毒死蜱的微生物降解研究进展

1、For personal use only in study and research; not for commercial use毒死婢当前仍是全球应用最广泛的五种杀虫剂之一，也是我国用量最大的农药品种，是对硫磷、甲胺磷等高毒有机磷农药的替代品种， 主要作为农用杀虫剂 防治水稻、蔬菜等作物的螟虫、韭蛆等近百种害虫，也作为卫生杀虫剂用于防治 白蚁和嶂螂等。美国在20世纪末期毒死婢年用量就已达到约 7000吨，其中3/4 以上被应用于植物保护，其余则用于家庭卫生。毒死婢系列产品（乐斯本乳油） 于1984年在我国农业部农药检定所取得登记，获准在水稻、棉花、蔬菜等作物 上使用；同年，上海市政府在菜

2、篮子工程建设中， 推荐了乐斯本等几种农药用于 防治蔬菜害虫，以彻底取代甲胺磷等高毒农药。虽然毒死婢属于中等毒性杀虫剂，但危险性仍然很大，它能够通过皮肤进入 人体，并且在人体内有累积现象，长期或重复给予亚毒性剂量即可对细胞、 神经 轴突等产生影响，甚至可引起行为改变，WHO规定的毒死婢可接受摄取量为10g/kg/（6,7o随着健康及环保标准的提升，在许多发达国家毒死婢已被禁止使 用，2000年6月8日美国环保署（EPA宣布，禁止在美国家庭和庭院内使用毒 死婢杀虫剂，指出这种常用的杀虫剂会危害到儿童的健康安全。依据美国环保署的意见，新西兰政府决定含有毒死婢的产品自2005年12月31日将不再应用于

3、白蚁的防控，并号召取消毒死婢在所有有可能导致孩子暴露的地方使用，2011年10月28日，新西兰环保署提议禁止毒死婢用于花园。 为了保证儿童健康，几 乎所有的发达国家都已经禁止毒死婢应用于家居, 但是并没有完全禁止其在农业 领域使用；在大多数发展中国家，毒死婢仍是应用最广泛的农用杀虫剂、 由于经 济、技术发展的限制，短期内也不可能完全禁止毒死婢的应用， 那么如何减少应 用毒死婢所导致的负面影响就成为一个亟待解决的课题。1.2毒死婢的微生物降解研究进展微生物的降解作用被认为是环境中有机磷农药残留降解的最主要因素，因此分离筛选能够高效降解有机磷农药的微生物是解决农药污染， 进行环境修复的一 项有效措

4、施8,9。某些有机磷降解菌的降解作用具有广谱性，能降解多种不同的 有机磷农药，这是由于有机磷农药具有相似的化学结构， 降解菌产生的相关酶类作用于有机磷农药的共有结构所致，而降解速度的快慢则可能与农药自身的化学 稳定性、降解酶接触农药靶标位点的难易程度、农药及降解产物对酶促反应的反 馈作用等多种因素有关10,11,有机磷农药初步水解路径如图1-2。筛选能降解多 种有机磷农药的微生物菌株对于农药的污染治理也是一项意义重大的工作，现在也已经分离到了一些这样的菌株12。例如，黄杆菌属细菌Flavobacterium sp.ATCC 27551的水解酶能有效的水解几乎所有已知的O-P键13;缺陷假单胞菌

5、Pseudomonas diminutatfc具有相同降解功能14;近年来也有一些具有类似降解功 能的菌株报道15,16。一般来说，微生物长期持续接触某种农药就可能会诱导出降解该农药的能 力，所以经常从被农药污染的土壤或施用过该农药的土壤中分离针对该农药的降 解菌；也可通过人工措施使微生物适应目标农药，以获取高耐受能力和降解能力的微生物菌株。较早关于毒死婢降解菌的报道是Sethunathan N.等13于1973年从施用二嗪农的土壤中筛选出的黄杆菌( Flavobacterium sp.)以及 Serdar C.M. 等14在1982年筛选出的缺陷假单胞菌(Pseudomonasdiminut

6、a),它们能以共代 谢的方式降解毒死婢，但是不能以毒死婢作为唯一碳源和能源生长。Mallick等17 在1999年报道一株从土壤中筛选出的节杆菌(Arthrobacter sp.)能在无机盐培养基中降解毒死婢，能在 48 h内将10mg/L毒死婢完全降解。Ghanem等18和Li 等19分别分离到了 Klebsiella sp.和Sphingomonassp.,这两个菌株能以毒死婢作 为唯一碳源和磷源。除细菌外，也分离到一些能降解毒死婢的真菌，Bending G.D. 等20 (2002年)筛选出2株能降解毒死婢的真菌Hypholoma fascicularae和Coriolus versic

