现代生物饵料培养学

1、绪 论第一节 生物饵料培养学的基本概念一、生物饵料培养学的定义饲料：饲养动物（禽、畜等）的食物。饵料：鱼、虾、贝等水产动物的食物。饵料生物: 是指在海洋、江河、湖泊等水域中生活的各种可供水产动物食用的水生动、植物（微藻microalgae、轮虫rotifer、卤虫brine shrimp、桡足类copepod等）。生物饵料（live food）: 是经过筛选的优质饵料生物，进行人工培养后投喂给养殖对象食用的活的饵料。微粒饲料（microdiet）：将不同营养物质加工，配合，制成相应生物饵料大小的颗粒饲料产品，称微粒饲料。生物饵料培养学：是研究生物饵料的筛选、培养及其营养价值评价的一门应用性科学

2、。主要任务：筛选优良生物饵料品种。提高生物饵料培养水平。研究和评价生物饵料的营养价值。二、生物饵料培养学的主要研究内容（一）生物饵料的筛选筛选原则：1大小适口：应选择能够满足和适应不同养殖对象及同一养殖对象不同发育阶段摄食所需的生物饵料。不同的动物及同种动物的不同发育阶段对饵料大小的要求不同。扇贝幼虫的早期阶段：等鞭金藻等个体小、游动缓慢的种类。扇贝幼虫的后期阶段：扁藻、塔胞藻等个体较大，游动活泼的种类。2方便养殖动物摄食：生物饵料在水中的运动速度与在水层中的分布情况，应便于养殖动物摄食。微藻、轮虫：运动能力较弱开口饵料卤虫无节幼体、枝角类、桡足类：游动较快扇贝幼虫：浮游生活，选用浮游生物饵料

3、。鲍鱼苗（稚鲍）：底栖生活，选用底栖生物饵料。3营养丰富容易被养殖动物消化吸收，具有较高的营养价值，使养殖动物生长迅速。营养价值：（1）测定营养成分：蛋白质（protein ），脂肪（ lipid ）碳水化合物（carbohydrate），维生素（vitamins）脂肪酸（fatty acid）， 特别是高度不饱和脂肪酸 High unsaturated fatty acid（HUFA）气相色谱-质谱仪（GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometer）：测脂肪酸傅立叶变换红外显微镜（FT-IR spectroscopy - Fourier transfor

4、m infrared spectroscopy）：可测蛋白质、脂肪、碳水化合物等的相对含量 （2）投喂效果实验： 体长、体重增加的快慢等。4. 生物饵料及其代谢产物无毒或毒性很小，使养殖动物具有较高的成活率。例如微囊藻和螺旋藻。 5生物饵料的生活史短，生殖力强。例如球等鞭金藻。6对环境的适应性（对温度、盐度、光照强度等）和抗逆性强，易于大量培养(large-scale culture)，培养达到的密度大，产量高。例如轮虫。 （二）生物饵料的大量培养技术研究生物饵料的基本生物学资料：形态、分类、分布种群的生理生态特证、生殖力、抗逆性大量培养的技术性指标（三）生物饵料的营养价值评价：筛选、定向培养

5、、营养强化第二节 生物饵料在水产养殖中的应用贝类育苗：微藻，常用硅藻类、金藻类和绿藻类鲍鱼（底栖种类）育苗：底栖硅藻甲壳类（虾、蟹等）育苗：微藻、轮虫、卤虫的无节幼体、桡足类等鱼类育苗：微藻、轮虫、卤虫的无节幼体、桡足类、枝角类、糠虾类等海参育苗：角毛藻、盐藻（杜氏藻）、底栖硅藻等。第三节 生物饵料培养未来发展方向一、生物饵料培养的中长期目标生物饵料规模化、稳定性、高密度培养技术饵料的营养强化新型生物饵料的筛选富含HUFA(High Unsaturated Fatty Acid)微藻品系的筛选生物饵料携带细菌数量的控制生物饵料在自然条件下的人工培养和增殖，人工生态育苗生物饵料的浓缩和保存二、生

6、物饵料培养的终极目标苗种的饵料问题：水产苗种规模化和产业化的主要制约因素微粒饲料的完全取代：全价微粒饲料目前存在的问题：要求的粒径小，加工工艺复杂，微粒饲料的均质性难以保证营养成分在水中的稳定性难以保证微粒饲料在水中的悬浮性难以保证对鱼虾蟹幼体的营养需求了解较少。第一章 微藻培养第一节 概 述一、微藻培养的发展概况微藻（microalgae）: 指那些单细胞或数个细胞组成的微小藻类。16世纪：墨西哥人将螺旋藻晒干制成食品。19世纪末：开始进行微藻的培养，小球藻、栅藻等，作为植物生理学的材料。20世纪初：开始进行作为水产饵料的微藻培养。第二次世界大战后：开展小球藻培养研究，代替粮食和饲料。20世

