双脱氧末端终止测序法原理过程和目标基因cDNA序列拼接和分析

1、1双脱氧末端终止法测序的原理、双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目标基因序列的分析过程和目标基因序列的分析教教 师：程师：程 琳琳2011 年年 11 月月分子生物学实验分子生物学实验2实实 验验 目目 的的1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原理，掌握理，掌握DNA测序的基本方法；测序的基本方法；2、学会序列查询、核酸及蛋白质的同源性搜、学会序列查询、核酸及蛋白质的同源性搜索和比对。索和比对。3 DNA测序技术主要有两种方法，都是在测序技术主要有两种方法，都是在20世世纪纪70年代中期发明的。年代中期发明的。 A. 双脱氧链终止法双脱氧链终止法（the

2、 chain termination method），是通过），是通过合成合成与单链与单链DNA互补的多核苷互补的多核苷酸链来读取待测酸链来读取待测DNA分子的顺序分子的顺序。 B. 化学降解法化学降解法（chemical degradation method），），是将双链是将双链DNA分子用化学试剂处理，分子用化学试剂处理，产生切口产生切口，用同位素标记进行测序。用同位素标记进行测序。一、一、DNA测序的方法测序的方法41. Sanger双脱氧链终止法测序原理双脱氧链终止法测序原理 利用利用DNA聚合酶和聚合酶和双脱氧链终止物测定双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，核苷酸顺序的方法，

3、是由英国剑桥分子生物是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家学实验室的生物化学家F. Sanger等人于等人于1977年年发明的。发明的。5基本原理：基本原理： 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的区分长度只差一个核苷酸的DNA分子；分子； 利用利用DNA聚合酶不能够区聚合酶不能够区分分dNTP和和ddNTP的特性，的特性，使使ddNTP参入到寡核苷酸链参入到寡核苷酸链的的3-末端。因为末端。因为ddNTP 3不不是是-OH，不能与下一个核苷，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。链的增长。672、具体操作：具体操作： 测序时分

4、成四个反应测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外每个反应除上述成分外分别加入分别加入2,3-双脱氧的双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称核苷三磷酸（称为为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚然后进行聚合反应。在第一个反应中合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替会随机地代替dATP参加反应，一旦参加反应，一旦ddATP加入了新合成的加入了新合成的DNA链，由于其第链，由于其第3位的位的-OH变成了变成了-H, 所以不能所以不能继续延伸继续延伸,于是第一个反应中所产生的于是第一个反应中所产生的DNA链都是链都是到到A就终止了。就终止了。8 同理第二

5、个反应产生的都是以同理第二个反应产生的都是以C结结尾的尾的; 第三个反应的都以第三个反应的都以G结尾结尾, 第四个第四个反应的都以反应的都以T结尾结尾, 电泳后就可以读出序电泳后就可以读出序列了列了.9 假如有一个假如有一个DNA, DNA, 互补序列是互补序列是GATCCGAT, GATCCGAT, 我们试着做一下我们试着做一下: : 在第一个反应中由于含有在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题三个碱基时没什么问题, 但遇到但遇到A时时, 掺入的可能是掺入的可能是dATP或或ddATP, 比如已合成到比如已合成到G, 下一个如果参

6、与反应的是下一个如果参与反应的是ddATP则终则终止止, 产生一个仅有产生一个仅有2个核苷酸的序列个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸否则继续延伸, 可以可以产生序列产生序列GATCCG, 又到了下一个又到了下一个A了了. 同样有两种情况同样有两种情况, 如果如果是是ddATP掺入掺入, 则产生的序列是则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止延伸终止, 否则可否则可以继续延伸以继续延伸, 产生产生GATCCGAT. 将得到如下结果：将得到如下结果：1产生的都是以产生的都是以A A结尾的片段结尾的片段: GA,GATCCGA: GA,GATCCGA。234产生的都是以产生的都是以C C结尾的片

7、段结尾的片段: GATC, GATCC: GATC, GATCC产生的都是以产生的都是以G G结尾的片段结尾的片段: G, GATCCG: G, GATCCG 产生的都是以产生的都是以T T结尾的片段结尾的片段: GAT, GATCCGAT: GAT, GATCCGAT10 制得的四组混合制得的四组混合物全部平行地点加在物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组每组制品中的各个组分将按其链长的不同分将按其链长的不同得到分离，从而制得得到分离，从而制得相应的放射性自显影相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即图谱。从所得图谱即可直接读

8、得可直接读得DNADNA的碱的碱基序列。基序列。 即可得到测序结果：为即可得到测序结果：为GATCCGAT11制备单链模板制备单链模板 将单链模板与一小段引物退火将单链模板与一小段引物退火 加入加入DNA多聚酶多聚酶4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸分别加入少量分别加入少量4种双脱氧核苷酸种双脱氧核苷酸 将将4种反应产物分别在种反应产物分别在4条泳道电泳条泳道电泳 根据根据4个碱基在个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列条泳道的终止位置读出基因序列 3、技术路线：技术路线：124、 高通量自动化测序高通量自动化测序 DNA 序列分析自动化包括两个方面的内容，一序列分析自动化包括两个方面的内容，一方面是