7、oloro方华2007年从土壤中筛选到一株毒死婢降解菌，经鉴定为 轮枝抱属(Verticillium sp.)真菌。大量的研究表明，在土壤或水体中微生物降解毒死婢的主要中间产物是3,5,6-三氯-2-叱噬酚(3,5,6-trichloro-2-pyridinol,TCP),如图 1-3 21,22。Racke等人 将毒死婢用14C标记后进行微生物降解实验，其结果表明毒死婢经土壤微生物作 用后的初步降解产物为3,5,6-三氯-2-叱噬酚(TCP), TCP能被进一步降解，终产 物为CO223,24。但TCP的进一步降解要缓慢得多，高浓度的TCP对毒死婢的生物降解还有抑制作用，另外，TCP较毒死婢

8、水溶性更大，更容易污染水体和土壤，从而放大毒死婢的危害23。毒死婢的初级降解产物除了 TCP外还有0,0-二乙基 硫代磷酸（盐）（diethylthiophosphate, DETP）,它们均能被微生物完全代谢为无机 物，Singh等人推测毒死婢的微生物降解途径如图1-4,可能会产生约15种中间代谢物2 o毒死婢的微生物降解也与环境因素密切相关，影响到降解菌株生长繁殖的因素都可能会对毒死婢的微生物降解产生影响，例如 ：温度、湿度、pH以及土著微 生物等生物因子。在最近报道的一些研究中都显示毒死婢的最大降解率一般都发 生在中性或者碱性条件下，这可能是由于降解毒死婢的关键酶在中性或碱性条件 下有更

9、大的酶活性，另外，在碱性条件下毒死婢的稳定性会受到影响，其水解率变得更高25。Singh等也报道了应用Enterobactor sp.降解毒死婢，在碱性pH时 实现了毒死婢的快速降解，但在酸性 pH时其速度则很慢26。目前，利用微生物降解毒死婢等农药残留已经成为环境及生物技术领域的研 究热点，在这方面的研究也已经取得了大量成果，分离出了大量降解菌株，并分析研究了相关降解酶及降解基因，但目前所开展的研究工作大多还只是局限在实 验室，进入实践应用的并不多，这主要是由于存在以下问题：筛选获得的农药 降解菌的降解效率普遍较低，而且菌株容易发生变异、退化而丧失降解能力，难 以满足实际需求；降解菌株的应用

10、环境条件不确定， 环境因素波动较大，这在 很大程度上影响到降解菌能否生长繁殖并发挥降解作用；应用到环境中的农药 降解菌会与土著微生物发生相互作用，导致功效的不确定性；将降解菌株制作 成便于储运和应用的制剂是其真正进入实践应用的基础，但目前与之相关的制剂化研究进展缓慢，存在制剂活性低、难于保存、生产成本高等问题。为了做好实 验室研究与实践应用之间的衔接，农药的微生物降解研究应该不仅仅局限在降解 菌的筛选、降解机理、降解动力学等，还应强化以下几个方面：具有农药降解 功能的天然复合菌系的研究与应用；工程菌的构建（拓宽降解谱、提高降解能力），降解酶基因的改造（降解酶的高效表达）等；降解酶及其制剂的研究

11、与 开发；降解菌与降解酶制剂的联合应用；多种降解菌的联合应用。1.3 生防菌及其在防治作物病害中的研究与应用有些微生物对作物病虫害具有抑制或杀灭作用，因此常被用于作物病虫害的 防治，这些有益微生物亦被称为生防菌。按照防治对象的不同，可分为防治作物病原菌的生防菌和防治作物害虫的的生防菌。通常所说的生防菌大多都是用于防 治作物病原菌，其中以防治作物土传病害最为普遍； 而防治作物害虫的生防菌则 多是对害虫有毒害或致病作用的微生物。 生防菌应用上的一项基本要求是不能对 所应用的作物对象有明显负面作用。应用生防菌防治作物病虫害的历史最早是从防治土传病害开始的，在20世纪早期就有人开始研究用微生物防治土传

12、病害，例如，Hartley应用一些常见的腐生真菌和细菌来尝试防治根腐病。在 20世纪30-50年代，技术人员开展了应 用放线菌及其代谢产物防治作物病害的大量研究；而在刚过去的 50年中，生防 菌的研究与应用取得了更快的发展，已有不少成熟的生防菌制剂被应用到农业生 产领域，可应用于作物病害防治的生防菌菌种也越来越多，甚至已经构建了一些 生防工程菌。用作生防菌的菌种主要包括细菌和真菌两个大类，另外也有一些病 毒和噬菌体被当作生防菌使用。近年来，由于人们的生态意识不断增强，长期应用化学农药所导致的环境污 染、农药残留和病原菌抗药性等问题得到了更多关注，以生防菌为代表的生物防治方法成为了近期作物病害防