7、纪80年代末：开始进行微藻的异养培养（利用工厂的发酵设备）。我国的微藻事业：20世纪50年代后期：开展大规模小球藻培养。70年代后期：将螺旋藻引入我国。目前大规模培养的种类：螺旋藻、盐藻等。微藻产业发展较快的国家：以色列、日本、美国等。培养的主要种类：螺旋藻、盐藻、小球藻等。目前国内外水产养殖中，常用的微藻隶属于7个门，几十个属。2、 微藻的应用概述1 作为人类的营养食品和保健食品（螺旋藻、小球藻等）2 作为药源生物资源（抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、抗心脑血管疾病）3 作为人类食品添加剂(调色、调味)4 作为水产动物的饵料（鲜活微藻、贮存微藻）5 用富含EPA/DHA的微藻强化轮虫、卤虫6 作为水

8、产动物饵料添加剂和禽、畜饲料添加剂7 利用微藻提取EPA和DHA、色素、甘油等生物活性物质8 废水处理9 植物生长调节剂10 作为生物柴油的原料（高效能源微藻）11 利用微藻减排CO2。12 微藻的危害(微藻毒素、水华、赤潮等)第二节 微藻的培养种类概述 硅藻类：三角褐指藻、小新月菱形藻、牟氏角毛藻、纤细角毛藻、中肋骨条藻 绿藻类：亚心形扁藻、塔胞藻、盐藻、雨生红球藻、小球藻、微绿球藻 金藻类：球等鞭金藻、湛江等鞭藻、绿色巴夫藻 黄藻类：异胶藻 蓝藻类：钝顶螺旋藻一、三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum)1.分类地位：硅藻门/羽纹硅藻纲/褐指藻目/褐指藻科/褐指藻属

9、2.形态特征： 细胞梭形、三角形、卵形。 梭形细胞:长约20微米。 三出放射形细胞:臂长皆为6-8微米。 卵形细胞较少见，在平板培养基上培养可出现卵形细胞。3.繁殖方式：无性的二分裂繁殖。因无硅质壳，分裂时细胞不会缩小。 4.生态条件：温度：生长适温5-25，最适温度10-20，超过25时停止生长，最终大量死亡。盐度：生存盐度9-92，最适盐度25-32。光照强度：适应光照强度范围1000-8000lx，最适范围3000-5000lx，切忌阳光直射。酸碱度：适应的pH范围为7-10，最适pH 7.5-8.5 。 目前，三角褐指藻有多个品系(strains)，如MACC/B114 MACC/B1

10、18 MACC/B221 MACC/B229 UTEX640 2038 品系不同，细胞的形态及营养成分都有差异，应用时可根据需要选择合适的品系。 MACC: Microalgae Culture Center in Ocean University of China B: Bacillariophyta (硅藻门) UTEX：The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin (USA)二、小新月菱形藻（Nitzschia closterium f.minutissima）1.分类地位：硅藻门/羽纹硅藻纲/管

11、壳缝目/菱形藻科/菱形藻属2.形态特征： 小新月菱形藻俗称“小硅藻”。 单细胞,细胞中央膨大,呈纺锤形,两端渐尖。 体长12-23微米，宽2-3微米。 细胞中央具一细胞核。 色素体2片，黄褐色，位于细胞中央细胞核两侧。3.繁殖方式：无性的二分裂繁殖。4.生态条件：温度：生长适温528 ，最适温度1520 ，超过28时停止生长，最终大量死亡。盐度：生存盐度18-61.5，最适生长盐度25-32。光照强度：最适范围3000-8000lx，切忌阳光直射。酸碱度：适应的pH范围为7-10，最适pH 7.5-8.5 。 三角褐指藻和小新月菱形藻：培养较早，培养方法比较成熟。具有生长快、浓度高、容易培养、

