流式细胞术在微生物快速检测领域的研究进展-

1、2010年第3期9月出版摘要概述了流式细胞术的发展历史、工作原理及其在微生物快速检测方面的应用。关键词流式细胞术;微生物;快速检测Abstract The development history,detecting princi-ple,and its application of Flow Cytometry (FCM in rapid detecting microorganisms were reviewed.keywords flow cytometry ;microorganisms ;rapid detection随着市场经济的快速发展和生活水平的提高,特别是加入WTO 后,消费者

2、对食品安全更加关注,食品安全与食品贸易的关系更为密切,提高我国食品安全水平的要求越来越迫切。为确保食品安全与食品贸易,降低细菌、真菌等微生物对食品安全和口味的影响,需要大力加强食品检验的力度。于是,ATP 荧光法、纸片法、疏水栅格滤膜法、流式细胞术等快速检测方法被采纳应用到微生物检测行业,其中流式细胞术是一门综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、免疫学、激光和计算机等多门学科和技术性的先进方法。流式细胞术(Flow Cytometry ,FCM 是一种在功能水平上对单个细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。他能高速分析上万个细胞,并能同时测量细胞的物理或化学性质,如粒子的大小、体积

3、、内部结构、DNA 、RNA 、蛋白质、抗原等,进行多信息分析。他集电子技术、计算机技术、激光技术、流式理论于一体,被誉为实验室里的“CT ”。如今,他正成功的运用于免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学、病理学、放射生物学等,并在其中交叉渗透,逐渐形成了独立的学科分支。1FCM 的发展历史1930年,Casperrsson 和Thorell 开始致力于细胞的计数。1934年,Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人,他试图用光电仪记录流过1根毛细管的细胞数量。1936年,Caspersson 等引入显微光度术。1940年,Coons 提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白。194

4、7年,Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器。1949年,Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利。1950年,Caspersson 用显微分光光度计在紫外(UV 和可见光光谱区检测细胞。1953年,Croslannd2Taylor 应用分层鞘流原理,成功地设计红细胞光学自动计数器。1953年,Parker 和Hutcheon 描述一种全血细胞计数器装置,成为流式细胞仪的雏形。1954年,Beirne 和Hutchcon 发明光电粒子计数器。1959年,B 型Coulter 计数器问世;1965年,Kamemtsky 等提出两个设想:用分光光度计定量细胞成分;结合测量

5、值对细胞进行分类。1967年,Kamemtsky 和Melamed 在Moldaven 的方法基础上提出细胞分选的方法。1969年,Van Dilla Fulwyler 及其同事们在LosALmos ,NM (即现在的National Flow Cytometry Resource Labs 发明第一台荧光检测细胞计。1972年,Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型,能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。1975年,Kochler 和Milstein 提出单克隆抗体技术,为细胞研究中大量的特异性免疫试剂的应用奠定基础。张峻峰*刘道亮赵占民孙晓霞胡连霞(河北出入境检验

6、检疫局,石家庄050050流式细胞术在微生物快速检测领域的研究进展ZHANG Jun-feng *LIU Dao-liangZHAO Zhan-minSUN Xiao-xiaHU Lian-xia(Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ,Shijiazhuang 050050,China*张俊峰,男,1981年出生,2004年毕业于浙江大学生物技术专业,工程师。收稿日期:2010-06-19食品工程FOOD ENGINEERINGResearch development on flow cytometry in the rapid

7、detection of microorganisms192010年第3期9月出版2流式细胞仪的工作原理流式细胞仪主要由流动室及液流驱动系统、激光光源及光束形成系统、光学系统、信号检测与存储、显示分析系统、细胞分选系统5个部分组成。待测细胞被制成单细胞悬液,经不同的荧光染料染色后加入样品管,在气压推动下,进入流动室,流动室内的鞘液包绕着样品。此时,细胞在鞘液的约束下单行排列,依次通过检测区,被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射,产生散射光和荧光信号。散射光分为前向角散射(Forward Scatter,FS和侧向角散射或90°散射(Side Scatter, SS。前者主要反映被测