13、治研究的热点之一。相关研究人员在生防菌筛选、 生防菌菌剂的制备与应用、以及生防菌控病原理等方面开展了广泛的研究， 取得 了大量的成果，主要表现在两个方面，一是生防菌菌种库被不断充实，生防菌制 剂也越来越多，二是对其防病机理的认识不断深入。生防细菌与生防真菌当前，应用较多的生防细菌主要有假单胞菌属(Pseudomonas、芽抱杆菌属(Bacillus)、农杆菌属(Agrobacterium)、链霉菌属(StreptomyceS等。利用生防细菌 防治作物病害最著名的例子是Kerr利用放射农杆菌(Agrobacterium radiobacterK84)成功防治由致病性农杆菌引起的冠嘤病27,28。

14、近来也有许多性能优异的生防 细菌被分离出来，其中不少菌株还被开发成商品制剂， 得到广泛的推广应用。这 些商品化制剂中则以芽抱杆菌制剂居多，这应归因于芽抱杆菌所具有的良好生防 性能、抗逆性和易加工性等特性。目前应用的芽抱杆菌种类主要有枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、蜡状芽抱杆菌和短小芽抱杆菌等。例如，Silveria 等人的研究发现巨大芽抱杆菌、蜡状芽抱杆菌和凝结芽抱杆菌3种细菌对番茄青 枯病具有较好的防治作用，同时还能提高番茄种子的发芽率。AGRAQUEST公司利用枯草芽抱杆菌QST713开发的活菌制剂Serenade”，被成功用于防治多种 作物的霜霉病、白粉病和灰霉病等。诺维信公司

15、生产的菌剂Taegro（含枯草芽抱 杆菌）施用于温室或者室内树苗、灌木和装饰植物的根部，可有效防治由镰刀菌 属和丝核菌属引起的根腐病和枯萎病。截止目前，美国已经有5株枯草芽抱杆菌生防菌株获得环保局（EPA）商品化或有限商品化生产应用许可。另外，我国的科 技人员也对芽抱杆菌属生防菌开展了大量研究工作，陈志谊等人研究了枯草芽抱 杆菌B-916对水稻纹枯病和稻曲病的防治机理，并开发了产品“纹曲宁”，其平 均防效可达70%以上29。韩艳霞等人的研究表明蜡状芽抱杆菌 B3-7菌株对小麦 全蚀病菌具有很强的抑制能力，可有效降低小麦全蚀病的发病程度30。童蕴慧等人证实地衣芽抱杆菌W10对灰葡萄抱（Botry

16、tis cinerea）引起的番茄灰霉病的防 治效果与化学药剂腐霉利相当310另一类被广泛研究和应用的生防细菌是假单胞菌，它们中有很多能产生抗菌物质，如硝叱咯菌素、藤黄绿脓菌素、二乙酰藤黄酚等。 Gupta等人（ 1999）发 现铜绿假单胞菌 GRC1能产生水溶性绿脓菌素，对由 Macrophomina phaseolina 和Fusarium oxysporum引起的土传病害具有很强的拮抗能力 32。郑爱萍等人（2003）证实致黄假单胞菌（Pseudomonas aureofaciens对水稻纹枯病菌菌丝有 强烈的致畸作用，并能抑制菌核的萌发，田间防效高于井冈霉素330 Fernando等人

17、（ 2007）应用Pseudomonaschlororaphis防治芸藁菌核病，其防效与杀菌剂 异菌月尿相当340另外，大量的链霉菌也被作为生防菌使用，例如，灰绿链霉菌 K61菌株对康乃馨枯萎病有很好的防治效果，在欧美国家己经商品化生产。迄今为止，也已有大量的生防真菌被用于作物病害防治，由生防真菌开发的 生防制剂甚至多于生防细菌制剂，并已在农业生产中发挥了巨大的作用。主要的生防真菌品种有木霉、盾壳霉、无致病力的尖抱镰刀菌等。木霉属真菌由于具有 生境广泛、对养分的要求低，易于分离和培养、生防疗效好等特点，已经成为目 前研究最为广泛的一类生防真菌。Weindling等人早在20世纪30年代就发现木

18、霉可以寄生许多土传真菌病害，如丝核菌属、镰刀菌属、小核菌属等，在土壤中适当添加木霉菌就能够防治一些真菌病害。重寄生作用被认为是木霉对作物病害 生物防治的一个重要机制，该类木霉首先对真菌寄主进行识别，之后缠绕于病原 菌的菌丝上，并侵入菌丝内而使其死亡。现己发现的具有生防作用的木霉有哈茨 木霉、绿色木霉、长枝木霉、黄绿木霉等。例如，从土壤中获得的哈茨木霉(Trichoderma harzianum) T-22菌株，能有效防治番茄枯萎病、天竺葵立枯病以 及由腐霉病菌(Pythium spp.)引起的碎倒病35, 36;绿色木霉T23菌株和TH-31 菌株则分别对甜瓜枯萎病和豆工豆褐斑病有很好的防治效