12、营养丰富的特点，是贝类和虾类幼体的良好饵料。低温种（low temperature-tolerance species）, 25以上生长即受到严重抑制。三、牟氏角毛藻 （Chaetoceros muelleri）1.分类地位：硅藻门/中心硅藻纲/盒形藻目/角毛藻科/角毛藻属2.形态特征： 细胞：短圆柱形，壳面大都是椭圆形。壳环面呈长方形至四角形。 细胞小型，多数呈单细胞，有时2-3个组成群体。 角毛细长，约20-30微米。 色素体1个，呈片状，黄褐色3.繁殖方式：无性的二分裂繁殖。当环境不良时可形成休眠孢子，此外，也能形成复大胞子。4.生态条件：温度：高温种类，生长适温10-40 ，最适温度2

13、5-35。盐度：半咸水种类，适宜盐度2.56-35，最适盐度22-26。光照强度：适宜光照强度范围2000-15000lx，最适范围6000-10000lx。酸碱度：适应的pH范围为6.4-9.5，最适pH 8.0-8.9 。 四、纤细角毛藻（Chaetoceros gracilis）1.分类地位：硅藻门/中心硅藻纲/盒形藻目/角毛藻科/角毛藻属2.形态特征： 细胞小型，多呈单细胞，有时23个细胞组成链状，大小574微米 (角毛长3037微米)。 本种是1988年从美国Solar Energy Institute引进的，并已在国内育苗场推广应用。3.繁殖方式：一般是无性二分裂繁殖，在不良环境下

14、可形成休眠孢子。 4.生态条件：同牟氏角毛藻。高温种类。牟氏角毛藻和纤细角毛藻可以作为海参(sea cucumber)、甲壳类(crustaceans) 等幼体的饵料。耐高温种类 (high temperature-tolerance species) ，适合夏季培养。五、中肋骨条藻（Skeletonema costatum）1.分类地位：硅藻门/中心硅藻纲/圆筛藻目/骨条藻科/骨条藻属2.形态特征： 细胞为透镜形或圆柱形，直径为6-7微米。 壳面圆而鼓起，着生一圈细长的刺，与临细胞的对应刺组成长链。刺的数目为8-30条。 色素体通常2个，位于壳面各向一面弯曲。3.繁殖方式：一般为无性的二分裂

15、繁殖。复大孢子是经过卵配形成的。复大孢子的形成与温度、盐度和光照有关。 4.生态条件：温度：生长适温1034 ，最适温度2030 。盐度：生存盐度7-50，最适生长盐度25-30。光照强度：适应范围500-10000lx。酸碱度：最适pH 7.5-8.5。 中肋骨条藻： 广温广盐种类，是对虾幼体、缢蛏、牡蛎等的优良饵料。六、亚心形扁藻（Platymonas subcordiformis）1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/团藻目/衣藻科/扁藻属国外多使用另一分类系统，该系统根据细胞前端的凹陷独立为一纲，即：绿枝藻纲 Prasinophyceae四片藻属 Tetraselmis因此扁藻属Platymo

16、nas与四片藻属Tetraselmis 为同属异名。扁藻的形态特征：2.形态特征： 单细胞，正面观为卵形、椭圆形或心形。 具4条等长的顶生鞭毛(flagella) ，约等于或略短于体长。 色素体大，呈杯状(cup-shaped) ，内有一个蛋白核 (pyrenoid) 。 眼点(eyespot) 1个，细胞核1个。我国作为饵料培养的种类还有青岛大扁藻，比亚心形扁藻大。3.繁殖方式：无性繁殖，细胞纵分裂成两个（少数情况下四个）子细胞。当环境不良时，能形成休眠孢子，椭圆形，一个或两个。4.生态条件：温度：生长适温730 ，最适温度2028。对低温的适应能力强，对高温的适应能力差。盐度：生存盐度8-

17、80，最适生长盐度30-40。光照强度：适应范围1000-20000lx，最适范围5000-10000lx。酸碱度：适应的pH范围为6-9，最适pH 7.5-8.5。 七、塔胞藻 (Pyramidomonas sp.）1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/团藻目/盐藻科/塔胞藻属2.形态特征： 单细胞，细胞呈倒卵形，少数为半球形。 细胞前端具一圆锥形凹陷，由凹陷中央向前伸出4条鞭毛。 色素体杯状，基部有一个蛋白核。 细胞单核，位于细胞的中央偏前端。 细胞裸露，不具细胞壁 (Cell wall)。3.繁殖方式：主要为纵分裂繁殖。 4.生态条件：同扁藻。扁藻和塔胞藻适应力较强，生长繁殖迅速，较容易培养，是