8、细胞的大小,后者主要反映其胞质、胞膜、核膜的折射等以及细胞内颗粒的性状。光信号通过波长选择通透性滤片后,经光电倍增管接受转为电信号,再经数/模转换器转换为可被计算机识别的数学信号,以一维直方图或二维位图及数据表或三维图形显示出。流式细胞仪具有高分辨能力,主要表现在五个方面:测定细胞内的DNA的变异系数最小,一般为1%2%;正确分辨二倍体、四倍体、近二倍体和非整倍体,可用于细胞周期分析;利用特配的激光荧光染料进行蛋白质、核酸染色及荧光分析,可以敏感的鉴别细胞上荧光量的差异;能够选择地对某个细胞群进行分析;尽管对单细胞悬液植被要求严格、操作复杂,但检测客观,总分析数多,统计结论可靠。3FCM在微生

9、物快速检测中的应用流式细胞术最初主要应用于科学研究和临床检验,在微生物学方面的应用则发展相对较晚。近20年来,国内外专家学者使用FCM在微生物学上做了不少的研究和应用工作,已经成为高水平病原微生物研究中不可缺少的技术,可用于微生物基因组及功能基因组学、生理生化学、临床微生物学、抗感染免疫学、药物学等领域。实际上,微生物学,尤其是细菌学当前面临的一些问题,特别是需要对大数量细菌进行逐个的快速多参数精确测量时,流式细胞术很适合解决此类问题。已发表的论文多数是针对酵母菌和各类细菌的测量与分析。酵母菌的测量在技术上比较简单,他自身体积大,其DNA 含量约为人类二倍体细胞DNA含量的1/200。在工业中

10、,流式细胞术可用于快速微生物鉴定,如对饮用水及原油中的微生物学鉴定与控制。因此,流式细胞术在液态商品的微生物检测方面的应用越来越受到人们的关注。近年来,FCM与荧光染料的联合运用可判断细菌的活力和功能状态,由于检测速度快,周期短,已经被应用于食品加工业、化妆品加工业、制药业和水质监测等行业。3.1在食品加工业中的应用3.1.1在食品发酵工业生产中的应用1990年Day首次将FCM应用于酒类酿造之后,该技术在国外被广泛运用于面包发酵、酿酒等行业。1999年Srienc对同步化酵母细胞发酵液中CO2的产量与细胞周期进行了分析,发现同步化酵母细胞数量最大时,CO2的产量最高,即细胞活性最高。在国内,

11、肖安风等利用流式细胞仪检测PI染色的毕赤酵母细胞活性。目前国内啤酒制造行业,FCM 方法主要应用于对啤酒中活细菌数量检测监测并且控制生产流程中啤酒酵母的数量。啤酒酵母的活性和数量对优化发酵和产品质量非常重要,同时死亡的酵母细胞由于细胞膜不完整而导致细胞质的流出,会对啤酒口感产生严重影响,因此快速检测啤酒中的酵母等微生物项目,便于随时了解啤酒生产流程中酵母数量的变化,并可以及时调整发酵罐中各成分的配比,对于啤酒生产有着重大意义。3.1.2在乳制品加工中的应用目前,在乳制品加工过程中,流式细胞术主要应用于生乳中微生物指标的检测和UHT奶的无菌监测。生乳(raw milk是从健康奶畜挤下的常乳,仅经

12、过冷却,可能经过过滤,但未经过任何杀菌处理。生乳中微生物数量会影响产品的质量、货架期及生产流程的安全性。用FCM法代替应用最广泛的平皿计数法,极大的缩短了检测时间,而且流式细胞术可以区分具有生命活力的细菌和已经死亡的细菌,并可以同时进行多个样品的处理,能够满足大量样品在线检测的要求。3.1.3在饮料类食品加工行业中的应用UHT奶、巴氏奶、软饮料、矿物质水、果汁及水果浓缩汁等液体饮料富含营养成分,一旦被微生物污染,极易腐败变质,因此在最终产品放行之前,对其在生产过程中进行快速实时无菌监测,使生产过程中微生物的污染得到及时有效控制。另食品工程202010年第3期9月出版张峻峰,等:流式细胞术在微生