19、果。盾壳霉是核盘菌的重要寄生菌，对控制核盘菌菌核存活和子囊盘萌发十分有 效，可用于防控由核盘菌侵染引起的多种作物菌核病，并具有专一性强、有效时间长、对作物无致病性等优点。早在 1989年，前苏联就开始生产盾壳霉制剂 Coniothyrin用于向日葵菌核病的防治；另外，彳惠国生产的Contans和匈牙利BIOVED公司生产的KONI都是非常知名的盾壳霉制剂，具有防效好、持效期长、 费用低等特点，在与同功能的化学农药的竞争中亦具有优势。无致病力的尖抱镰刀菌则通常被用于防治由镰刀菌引起的植物萎焉病， Ogawa(1985)采用无致病力的尖抱镰刀菌预接种红薯，结果表明这能有效防治尖 抱镰刀菌引起的萎焉

20、病37。国内外的研究人员还对无致病力尖抱镰刀菌 FO47进 行了长时间的应用研究，发现该菌株能有效地控制黄瓜、西瓜和番茄等多种植物 的萎焉病和根腐病，该菌株目前在欧洲已被商业化生产， 并应用于作物土传病害 的防控。生防菌的控病机理生防菌一般通过分泌抗(抑)菌物质、竞争营养和生态位点、诱导抗性以及 重寄生等方式来抑制或杀灭病原菌，达到防治作物病害的效果。分泌抗(抑)菌 物质是生防菌防治作物病害最重要的机制之一，这些具有抗(抑)菌特性的物质 主要有：抗生素，毒素，抗菌肽及细胞壁降解酶，细菌素及其类似物。 例如，许多芽抱杆菌都能分泌低分子量的抗菌肽，对纹枯病、赤霉病、白粉病、 炭疽病等多种作物病害具

21、有防治作用。在这些抗菌物质的应用中，以抗生素最为常见，目前农用抗生素已经成为生物农药的主体，约占生物农药份额的90%。通过与病原菌竞争营养和生态位点来实现其抗病作用是生防菌防治作物病害的另一重要机制。自然环境（如，土壤）中微生物种类繁多，很多有生防功能 的有益菌与作物病原菌共存，并为了生存所需的营养物质和空间进行竞争，若生防菌获得竞争优势，就能起到抑制病原菌的作用380例如，木霉的繁殖速度比镰刀菌更快，当两者争夺生存空间时，木霉菌可使镰刀菌生长受到抑制，甚至导致其死亡39。Bacon等人分离的一株玉米内生枯草芽抱杆菌与玉米病原菌申珠镰 抱菌有相同的生态位点，而枯草芽抱杆菌能在玉米体内迅速定殖而

22、占有更多生态 位点,故能有效降低申珠镰抱菌的发病率40o另外，还有诱导系统抗性和重寄生两种重要的控病机制。有些生防菌在应用后能诱导植物发生一系列生理生化反应，并使其产生对多种病原菌的抗性，即诱导系统抗性（Induced systematic resistance, ISR）如，Benhamou等人（1996年）用短 小芽抱杆菌SE34预先接种豌豆，后期再接种病原菌，结果发现豌豆植株体内会 积累大量的木质素和酚类物质，并使寄主细胞壁加厚，能有效阻止病原菌的侵入 410重寄生则是生防菌寄生于植物病原菌上的一种寄生现象，包括生防寄生菌 与寄主菌的识别、接触和寄生等一系列的连续过程。通常木霉就是通过重

23、寄生的 方式发挥生防作用，木霉与病原菌（寄主）接触后，沿着寄主菌丝生长，并分泌 一些消化寄主细胞壁的酶，分解部分细胞壁后进入到寄主细胞内， 吸取寄主细胞 的营养进行生长繁衍，最终导致寄主死亡。1.4 生防菌在应用中存在的问题利用生防菌株防治作物病害尤其是土传病害已经取得了大量成果， 成功的利 用这些生防菌株开发了很多微生物制剂， 其中大多是含单一菌种的活菌制剂，这 些制剂也被广泛的用于生产实践，在应用中取得了不错的效果，但也存在一些问 题，影响了生防菌的应用与推广。目前所应用的生防菌基本都是在实验室筛选获得的一些抑菌效果很强的菌 株，这些菌株虽然在实验室筛选评估过程中都表现出了很好的防治病害效