18、亲贝和许多贝类后期幼虫的良好饵料。八、盐藻（Dunaliella spp.） 1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/团藻目/盐藻科/盐藻属（杜氏藻属）2.形态特征： 单细胞，无细胞壁 ( no cell wall) ，体形变化大，通常为梨形、椭圆形等。 具两条等长顶生鞭毛 (two equal flagella) ，比藻体约长1/3。 色素体杯状，内有一个蛋白核。 一般细胞长12-21微米，宽约6-13微米。3.繁殖方式：主要为无性纵分裂繁殖。在环境不良时进行有性生殖。 4.生态条件：温度：最适温度2035 。盐度：最适盐度60-70。光照强度：最适范围4000-8000lx，切忌阳光直射。酸碱度：对

19、pH适应性强，可在高pH的碱性条件下生长，最适pH 7.0-8.5 。 盐藻细胞内能储存大量经济价值较高的甘油和-胡萝卜素等有机化合物，可通过大量培养杜氏藻提取-胡萝卜素。九、雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis)1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/团藻目/红球藻科/红球藻属2.形态特征： 单细胞，细胞为椭圆形到卵形。 细胞壁与原生质体之间有一定间距，充满胶状物质。 两条等长鞭毛，约等于体长。 环境不良时，产生厚壁孢子，积累大量的虾青素。 淡水种。3.繁殖方式：环境适宜时，游动细胞以无性繁殖方式产生2、4、8个游孢子。经一定时间的生长发育，游孢子突破孢子囊壁释放出来，成为新的

20、游动细胞。 4.生态条件：温度：生长适温2028 ，超过30时生长受到抑制。盐度：淡水种。光照强度：最适光强1500lx左右，高于2000lx则抑制其生长。酸碱度：最适pH 7.8左右。 雨生红球藻：含大量的虾青素（细胞干重的2%）是目前已知的虾青素含量最高的微藻虾青素的用途：虾青素是鲑鳟鱼饲料中必不可少的成分作为天然抗氧化剂应用于食品、医药、化妆品。十、小球藻（Chlorella spp.）1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/绿球藻目/小球藻科/小球藻属2.形态特征： 单细胞，小型，细胞直径2-12m。 细胞球形或椭圆形。 色素体一个，周生，杯状或片状。 大多数淡水生活，少数海水中生活。3.繁殖方

21、式：当细胞分裂时，原生质体分裂为2、4、8、个似亲孢子，等到母细胞壁破裂，似亲孢子就释放出来。4.生态条件：温度：生长适温1036 ，最适温度25-30 。盐度：适应盐度范围广。经驯化可在淡水及盐度为45的海水中生长繁殖。光照强度：最适范围3000-10000lx。酸碱度：适应的pH范围为5.5-8.0。 小球藻蛋白质含量丰富，可生产保健食品。在水产上，小球藻多用于培养轮虫十一、微绿球藻（Nannochloris oculata）1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/绿球藻目/绿球藻科/微绿球藻属2.形态特征： 细胞球形，直径2-4微米 。 色素体一个，淡绿色，侧生。 眼点一个，圆形，淡橘红色。 无蛋

22、白核，有淀粉粒1-3个，侧生。 细胞壁极薄，幼年细胞看不到，在-分裂之前才变明显。3.繁殖方式：二分裂繁殖，细胞分裂为2个子细胞。4.生态条件：温度：生长适温1036 ，最适温度2530。盐度：适宜盐度范围4-36。光照强度：最适光照强度为10000lx左右。 酸碱度：最适pH 7.5-8.5 。微绿球藻多用于培养轮虫十二、 球等鞭金藻（Isochrysis galbana）1.分类地位：金藻门/金藻纲/等鞭金藻科/等鞭金藻属2.形态特征： 单细胞，细胞裸露，椭圆形、卵形、球型等。 具2条等长鞭毛(two equal flagella) 色素体1-2个。 贮藏物为油滴和白糖素，白糖素位于细胞后

23、端。3.繁殖方式：主要为无性的二分裂繁殖。环境不良时形成特殊的孢囊-内生孢子。 4.生态条件：球等鞭金藻有三个常见的生态品系球等鞭金藻3011(高温品系 high temperature-tolerance species )球等鞭金藻8701(低温品系 low temperature-tolerance species )球等鞭金藻塔溪堤品系（Tahitian Isochrysis galbana），简称塔溪堤，最初从塔溪堤（南太平洋的一个岛屿）养殖水体分离筛选而得，属高温品系。十三、 湛江等鞭金藻（Isochrysis zhanjiangensis）1.分类地位：金藻门/金藻纲/等鞭金藻科