13、物快速检测领域的研究进展外,在酸奶的生产工程中,FCM方法还被应用于检测其中添加的有益的乳酸菌的数量。3.2制药业FCM方法可以通过荧光染料标记来检测病原菌、毒素和血清抗体,因此可用于抗生素敏感性试验,并对抗生素后效应、细菌耐药的异质性等进行分析。一方面,在药物制造过程中,注射用水和纯净水的检测,需要对可见的营养细胞、微生物芽胞、酵母菌和霉菌进行间个细胞检测,FCM方法在2h 内提供结果,不需要细胞的增长,且敏感性高,而且有非常广泛的应用功能。由于能够快速、准确的提供实时的趋势分析,这使管理者对非正常结果能及时做出快速反应。另一方面,人们通常在食品中添加一些消毒防腐剂,以便更安全、更长久地保存

14、食品。季胺类药物由于具有一定的表面活性、无腐蚀且毒性低等优点而被广泛地用于食品保鲜和临床环境的防腐消毒。但随着他的使用,许多国家已发现金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌对季胺类药物产生耐药性。因此,为了防止耐药菌的流行,有必要对耐药菌进行调查和监测。3.3水质检测20世纪80年代流式细胞术被引入水生生态系统研究以来,该技术正以其样品制备简单、可进行快速多参数数据采集、精确测定、不易受溶解有机物的干扰、可进行多元数据分析及具分选功能等优越性引起愈来愈多研究者的关注,从而成为水生和环境微生物学研究中的一项重要工具。之后的20多年里,流式细胞术在国外蓬勃发展,在环保领域,Yamaguchi等应用FCM测定了

15、细菌在污染和未污染河水中呼吸及酶活性,结果发现,细菌的酯酶活性比率与河水污染程度直接相关,这一比率可作为评价水环境污染程度的指标。Coskuner等鉴定了活性污泥中硝化细菌群落的组成和分布,为研究污水处理中氮素循环提供了重要信息。在水生生物学研究领域,Fushs等采用流式细胞仪与荧光原位杂交技术及变性梯度凝胶电泳结合的方法来研究浮游细菌的分类鉴定;在海洋环境中,海洋细菌,即异养细菌在物质循环和能量循环中扮演着重要角色,他能分解海水中的有机质并将营养物质提供给上一级浮游植物,从而完成物质循环,是海洋生物链中不可或缺的重要组成部分,Olson R J、Grégori G等利用FCM技术对

16、海洋细菌在海洋生态中的作用以及在极端环境中特殊功能展开了大量的研究。近几年,国内也加强了在这些方面的研究,主要集中于水体中的浮游植物,包括对淡水湖富营养化、赤潮等的研究,潘洛安等也曾用SYBR Green I染料对自然水样进行染色,再结合FCM来计数其中的异养细菌。3.4化妆品检验化妆品卫生质量长期以来一直被人们所重视,尤其是微生物学检验指标与方法不断被研究。最近几年化妆品行业检验水平逐渐提高,流式细胞仪也被引入到化妆品中微生物的检验。对于香水类的化妆品,香水中的酒精浓度本可有效抑制霉菌和酵母菌的生长。但在酒精含量降低、污染量大、菌株耐酒精作用强时,香水类化妆品可有霉菌和酵母菌生长。所以,在日

17、常监测中, FCM方法被用来监控其中的活菌的生长情况。对于含抗菌剂化妆品,防腐效力检验是化妆品被审批时必须做的检测。一方面,FCM方法用于检测其中的微生物含量,以检验化妆品防腐剂抑菌效果;另一方面化妆品中各种不同的化学成分对防腐剂的抑菌效果会产生不可知的影响,所以FCM方法也适合于测定化学成分对防腐剂的影响效果。4FCM的发展前景和问题近年来,随着各项科学技术的迅猛发展,多学科之间的相互结合成为大的趋势,与生物医学、分子生物学和细胞生物学等相关学科的结合已成为流式细胞技术发展的必然方向,例如,将生物芯片技术和FCM有机结合在一起,把不同生物探针(核酸、蛋白等标记在各种有荧光的微球上,以荧光标记