24、果，但在田间应用时防病效果却并不理想、 或是性能不稳定，特别是在应用时间或应用 区域不同时，其防治效果重复性差。这主要是因为生防菌是通过其生命活动而发 挥功效，在其应用环境中的许多生物因子或非生物因子都会对生防菌的生命活动 产生影响，进而影响到生防效果420例如，在不同土壤中的微生物群落存在很 大差异，这些土著微生物又会与施加的生防菌发生复杂的相互作用， 在某些土壤 条件下，生防菌容易获得生长优势而发挥较好的功效， 但在其它土壤中却不一定 如此。另外，也存在生防菌菌剂活性不高、稳定性差等问题。为了应对生防菌在实践应用中所表现出的诸多不足，相关研究人员也展开了大量的研究，以期能更好的拓展生防菌的

25、应用。 主要有以下几个方面：优化菌 剂的制备工艺，生产出活性高、性能稳定的生防菌活菌制剂。深入研究生防菌 的生理生化特性、抗菌谱、抗逆性等，以便掌握其合适的应用方式和条件，确保 能有效发挥功效。两种或多种生防菌株的混和使用，合理的混用有时不仅能提 高防治病害的效果，还能发展多功能的菌剂，例如，Raupach等人将枯草芽抱杆菌GB03和短小芽抱杆菌INR7混合用于处理黄瓜种子，结果表明能显著提高对 多种病害的防治效果43o这可能是两种菌株都有相似的功能，混用后导致了效 果的叠加，也可能是一种菌株的存在对另一菌株的生存有利，导致其能更好的生长并发挥相关作用。但是菌株混用时必须要测试菌株之间的亲和性

26、，一般来说， 亲和性较好的菌株混用后能提高其防治效果，而亲和性差的菌株的混用效果则不 明确。对已有的生防菌进行改良，主要涉及到增强菌株抗逆性、提高抑菌物质 的表达、构建工程菌等几个方面。生防菌与其它辅剂或化学农药的联合应用。 另外，生防菌的抗病害相关基因的应用也值得关注，这些基因除了可用于构建工程菌外，还可用于发展转基因抗病植物。1.5 微生物活菌制剂概述微生物活菌制剂是指含有特定的微生物活体细胞，并以特定（有益）微生物 活菌数量为质量指标，且具有某些预知功能的微生物活菌制品。 产品主要有医疗 保健用活菌制剂（含兽用）、微生物农药及肥料、用于环境保护及工业发酵等方 面的活菌制剂等。法国科学家L

27、ouis Pasteur （1822-1895在1857年发表关于乳酸发酵的记录 之后，研究了丁酸、乳酸、醋酸和乙醇的微生物发酵过程，证明了微生物活菌在 发酵过程中的重要作用。1907年，俄国生物学家Elie Metchnikoff提出衰老是由于肠道细菌产物的毒害作用所致，并认为酸奶中的乳酸菌活菌能降低这种毒害作用，由此展开了微生物活菌与健康相关的系列研究；1915年，Daviel Newman首次利用乳酸菌治疗膀胱感染并获得一定疗效，随后科学家们对以乳酸杆菌为主 的活菌制剂进行了大量临床研究，取得了大量成果。1947年，Mollgaard发现用乳酸杆菌活菌制剂饲喂仔猪可改善仔猪健康状况，并有

28、效增加仔猪体重，后续的进一步研究促使活菌制剂进入到了动物养殖领域。20世纪中后期，微生物活菌制剂得到广泛发展，并被大量用于医疗、农业、工业发酵以及环境保护等多个领 域。我国对于微生物活菌制剂的研究与应用始于 20世纪70年代何明清等对不产 生肠毒素但产生大肠菌素的大肠埃希氏菌菌株的应用。20世纪80年代初康白教授成功研制了促菌生（又称乐腹康，主要成份是蜡样芽抱杆菌），用于治疗婴幼儿 的腹泻、肠炎等病症，取得了良好的效果。从此，微生物活菌制剂在我国的研究、 开发和产业化生产拉开了序幕，各种微生物活菌制剂相继走进市场，如常乐康（酪 酸梭菌、婴儿双歧杆菌），整肠生（地衣芽抱杆菌），培菲康（双歧杆菌、

29、乳酸杆 菌、肠球菌）等，但这些制剂均是用于医疗保健领域，而用于农业生产及环境保 护等方面的则相对较少。20世纪70年代末期我国开始了光合细菌、饲料酵母、 乳酸菌以及芽抱杆菌等活菌制剂在水产养殖及畜牧业上的应用研究，也取得了一定的成果，但受到产品应用效果不够稳定、生产或使用成本高以及生产习惯等方 面的影响，其发展较慢，仅有用作水产养殖领域净水剂的活菌制剂产品相对较多。 另外，几乎在同一时期，以苏云金芽抱杆菌和固氮菌为代表的用于种植业的活菌 制剂也得到了较快发展，特别是作为生物农药的苏云金芽抱杆菌的产量在20世纪70年代末就已达到1000吨以上规模；在20世纪80-90年代固氮菌的应用也 比较广泛