24、/等鞭金藻属2.形态特征： 多为卵形或球形，大小为6756微米。 具有两条等长的鞭毛，从细胞前端伸出。 色素体两片，侧生，金黄色。 细胞核位于两片色素体之间。 一个或几个白糖素颗粒, 位于细胞后部。3.繁殖方式：主要为无性二分裂繁殖。 4.生态条件：温度：生长适温935 ，最适温度2532 。盐度：生存盐度10-50，最适生长盐度22.7-35.8。光照强度：最适范围5000-10000lx。酸碱度：最适pH 7.5-8.5 。 球等鞭金藻和湛江等鞭金藻可以作为扇贝（scallop）、牡蛎（oyster）等多种双壳类（bivalves) 幼虫（larvae）的饵料，效果良好。大多数等鞭藻富含D

25、HA。十四、绿色巴夫藻（Pavlova viridis）1.分类地位：金藻门/金藻纲/巴夫藻属2.形态特征： 绿色巴夫藻，又称3012，是1982年从山东海阳县的海水样品中分离而得。 无细胞壁（cell wall），正面观呈圆形，侧面观为椭圆形或倒卵形。 细胞大小为6.04.84.0微米。 具2条不等长的鞭毛和1条附鞭。 色素体一个，裂成2大叶围绕着细胞。 绿色巴夫藻的群体细胞呈淡黄绿色至绿色。绿色巴夫藻可用于海湾扇贝（Bay scallop）和中国对虾育苗中，效果良好。3.繁殖方式：主要为无性二分裂繁殖。 4.生态条件：温度：生长适温1035 ，最适温度1530 。盐度：生存盐度5-80，最

26、适生长盐度10-40。光照强度：最适范围4000-10000lx。酸碱度：最适pH 7.5-8.5 。 十五、异胶藻（Heterogloea sp.）1.分类地位：黄藻门/黄藻纲/异球藻目/异胶藻属 2.形态特征：细胞长圆形或椭圆形。长45.5微米，宽2.54微米 。 色素体1个，片状侧生，占藻体大部分，呈黄绿色。 藻液颜色随着培养时间的延长从绿色变成黄色、土黄色。 可作为牡蛎(oyster)、贻贝(mussel)、菲律宾蛤仔(clam)、泥蚶(mud clam) 等幼体的饵料。3.繁殖方式：主要为无性二分裂繁殖。4.生态条件：温度：生长适温835 ，最适温度1533 。盐度：生存盐度13-3

27、2。光照强度：适应范围1000-8000lx。酸碱度：最适pH 7.5-8.2 。 十六、钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）1.分类地位：蓝藻门/蓝藻纲/颤藻目/螺旋藻属2.形态特征： 藻体淡蓝绿色，细胞圆柱形。 藻体为单列细胞组成的不分支的丝状体，丝状体外无胶质鞘。 藻丝螺旋状卷曲。 无异形胞和厚壁孢子(No heterocysts and resting spores) 。 海、淡水中均有分布。3.繁殖方式：主要为无性二分裂繁殖，有时也以藻殖段繁殖。4.生态条件： 分布广，适应能力强，最初生长于热带高温的碱水湖里，喜高温、高碱和强光。实验室长期培养藻丝易变直。 温度：生长

28、适温1540 ，最适温度3537 。 盐度：可在淡水中培养，也可驯化后在盐度为35的海水中生长。 光照强度：最适范围30000-35000lx。 酸碱度：最适pH 8.5-10.5 。 螺旋藻营养丰富、蛋白质含量高（达50%以上）容易消化、采收方便，多作为营养保健品。在水产上，螺旋藻可作为鱼、虾饲料添加剂。第三节 影响微藻生长繁殖的因子一、 光照（Light）1. 光源太阳光（主要）、人工光源（补充光源）常用的人工光源有:日光灯(fluorescent lamp)、白炽灯(incandescent lamp, not recommended)、金属卤素灯(metal halide lamp)2

29、. 光质在植物的光合作用中，光质(light spectrum)和光量(light intensity)都是重要的。光质：就是不同波长的光线，在太阳光光谱中，可分为3个主要部分，波长由短到长分别为紫外线、可见光（400-700nm）和红外线。光合有效辐射(photosynthetically active radiation PAR) ：400-700nm3. 光在藻细胞悬浮液中的穿透光线进入藻液中，由于藻细胞的吸收和散射，随着深度的增加，光照强度迅速降低。 Light intensity plays an important role, but the requirements vary g