18、微球作为反应载体在液相系统中完成生物学反应,即为流式细胞术液相芯片技术,他可以在同一液相中同时检测多个目的分子,完成多组分的快速检测。同时,流式细胞仪的功能不断完善、各种功能强大的分析软件的开发、多参数分析技术的发展等,为流式细胞术检测结果准确性的提高和分析能力的扩展提供了保障,并使仪器不断向小型化,操作自动化,简单化方向发展。可以预见,在未来微生物快速检测领域,流式细胞术的应用范围会进一步扩大,应用深度会进一步加强。当然,流式细胞技术完全应用于微生物快速检212010年第3期9月出版测还有很多问题亟待解决,首先是在国内尚无标准可循;其次,流式细胞仪的前期成本投入较大,运行操作的费用较高;再次

19、,流失细胞技术可应用的样品种类太少,暂时只能应用于液态商品,而且,不同液态商品中不同的基质对荧光染料的标记和荧光信号的收集都可能产生未知的影响,如何提高特异性,还需要我们研究解决。参考文献1杨怀德,张才军,李秀义,等.流式细胞术在微生物学中的应用J.医学综述,2006,12(13:825-827.2左连富.流式细胞术与生物医学M.沈阳:辽宁人民出版社,1996:129-422.3沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术M武汉:湖北科学技术出版社,2002:226-230.4魏熙胤,牛瑞芳.流式细胞仪的发展历史及其原理和应用进展J.现代仪器,2006(4:8-11.5M AECKER HT.Cytok

20、ine flow cytometry methodsJ.M olBiol,2004,263:95-108.6张艺.流式细胞仪构成与工作原理J医疗设备信息,2005,20(8:25-26.7王菊香,裴士庚,陈文弦.流式细胞仪及其在科研及医疗上的应用J.邯郸医专学报,1996,9(3:241-243.8曾令武.流式细胞术J.微生物与感染,2008,3(2:125-126.9SHERRIF F.IBRAHIM L,GER VAN DEN ENGH.Flowcto-metry and Cell SortingJ.Adv Biochem Engin/Biotechnol.2007,106:19-39.1

21、0JOHN P.NOLAN,LORETTAYANG.The flow of cytometryinto systems biology Briefings in functional genomics andproteomicsJ.2007,6(2:81-90.11闫虹,流式细胞术的临床应用J.现代检验医学杂志,2007,22(5:93-95.12DAY A,M EYLING J C.Practical experience with rapidmethods ofdetectingyeasts in breweriesJ.J Inst Brew,1990,89:204-206.13SRIEN

22、C F.Cytometric data as the basis for rigorous models ofcell population dynamicsJ.J Biotechnol,1999,71:233-238.14肖安风,周祥山,周利,等.应用流式细胞术检测毕赤酵母的细胞活性J.微生物学通报,2006,33(6:22-26.15张波,陈君,卢启威,等.应用流式细胞术对啤酒酵母在含油酸培养基中生长的定量研究J.现代仪器,2008(2:16-20.16王宁,刘宁.流式细胞术快速检测生乳中细菌总数J.食品工业科技,2007,28(9:197-200.17LAPLACE-BUILHE,C H

23、AHNE,K HUNGER,et al.Application of flow cytometry to rapid microbial analysis infood and drinks industriesJ.Biol Cell,1993,78:123-128. 18李庆,马筱玲,李柏青,.流式细胞术在临床细菌学检测中的应用J.国外医学临床生物化学与检验学分册,2002,23(6:344-345.19D.L.JONES,M.A.BRAILSFORD,J-L.DROCOURT SOLID-PHASEK.aser-scanningcytometry:a newtwo-Hour methodf

24、or the enumeration ofmicroorganisms in pharmaceutical waterJ.Pharmacopeial Forum,1999,25(1:7626-7645.20华德兴,钱元恕.细菌的消毒防腐剂耐药基因研究进展J.中国抗生素杂志,2008,33(9:513-519.21ROBERTSONBR,BUTTONDK,KOCH AL.Determinationof the biomasses of small bacteria at low concentrations in amixture of species with forward light sc

25、atter measurements byflow cytometryJ.Appl Environ M icrobiol,1998,64(10:3900-3909.22YAM AGUCHI N,NASU M.Flowcytometric analysis of bac-terial respiratory and enzymatic activity in the natural aquaticenvironmentmJ.Appl M icrobiol,1997,83(1:43-52. 23COSKUNER G,CURTIS T P.In situ characterization ofnitrifiersinan activated sludge plant:detection of nitrobactersppJ.Journal