30、，解磷、解钾细菌制剂也得到发展，但在20世纪末期其生产及应用规模一度出现萎缩；进入21世纪，发展生态农业、实现农业可持续发展成为共识， 这带给了农用活菌制剂更多的发展机遇。周集体等人筛选到一株高效苯酚降解 菌，经鉴定为布鲁氏杆菌属（Brucella sp.）,除能降解苯酚外，还可利用苯胺、蔡、 氯苯等芳香化合物为唯一碳源生长45;但受限于菌株稳定性、安全性以及制剂 生产技术不成熟等多方面的原因，这些菌株很少被开发成商业化产品，在实际应 用中多是使用国外公司的产品，知名产品如丹麦诺维信公司的诺碧清系列污水处 理剂，美国碧沃丰公司的 BZT、OBT系列微生物制剂，美国通用环保科技公司 的利蒙LLM

31、O系列菌剂，这些制剂多应用于污水处理、有机污染物降解、土壤修复、资源循环利用等方面1.6 农用微生物活菌制剂的研究与应用现状微生物活菌制剂已经被广泛应用于种植业、养殖业以及农副产品加工等农业 领域，在种植业中应用的微生物活菌制剂主要包括微生物农药和微生物肥料两大 类。这里的微生物农药专指用于防治作物病虫害、去除杂草、调节作物生长或缓 解作物连作障碍的微生物活菌制剂。而微生物肥料则主要是指具有肥料效应的微 生物活菌制剂，我国著名微生物学家陈华癸教授对微生物肥料所做的定义是“一类含有活微生物的特定制品，应用于农业生产中，作物能够获得特定的肥料效应， 在这种效应的产生过程中，制品中的活微生物起关键作

32、用。”除了在种植业中应 用的微生物农药和微生物肥料外，微生物活菌制剂目前也已经应用到动物疾病防 治、饲料加工、改善动物生产环境等多个环节，养殖业也成为了微生物活菌制剂 应用最为广泛的领域之一。用作农药的活菌制剂作为微生物农药的活菌制剂主要有杀虫剂、杀菌剂、除草剂以及植物生长调 节剂等多种。微生物杀虫剂是其中使用最为广泛的一类，它是利用对某些有害昆 虫有致死作用的病原微生物制成，以防治和杀死目标害虫为目的的生物制剂， 常 用的微生物有细菌、真菌、原生动物及线虫。苏云金芽抱杆菌被认为是微生物杀 虫剂发展史上最重要的部分，1901年日本人S. Ishiwata在染病的家蚕幼虫体内 发现了苏云金芽抱杆

33、菌，并认为该菌是导致家蚕致病和死亡的主要原因，后人不断研究将苏云金芽抱杆菌用于作物虫害防治，美国于1928年启动了以应用苏云金芽抱杆菌为主的防治玉米螟计划，1929年就进行第一次大田应用，在1938年 法国第一个苏云金芽抱杆菌产品 Sporeine就面世了。除了细菌被广泛用作微生 物杀虫剂，许多真菌也被开发成杀虫剂，如白僵菌对多种农林害虫有致死作用， 已经大量用于防治玉米螟、水稻叶蝉、松毛虫等害虫。目前，在包括中国在内的 许多国家，真菌杀虫剂已广泛用于农林害虫和城市昆虫的防治，相关研究表明真 菌杀虫剂在植物病虫害的持续控制中具有巨大潜力，近年来已成为生防制剂的研 究热点。另外，一些原生动物以及

34、昆虫病原线虫也被用于杀虫剂开发，例如，原 生动物中微胞子虫能用于防治棉铃虫、 婢虫、松毛虫等；昆虫病原线虫是昆虫的 寄生性天敌，能主动寻找寄主，其侵染率高、致死力强、对人畜及环境安全，已 被广泛应用于防治农林害虫。直至今日，人类利用微生物杀虫已有100多年的历 史，已筛选的杀虫微生物达几百种，制成产品并大面积应用的主要有苏云金芽抱 杆菌、日本金龟子芽抱杆菌、球形芽抱杆菌、白僵菌、绿僵菌、拟青霉等。微生物杀菌剂一般包括农用抗生素和抗病微生物制剂，但在这里单指抗病微生物的活菌制剂，抗病微生物一般通过寄生、抗生、竞争、溶菌等作用来抑制、 甚至杀灭致病微生物。荧光假单胞菌(Pseudomonas fl

35、uoresce。黑研究最多的生物 防治细菌，它大量存在于植物根际，定殖于植物根面，繁殖快，可产生嗜铁素和 抗生素，在植物局部和空间微环境与目标菌竞争，对多种植物病原菌有抑制作用46。枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)制剂商业化生产与应用已有 30余年，这类制 剂对镰抱属(Fusarium )和丝核菌属(Rhizoctonia)植物病原菌防治效果较好，同时 还具有促进生长的作用47。放射土壤杆菌K84的活菌制剂在1973年就被大规模 生产，它能有效抑制致病性根癌土壤杆菌的生长，主要用于预防植物冠嘤病480另外，也有一些具有抗菌能力的真菌被用于作为杀菌剂， 如哈茨木霉(T. har