30、reatly with the culture depth and the density of the algal culture. At higher depths and cell concentrations the light intensity must be increased to penetrate through the culture (e.g. 1000lx is suitable for small flasks, 5000-10000lx is required for larger volumes). 4.光强光量：是指光线总强度而言，称光照强度。光照强度用照度计

31、(lx light meter)测定，其单位是勒克司（lx）。在植物生理研究领域及国外：光照强度常用mmol photons.m-2.s-1表示, 即每秒钟在每平方米面积上接受的微摩尔量子光量。用量子辐射计、双辐射计、光量子计等测量。1 mmol photons.m-2.s-1 50lx适光范围：是指生物能进行正常生长繁殖的光照强度范围。饱和光照强度：光合作用或细胞分裂速率达到最大值时的光照强度称为最适光照强度或称饱和光照强度。补偿光照强度：适光范围的低限，称为补偿光照强度（光补偿点）。在这样的光照强度下，藻类呼吸作用消耗的氧气量与光合作用放出的氧气量恰好相等，细胞只能维持基础代谢不能生长。5

32、. 光周期（Photoperiod）光照周期12L:12D，光暗周期14 h:10 h，16:08 light: dark cycle饱和白昼现象：在较强的光照强度和较长的日照时间下，日照时间虽然增加，生长率并不再增加，这种现象称为饱和白昼现象。光抑制（photoinhibition）: 过强和过长时间的光照会引起光抑制，使叶绿素发生光解而褪色。6.间歇光的作用：用强光间歇照射时，和间歇照射时间总和相等的连续照射相比较，同化效果要大很多。二、温度（Temperature）适温范围：是指微藻能进行正常生长繁殖的温度范围。最适温度范围：是指微藻生长繁殖最快、生命活动最旺盛的温度范围。 最低适应温度

33、（低限） 最高适应温度（高限） 认为高温对生物体的破坏是化学性的，低温对生物体的破坏是机械性的，微藻对低温的忍耐性较强，可利用低温对微藻进行保种。 若温度超出最低适温和最高适温，生物的生命活动就要受到影响。例如：骨条藻的适温范围为832，最适温度范围2025，适温低限和适温高限分别为8和32。 常见低温种类：三角褐指藻、小新月菱形藻等。 常见高温种类：角毛藻、湛江等鞭藻、等鞭藻3011等。 The optimal temperature for phytoplankton cultures is generally between 20 and 24, although this may va

34、ry with the species and strains cultured. Most commonly cultured microalgal species tolerate temperatures between 16 and 27. Temperatures lower than 16 will slow down growth, whereas those higher than 35 are lethal(有害的、致命的) for a number of species. 三、盐度（ Salinity ）水是一种富含各种盐类的溶液，地球上不同水域的水，含盐量的差别很大。淡水

35、水域：0.01-0.5；半咸水：0.5-16.0；海水水域：16.7-47.0；超盐水域：47.0以上大洋水和径流降水较少的海区：35左右。盐度单位：ppt (parts per thousand)海水盐度对微藻的影响也有适盐范围、最适盐度范围、适盐高限和适盐低限等。以骨条藻为例，其适盐范围为750，最适盐度范围为2530，适盐低限和适盐高限分别为7和50 。四、营养盐（Nutrients）大量元素（macronutrients） 微量元素（trace metals）维生素（vitamins）络合物（Chelators ）土壤抽取液（soil extract）微藻生长必需的每一种元素浓度： 最

36、低量（低限）：低于最低限，对生长繁殖起抑制作用 最高量（高限）：超出高限，对微藻产生毒害作用影响其生长繁殖，甚至使微藻死亡。危害比前者更为严重。 需要特别注意的是，微量元素的适量和致毒量之间的幅度很小。 Many reactive micronutrient metals, such as copper and zinc, are toxic at elevated concentrations. For these metals, optimal growth occurs at intermediate concentrations, below which growth rate is

37、limited and above which growth is inhibited. 五、二氧化碳（carbon dioxide）光合作用的反应式：CO2+H2O（CH2O）+ O2培养微藻的水环境中，二氧化碳呈现各种形式：游离的二氧化碳（CO2）、碳酸氢盐（HCO3）、碳酸盐（CO32）、碳酸（H2CO3）各种存在形式在水中可互相转化。反应式为：CO2+H2OH2CO3H+HCO3 2H+CO32培养微藻过程中主要采用以下措施补充二氧化碳：（1） 通过搅拌增加水与空气的接触面，使空气中的二氧化碳溶于培养液中。（2） 通入普通空气（含二氧化碳0.03%），通过微小气泡增加水和空气的接触面，