9、指方面是指“分析反应分析反应”的自动化，另一方面是指的自动化，另一方面是指“读片过程读片过程”的自动化。的自动化。 自动化的自动化的DNA 序列分析，也是根据序列分析，也是根据Sanger 双双脱氧链终止脱氧链终止DNA测序法的基本原理发展起来的。测序法的基本原理发展起来的。13自动化测序原理自动化测序原理 自动化测序类似于自动化测序类似于PCR反应，反应，但只用一条引物，反应混合物中但只用一条引物，反应混合物中含有不同荧光标记的含有不同荧光标记的ddNTP与与4种种dNTP。由于每种。由于每种ddNTP带有带有各自特定的荧光颜色各自特定的荧光颜色,而简化为而简化为由由1个泳道同时判读个泳道同

10、时判读4种碱基。产种碱基。产物条带经过检测仪时给出特定信物条带经过检测仪时给出特定信号，由计算机判读并记录。号，由计算机判读并记录。 优点优点 ：可用双链：可用双链DNA做模板；做模板；模板用量少，不必克隆；可实现模板用量少，不必克隆；可实现高通量自动化。高通量自动化。14高速自动高速自动DNA测序仪的结构及工作原理测序仪的结构及工作原理 由激光发射器产生的激由激光发射器产生的激光束，通过精密的光学系统光束，通过精密的光学系统后被导向凝胶表面的检测区。后被导向凝胶表面的检测区。在此，激光束垂直射向凝胶，在此，激光束垂直射向凝胶，同经过检测孔的同经过检测孔的DNA片段片段发生作用，并提供能量激发

11、发生作用，并提供能量激发荧光发色基团发射出具特异荧光发色基团发射出具特异性波长的荧光。这些荧光通性波长的荧光。这些荧光通过聚焦镜集中后传给滤光镜过聚焦镜集中后传给滤光镜/棱镜组件，以便四种碱基棱镜组件，以便四种碱基产生的不同标记波长区别开产生的不同标记波长区别开来。经成像透像最后由高灵来。经成像透像最后由高灵敏度的相机分段收集信号，敏度的相机分段收集信号，传送给计算所分析处理。传送给计算所分析处理。15 荧光化合物标记荧光化合物标记链终止法以荧光颜色链终止法以荧光颜色为标记信号，每种为标记信号，每种ddNTP各有各有1种代表种代表颜色；整个反应在一颜色；整个反应在一个试管中进行；当新个试管中进

12、行；当新合成的终止单链通过合成的终止单链通过荧光监测仪时，可由荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷光信号读出末端核苷酸并由电脑记录。酸并由电脑记录。1617Sanger双脱氧链终止双脱氧链终止DNA测序法的测序能力：测序法的测序能力： 手工测序：最大约手工测序：最大约300 bp； 自动测序：最大约自动测序：最大约1200 bp。18二、序列比对分析二、序列比对分析1. 相似性与同源性相似性与同源性 相似性相似性(similarity)： 是指一种很直接的是指一种很直接的数量关系数量关系，比如部分相同或，比如部分相同或相似的百分比或其它一些合适的度量。比如说，相似的百分比或其它一些合适的度量。

13、比如说，A序列和序列和B序列的相似性是序列的相似性是80，或者，或者4/5。这是个量。这是个量化的关系。当然可进行自身局部比较。化的关系。当然可进行自身局部比较。19同源性同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质序列具而共同祖先的结论，属于质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断质的判断。就是说就是说A和和B的关系上，只有是同源序列，或的关系上，只有是同源序列，或者非同源序列两种关系。而说者非同源序列两种关系。而说A和和B的同源性的同源性为为80都是不科学的。都是不科学的。20 序列的相似性和序列的同源性有一定的关系，序列的相似性和

14、序列的同源性有一定的关系，一般来说一般来说序列间的相似性越高的话，它们是同源序序列间的相似性越高的话，它们是同源序列的可能性就更高列的可能性就更高，所以经常可以通过序列的相似，所以经常可以通过序列的相似性来推测序列是否同源。性来推测序列是否同源。 正因为存在这样的关系，很多时候对序列的相正因为存在这样的关系，很多时候对序列的相似性和同源性就没有做很明显的区分，造成经常等似性和同源性就没有做很明显的区分，造成经常等价混用两个名词。所以有出现价混用两个名词。所以有出现A序列和序列和B序列的同源序列的同源性为性为80一说。一说。21 序列相似性比较：序列相似性比较： 就是将待研究序列与就是将待研究序

15、列与DNA或蛋白质序列库或蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的程序包有的程序包有BLAST、FASTA等；等；22 序列同源性分析：序列同源性分析： 是将待研究序列加入到一组与之同源，是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小。这是理论