36、zianum) 对灰霉病、腐霉病、菌核病、立枯病等多种病害都有较好的防治效果，哈茨木霉 T39已在以色列等国家获得成功登记49。链抱粘帚霉(Gliocladium catenulatum) 也是一种重要的菌寄生真菌，可用于防治土壤里的腐霉菌和丝核菌。用作除草剂的活菌制剂是利用植物病原微生物致目标杂草染病死亡的微生 物制剂，一般由杂草病原菌的繁殖体和相应的助剂组成。由寄主杂草分离得到的植物病原菌对寄主植物一般具有种间特异性， 其选择性高，对栽培植物比较安全， 因而应用较多。应用最广泛的一类是利用病原真菌生产的抱子除草剂，真菌的抱子也是目前认为最适合作为除草剂的部分，对一些不产抱或产抱少的真菌则用

37、菌丝体片段来代替抱子。第一个注册上市的真菌除草剂是1981年在美国登记的Devine制剂J,它是将棕桐疫霉菌的厚垣抱子制成悬浮剂，用于防治柑桔园中的 莫伦藤以及其它多年生作物田中的有害葡萄树，其防治率可达96%; Collego制剂被认为是最成功的商品化真菌除草剂之一，它是将长抱状刺盘抱的抱子加工成可湿性粉剂用来防治皂角，大田常规使用防治率在90%以上；Tasmart制剂的活性成分为稗内脐蠕抱菌，用于防治水稻田中的稗草；1963年我国研制成功了真菌除草剂“鲁保一号”，它是在大豆菟丝子上分离得到的一种寄生性病原菌一胶 抱炭疽菌菟丝子专化型，可用于防治大豆、亚麻、瓜类、以及蔬菜等作物田中的 菟丝子

38、。具有杂草生物防治开发潜力的真菌类微生物主要集中在以下几个属：镰刀菌属、交链抱菌属、疫霉属、柄锈菌属、壳单抱菌属、刺盘抱菌属、尾抱菌属、 黑粉菌属、核盘菌属等50。细菌类则主要有假单胞菌属、黄单胞菌属、黄杆菌 属、肠杆菌属、柠檬酸细菌属、无色杆菌属、产碱杆菌属、欧文氏菌属等。日本 烟草公司开发的除草剂Camperico就属于细菌除草剂，其有效成分是杀禾黄杆菌 （Xanthomortsas campestris pv.poannua）, 可用于防治高尔夫球场的早熟禾，防治 率可达90%以上，且具有高选择性。由于微生物除草剂对环境较为友好， 持效期 长，并能在一定程度上解决化学除草剂所带来的抗性杂

39、草问题，因而一直广受关注，也开发了诸多产品，但又由于微生物除草剂存在防治效果不稳定 （受环境影 响大）、靶标单一、菌株易退化等问题而导致其难以规模推广和应用。随着生物 技术的发展和对杂草科学、除草微生物病原生物学及致病机理、遗传学等方面研 究的深入，相信微生物除草剂将会在除草剂市场占有更大份额。还有一类能调节作物生长的活菌制剂，它主要是利用微生物生长过程中产生 的具植物生长调节功能的代谢物（如脱落酸、细胞分裂素、赤霉素等）来发挥作 用。例如，赤霉菌（如藤仓赤霉菌、菜豆根瘤菌、固氮螺菌等）能产生赤霉素， 能促进种子萌发、植株生长、提早开花结果。微生物农药最大的优势在于能克服化学农药对生态环境的污

40、染和减少农产 品中农药残留，同时能有效提高农产品的品质及所获得的经济收益。正是基于它所具有的这一系列优势，许多欧美发达国家都将微生物农药的研究和应用作为目 前所推行的 生态农业计划”的核心内容。近年来，美国、澳大利亚和巴西等国在 推广应用微生物农药上发展迅速，并引领着微生物农药新产品的研究与开发； 美 国环境保护局（EPA）已经注册了控制根系细菌和真菌病害、冰核细菌霜害和害 虫的11个种的195个细菌菌株，注册了 6种控制杂草、植物病害和害虫幼虫的 真菌。我国微生物农药产业的健康发展对于实现农业可持续发展和农业现代化， 以及保障人民的生命健康和保护生态环境都十分重要。因此，有必要加快微生物农药

41、的研制、产业化和推广应用进程，实现农作物重大病虫害可持续控制， 减少 农产品农药残留及对生态环境的污染，促进生态农业的发展。用作肥料的活菌制剂由于长期使用化学肥料而在环保等方面产生了一系列问题，促使人们给予生 物肥料(尤其是微生物肥料)更多的关注，微生物肥料在减少化学肥料使用量、 控制有机废弃物污染、改善生态环境、提高农产品品质等方面均能发挥重要作用。微生物肥料白研究始于19世纪80年代根瘤菌固氮功能的发现，1888年荷 兰学者Martinus Beijerinck首先获得了根瘤菌的纯培养51, 1889年波兰人Prazmowski用根瘤菌纯培养接种豆科植物形成了根瘤，1895年Nobbe和H

42、iltner成功开发了纯培养的根瘤菌制剂“ Nitragin”产品，标志了微生物肥料走出实验 室进入商业化应用52。1937年Azotobacter接种剂 “Azotogenft苏联推广应用， 据报道能显著提高作物的产量，从此产生了自生固氮菌肥料。此后苏联又推出了 具有解磷活性的巨大芽抱杆菌 (Bacillus megaterium varphosphaticum)活菌制剂， 其能够提高土壤磷的有效性，从此开始了磷细菌和钾细菌肥料的广泛研究与应 用。Dobereiner实验室在研究应用巴西固氮螺菌(Azospir川um brasilense)的基 础上，于1976年提出了联合共生固氮的概念，并

43、将多种联合固氮菌作为肥料用 于作物生产530截止目前已有大量的肥料菌剂在不同的国家登记应用，其相关 研究和生产应用也在不断深入，Wilson等人统计报道，仅1992年全球就有约300 项研究是关于微生物肥料在土壤和作物上的应用。目前，微生物肥料的开发研究主要集中在以下几个方面：固氮机理分子水平的研究，以提高微生物的固氮水平；以分子生物学技术改造共生细菌，提高其生存能力，最终可促进根瘤的形成；探索微生物肥料中不同菌株之间的相互 关系，以获得最佳的菌株配伍；完善微生物肥料的产品标准， 加强对微生物肥 料的质量监督和管理。我国的微生物肥料研究开发水平总体比较落后，其开发的成品多是模仿国外产品，或利用

44、已商业化的菌种复配而成，但近年来在新菌种筛 选、菌剂复配及应用效果评价等方面开展了较多研究，也取得了一定的成果。有研究人员计算，若使我国微生物肥料的使用量占到化肥使用量的3%,则粮食产量可增加50亿千克以上(目前我国微生物肥料的用量约300多万吨，不足化肥量的0.5%);若中国种植的800万公顷大豆能采用根瘤菌接种固氮技术， 则每年可以节省5000万美元以上的肥料投入。另外，由于大量施用化肥所带来的土壤退化、水污染等一系列负面影响，也为微生物肥料的应用与发展带来了机 遇。其它农用活菌制剂兽药用活菌制剂最初多是从人用微生态活菌制剂中引入，或直接使用，或经改良后使用，主要用于预防和治疗腹泻、肠炎、

45、消化不良等消化道疾病。目前最 常见的是使用蜡样芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、乳酸杆菌等菌种的活菌制剂治疗畜 禽的消化道疾病以及水产养殖上的感染性疾病。例如，康白等人分离的蜡样芽抱杆菌(DM423)的活菌制剂一促菌生，兽医上用来对畜禽的肠炎腹泻等疾病进行治 疗，获得了满意的疗效54。王平等报道，在仔猪出生时即投喂乳酸杆菌 TPY-211 口服液，对防治7日龄内仔猪腹3f有明显效果550薛俊龙等证实市售禽用“益生 素”(主要益生菌为嗜酸乳杆菌、粪链球菌、酵母菌、枯草芽抱杆菌等)能有效 避免雏鸡感染鸡白痢沙门氏杆菌，显著提高雏鸡成活率56; KozasaT 1986年首次 将活菌制剂应用于水产养殖领域的疾

46、病防治，利用东洋芽抱杆菌(Bacillus toyoi)处理鳗鲫，降低了由爱德华菌引起的死亡率57o活菌制剂除了被用于防治动物疾病外，有些也被用作动物的饲料或添加剂。 Kyriakis等研究表明，日粮中添加地衣芽抱杆菌，可显著提高仔猪平均重量和日 均增重量，饲料采集量相比对照组提高26.8%,饲料转化率也得到改善58; Guerra 等研究发现乳酸菌制剂能够显著提高断奶仔猪的平均日增重，并且对于控制肠道中总大肠杆菌数量具有明显效果590这类饲用活菌制剂在我国国内的起步较晚， 成熟产品不多，国际上的知名产品主要有美国Probiottics公司的Protoxin,彳惠国Chevita 公司的 Suiferm Special,以及泰国的 Toyacerin 和加拿大的 Prosuis Paste 等，其主要功效大多为促进畜禽生长发育，提高饲料转化率，改善畜禽健康状况， 增