38、使空气中的二氧化碳溶入培养液中。 （3） 通入含1%5%二氧化碳的混合空气，效果好，但要防止过量致毒。（4） 向培养液中添加碳酸氢钠（容易引起沉淀）。 六、pH（酸碱度Acidity）： 人工海水：一般调整为8.2左右七、生物因子（Biotic factors）促进生长：某些微藻（如日本星杆藻、骨条藻等）必须在有细菌存在的条件下才能生长良好。抑制生长：吞食、寄生和抗生等。第四节 微藻的培养液Concentrations of cells in phytoplankton cultures are generally higher than those found in nature. Alga

39、l cultures must therefore be enriched with nutrients to make up for the deficiencies in the seawater. 一、培养液的成分1大量元素（ macronutrients）氮（N）、磷（P）、铁（Fe）、钾（K）、镁（Mg）、硫（S）、钙（Ca）、硅（Si）氮（N）硝酸钠和硝酸钾；磷（P）磷酸二氢钾，磷酸二氢钠；铁（Fe）柠檬酸铁；硅（Si）硅酸钠。Redfield 比值N:P16:1若N:P30，则P为限制性元素； N:P5，则N为限制性元素大量元素母液（Stock solutions of macr

40、onutrients） Separate stock solutions of each macronutrient should be prepared at a concentration of 1000-fold of the final concentration so as to use 1 ml per 1000 ml of medium. Phosphate stock solutions should never be stored in the polyethylene（聚乙烯）bottles because phosphate ions are strongly adsor

41、bed onto polyethylene. Silicate stock solutions should be stored in nonvitreous（非玻化的）material (e.g., Teflon-lined（聚四氟乙烯）, polyethylene, or polycarbonate（聚碳酸酯）because of dissolution of silicic acid from glass vessels. If silica-free experiment is required, none of the stock solutions can be held in g

42、lass.2. 微量元素（Trace elements）微藻培养液中常用的微量元素有以下几种，其用量一般为0.5-50ppb。锌（Zn）-硫酸锌（ZnSO4.4H2O）； 铜（Cu）-硫酸铜（CuSO4.5H2O）； 锰（Mn）-氯化锰（MnCl2.4H2O）；钼（Mo）-钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）；钴（Co）-氯化钴（CoCl2.6H2O） 3. 维生素（Vitamins） Three vitaminsvitamin B12，B1 and biotin（生物素，维生素H）are usually used for culture of microalgae. Many algae ne

43、ed only one or two of the vitamins, but there seems to be no harm caused by adding a nonessential. The general order of vitamin requirements for algae is vitamin B12 B1 biotin. Trace metals and vitamins are usually prepared as stock solutions of high concentrations to permit weighing of easonable am

44、ounts.4. 土壤抽取液（Soil extract） (p85) In the simplest media, only nitrogen and phosphorus and soil extract are added to NW (Natural seawater). Erdschreiber is an example of such a medium, and it has been used successfully to grow various planktonic and benthic species. Some culture collections still us

45、e soil extract to maintain some species (Plymouth), but it is seldom used in physiological experiments when a defined medium is preferred.5. 络合物（Chelators）: 乙二胺四乙酸（EDTA）或其钠盐Na2EDTA EDTA or Na2EDTA are added to keep iron (Fe) in solution and to keep free ionic metal（金属离子）concentrations at nontoxic le

46、vels. However, EDTA has been noted to inhibit the growth of some oceanic species. For routine use in culture media, nitrilotriacetic acid (NTA,次氮基三乙酸) and citric acid(柠檬酸)are less effective than EDTA, but they are used sometimes in experimental work.二、常用微藻培养液配方F/2培养基（F/2 Medium）(Guillard and Ryther

47、1962, Guillard 1975) This is a common and widely used general enriched seawater medium designed for growing coastal marine algae, especially diatoms. The concentration of the original formulation, termed “f Medium” (Guillard and Ryther 1962), has been reduced by half (Guillard 1975). If silicate is

48、not required, omit to reduce precipitation(沉淀).F/2 Medium（前：国内教材p79；后：Algal culturing techniques）硝酸钠（NaNO3)74.8mg（75mg）磷酸二氢钠（NaH2PO4）4.4mg（5mg）硅酸钠（Na2SiO3.9H2O）8.416.7mg（30mg） F/2微量元素溶液1ml F/2维生素溶液1ml 消毒海水1000ml附I：F/2微量元素溶液配方（前：国内教材p79；后：Algal culturing techniques）柠檬酸铁（FeC6H5O7.5H2O）3.9g乙二铵四乙酸钠（Na2E