16、分析方法中最关键的一步。完小。这是理论分析方法中最关键的一步。完成这一工作必须使用多序列比较算法。常用成这一工作必须使用多序列比较算法。常用的程序包有的程序包有CLUSTAL等；等；232. Blast简介及应用简介及应用（1）Blast简介简介 BLAST 是由美国国立生物技术信息中心是由美国国立生物技术信息中心（NCBI）开发的一个基于）开发的一个基于序列相似性序列相似性的数据库的数据库搜索程序。搜索程序。 BLAST是是“局部相似性基本查询工局部相似性基本查询工 具具”（Basic Local Alignment Search Tool）的缩）的缩写。写。24 Blast 是一个序列相似

17、性搜索的程序包，其是一个序列相似性搜索的程序包，其中包含了很多个独立的程序，这些程序是根据中包含了很多个独立的程序，这些程序是根据查询的对象和数据库的不同来定义的。比如说查询的对象和数据库的不同来定义的。比如说查询的序列为核酸，查询数据库亦为核酸序列查询的序列为核酸，查询数据库亦为核酸序列数据库，那么就应该选择数据库，那么就应该选择blastn程序。程序。 下表列出了主要的下表列出了主要的blast程序：程序：25主要的主要的blast程序程序程序名程序名查询序列查询序列数据库数据库搜索方法搜索方法Blastn核酸核酸核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列

18、Blastp蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的序列序列Blastx核酸核酸蛋白质蛋白质核酸序列核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据库中的序列逐一搜索。质数据库中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白质蛋白质核酸核酸蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6框翻译后的蛋白质序列逐一比对。框翻译后的蛋白质序列逐一比对。TBlastx核酸核酸核酸核酸核酸序列核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核框翻译成蛋白质序列，再和核酸数据库中的核酸序列酸数据库中的核酸序列6框翻译成的蛋白框翻译成的蛋白

19、质序列逐一进行比对。质序列逐一进行比对。26（2） Blast资源资源1、NCBI主站点：主站点：/BLAST/（网络版）（网络版）/blast/ （单机版）（单机版）2、其他站点：、其他站点：http:/ /blast/（果蝇）（果蝇） 27 Blast结果会列出跟查询序列相似性比较高，符合结果会列出跟查询序列相似性比较高，符合限定要求的序列结果，根据这些结果可以获取以下一限定要求的序列结果，根据这些结果可以获取以下一些信息：些信息： 1.查询序列

20、可能具有某种功能；查询序列可能具有某种功能； 2.查询序列可能是来源于某个物种；查询序列可能是来源于某个物种； 3.查询序列可能是某种功能基因的同源基因；查询序列可能是某种功能基因的同源基因； 这些信息都可以应用到后续分析中。这些信息都可以应用到后续分析中。 28（3）Blast应用应用登陆登陆ncbi的的blast主页主页核酸序列核酸序列蛋白序列蛋白序列翻译序列翻译序列底下有其他一些针对特底下有其他一些针对特殊数据库的和查看以往殊数据库的和查看以往的比对结果等的比对结果等29Blast任务提交表单任务提交表单11.序列信息部分序列信息部分填入查询（填入查询（query）的序列）的序列序列范围

21、序列范围（默认全部）（默认全部）选择搜索数据库选择搜索数据库如果接受其他参数默认如果接受其他参数默认设置，点击开始搜索设置，点击开始搜索30Blast任务提交表单任务提交表单2设置搜索的范围，设置搜索的范围，entrez关键关键词，或者选择特定物种词，或者选择特定物种2.设置各种参数部分设置各种参数部分一些过滤选项，包括简一些过滤选项，包括简单重复序列，人类基因单重复序列，人类基因组中的重复序列组中的重复序列E值上限值上限窗口大小窗口大小如果你对如果你对blast的命令行选项熟悉的话，可以在这里加入更多的参数的命令行选项熟悉的话，可以在这里加入更多的参数31Blast任务提交表单任务提交表单3

22、3.设置结果输出显示格式设置结果输出显示格式选择需要显示的选项选择需要显示的选项以及显示的文件格式以及显示的文件格式显示数目显示数目Alignment的的显示方式显示方式筛选结果筛选结果E值范围值范围其他一些显示格式参数其他一些显示格式参数点击开始搜索点击开始搜索32提交任务提交任务返回查询号（返回查询号（requestid）可以修改显示结果格式可以修改显示结果格式修改完显示格式后修改完显示格式后点击进入结果界面点击进入结果界面33结结果页面果页面1图形示意结果图形示意结果34结果页面结果页面2目标序列描述部分目标序列描述部分带有带有genbank的链接，点击可以进的链接，点击可以进入相应的入

23、相应的genbank序列序列匹配情况，分值，匹配情况，分值，e值值35结果页面结果页面3详细的比对上的序列的排列情况详细的比对上的序列的排列情况36（4）一个例子）一个例子假设以下为一未知蛋白序列假设以下为一未知蛋白序列query_seq MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASAD