。2.2反相色谱检测活性多肽农业部乳品质量监督检验测试中心的赵建国等人在适当的条件下水解牛乳蛋白,得到多种肽的混合物,其中,酪蛋白水解产物C12就具有抗高血压的作用。

22、他们还建立了一种十分简捷的高压反相液相色谱分析方法来测定乳中酪蛋白的水解产物C12,获得了理想的效果15。长春中医学院附属医院新药研究开发中心朱伟等人,采用高效液相色谱检测分离得到的蜂毒多肽BV I-2H为单一对称峰,电喷雾质谱检测结果表明BV I-2H是蜂毒多肽混合物,其主要成分的分子量为644.8u。BV I-2H可抑制ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖和IL-1合成,可使ConA诱导的脾淋巴细胞呈现明显的G2/M期阻滞。此外,BV I-2H可抑制PM A诱导THP-l细胞合成TNF,抑制TNFmR-NA的表达及IB蛋白磷酸化。2.3多肽的活性鉴定北卡罗里那大学KwenJen Chang和Y

23、ing Fu Su 从放射性免疫检测(RIA看出分离材料具有吗啡特性,通过质谱分析法可以看出这种肽具有阿片结合特性16。日本学者对于阿片肽活性的检测,是通过M VD (小鼠血管延迟收缩试验和大传感器纪录等,从而检测出阿片活性的19。邹思湘试验了酪蛋白及其不同时间消化液的酶解,其结果也显示,酪蛋白本身和其不同时间消化液与N G10815细胞共同培养,都可以刺激该细胞腺苷酸环化酶的活性,并随消化时间的延长,作用加强,但只有2h酶解液的刺激作用可被纳洛酮反转,完整和未完全降解的酪蛋白则无此作用。这个结果有力地说明了分离存在与酪蛋白多肽链中的阿片活性物质,是以无活性的形式隐藏在其氨基酸序列中,必须通过

24、适当酶解,在一定条件下才能释放出来,发挥其阿片样的活性作用20。张源淑以富含-阿片受体的N G108-15杂交瘤细胞株,在有阿片和无阿片特异性拮抗剂纳洛酮存在的情况下,与酪蛋白及其胃蛋白酶酶解消化液共同孵育。其细胞抽提液用125I标记c A MP试剂盒进行放免测定,观察对细胞腺苷酸环化酶活性的影响。结果证明,酪蛋白经胃蛋白酶处理后有阿片样活性物质释放8。3生物活性肽的前景展望生物活性肽的研究,突破了食物蛋白仅限于提供氨基酸的旧概念,对传统的蛋白质营养价值观点提出了挑战。它不仅给动物生理生化学、营养生理学、生物医药,以及食品科学等学科提供了一个广泛的研究领域,而且为更科学全面评价饲料营养价值,制

25、定更科学的饲养标准提供了新的资料。如何进行低成本、高纯度的大批量生产,如何实现高效率的分离纯化与检测鉴定等等,成为研究的热点。有理由相信,开发和利用生物活性肽作为功能食品和饲料添加剂,以及新的治疗药剂的前景是非常广阔的。参考文献:张洪洲,万海清.生物化学M(第二版.北京:化学工业出版社,2006:54-55.明永飞,谢怡.新型荧光试剂用于小肽的毛细管电泳分离J.曲阜师范大学学报,2003,29(4:73-76.崔波,程云辉.毛细管电泳在多肽分离和检测中的应用J.ODD&MACHINEY,2004,20(3:45-48.张详民.现代色谱分析M.上海:复旦大学出版社,2004:68-79.

26、白泉,葛小娟.反相液相色谱对多肽的分离、纯化与制备J.分析化学简报,2002,30(9:1126-1129.张源淑,陈伟华,邹思湘.用HPLC测定酪蛋白酶解产物中的-Casomorphin-7J.中国乳品工业,1999,27(1:37-38.朱晓因,苏志国.反相液相色谱在蛋白质及多肽分离分析中的应用J.分析化学,2004,32(2:248-254.Marcel Mulder,李王林.膜技术基本原理M.(第二版.北京:清华大学出版社,1999:18-21.林伟锋,龙哓丽.超滤法分离纯化沙丁鱼肽J.食品与发酵工业,2004(1:109-112.123456789(下转第27页242008年第6期陈

27、季旺,孙庆杰.预分离米糠可溶性蛋白类阿片拮抗肽的超滤工艺J.食品科技,2003(12:21-24.赵永芳.生物化学技术原理及应用M.北京:科学出版社,2003:101-117.邓勇,冯学武.大豆多肽分子质量分布与苦味的确定J.中国农业大学学报,2001,6(4:98-102.焦迎春,郑哓冬.姬松茸菌丝活性肽的分离及其组成的初步研究J.食用菌学报,2004,11(2:12-15.熊少祥,韩慧婉,赵睿,等.高效毛细管电泳激光诱导荧光检测生物活性肽的研究J.分子测试学报,1999,18(5:1-4.张源淑,邹思湘.乳源阿片肽活性物质对动物消化、代谢的影响J.中国饲料,2001(13:14-15,21

28、.131415101112(上接第24页盐污染已相当严重,其对人类健康的威胁并不亚于蔬菜上残留的农药。然而VC能有效地抑制亚硝酸盐和胺类物质的合成。有研究表明,VC与亚硝酸盐的摩尔比为21时,阻断率为100%9。周泽义等人10在1998年提出的蔬菜中硝酸盐含量分级评价标准,是在1973年WHO的规定的基础上推算出来的,因此,按照世界卫生组织(WHO和联合国粮农组织(FAO1995年规定的ADI值为3.7mg/kgd,经推算,硝酸盐含量分级标准见表4。我国制定的无公害蔬菜的亚硝酸盐含量限量标准为亚硝酸盐(以NaNO2计不大于4.0mg/kg11,亚硝酸盐含量低于这一标准,符合无公害蔬菜亚硝酸盐限量标准,食用不会影响人体健康;如果亚硝酸盐含量超过限量标准,不宜食用或食用时要采取一定的措施。4结论参考蔬菜中硝酸盐含量分级评价标准,参考我国制定的无公害蔬菜亚硝酸盐含量限量标准(以NaNO2计不大于4.0mg/kg,对作为蔬菜的番薯藤评价如下。(1番薯藤嫩叶(顶端叶的叶片,硝酸盐含量低于轻度污染水平444mg/kg,亚硝酸盐含量低于我国制定的无公害蔬菜亚硝酸盐含量的限量标准,VC 含量高于50mg/100g,属于一级野菜,可以安全食用。(2番薯藤成熟叶(中部叶和老叶的叶片、嫩茎、嫩叶的叶柄的硝酸盐含量高于807