49、DTA）4.35g氯化锰（MnCl2.4H2O）178mg（180mg）硫酸锌（ZnSO4.4H2O）23mg氯化钴（CoCl2.6H2O）12mg（10mg） 硫酸铜（CuSO4.5H2O）10mg（9.8mg） 钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）7.3mg（6.3mg） 纯水（dH2O）1000ml 附II：F/2维生素溶液配方维生素B120.5mg 维生素H (生物素)0.5mg 维生素B1100mg 纯水1000ml 维生素B1 1支2ml, 含维生素B1 100mg维生素B12 1支1ml, 含维生素B12 0.5mg 生产上用硅藻培养液配方硝酸钠（NaNO3）50g-80g（或15

50、g硝酸钠+20g尿素）磷酸二氢钠或钾（NaH2PO4）4-8g硅酸钠（Na2SiO3） 4.5-5g柠檬酸铁（FeC6H5O7）0.5g-1g消毒海水1m3适合生产上培养三角褐指藻、小新月菱形藻和角毛藻。 生产上用金藻培养液配方硝酸钠（NaNO3）50g-80g（或30g硝酸钠+15g尿素）磷酸二氢钠或钾（NaH2PO4）4-8g柠檬酸铁（FeC6H5O7）0.5g-1g维生素B1100mg维生素B120.5mg消毒海水1m3适合生产上培养等鞭金藻3011、8701和湛江等鞭金藻等。 生产上用绿藻培养液配方：硝酸钠（NaNO3）60g尿素18g磷酸二氢钠或钾（NaH2PO4）4-8g柠檬酸铁（

51、FeC6H5O7）0.5g-1g消毒海水1m3适合生产上培养扁藻、塔胞藻等康威培养液三、培养液的配制实验室及生产上培养一级藻种用的营养盐：用试剂级（reagent grade chemicals），将各种元素分别配成母液(Concentrated solutions)，用时吸取一定量即可。生产上大规模培养的营养盐：用农用肥料(agricultural fertilizers)或工业肥料。配成母液，用时取一定量即可。按配方称取，加消毒水溶化后倒入池中。培养液灭菌或消毒：主要元素的母液及微量元素母液：高压灭菌或用滤膜过滤（实验室）； 煮沸消毒（生产上）维生素溶液：对容器和水分别进行消毒或灭菌滤膜过

52、滤。Vitamins Vitamins are normally added aseptically (无菌的) (through a 0.2mm filter) after the medium has been autoclaved. Vitamins maintain maximum potency if they are filter sterilized (0.2-m filtration) rather than autoclaved. Autoclaving may cause decomposition（分解）of some vitamins, but it is though

53、t that some algae may be able to use some of these decomposition products. Vitamin stocks may be frozen for long periods without noticeable degradation（降级、退化）, and the stocks may be refrozen after each use. These three vitamin stocks may be combined into a single working solution for a 1,000-fold di

54、lution.第五节 微藻的培养方式与设施一、微藻培养方式1.纯培养、单种培养、混合培养（按培养的纯度来划分的）纯培养（axenic culture or bacteria-free culture）：即无菌培养,是指排除了细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。纯培养要求有无菌室、超净工作台等设备条件，容器、工具、培养液等必须严格灭菌。单种培养（unialgal culture）： 在培养过程中不排除细菌存在的一种培养方式，称为单种培养。混合培养 (mixed culture)：各藻种混杂在一起的培养方式。例如水样采集后单一藻种分离前的预备培养。2. 封闭式培养与开放式培养（按照藻液与外界的接

55、触程度划分的）封闭式培养（closed culture）；开放式培养（open culture）封闭式培养：三角烧瓶、细口瓶、矿泉水桶、塑料薄膜袋、白色塑料桶（大白桶）、光生物反应器等。开放式培养：以水泥池开放式培养为主。3. 一次培养、连续培养和半连续培养（按采收方式划分的）一次培养（Batch culture）：在一定的容器中，配成培养液，把少量的藻种接种进去，然后在适宜于藻类生长的环境条件下培养，经过一定时间（5-7天），待藻液达到一定的密度后，便一次性采收或作进一步扩大培养。半连续培养（Semi-continuous culture）：是指在一次培养的基础上，当藻类细胞达到一定密度后，每天收获一部分浓藻液，并加入新的