嗜热微生物的研究进展及应用

1、嗜热微生物的研究进展及应用宜春学院 化学与生物工程学院 03生物教育 张志刚指导老师：姜琼摘要 嗜热微生物是一类最适生长温度高于45°C的微生物，嗜热酶是从嗜热微生物中分离得到的一类热稳定性酶，由于嗜热酶分子内部有很多氢键、二硫键及紧密而有韧性的空间结构的存在，所以嗜热酶在高温条件下具有很强的稳定性，高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，嗜热酶在许多方面都有广泛的应用。当前获得嗜热酶的方法主要有：直接从嗜热微生物中提取、利用基因工程技术在中温宿主中表达和利用定向分子进化技术筛选。目前酶的纯化主要采用层析法、高效液相色谱法和电泳法等方法。由于环境恶化,能源危机,全球变

2、暖等原因, 嗜热酶的开发和应用将出现更加诱人的前景。 关键词 嗜热微生物；嗜热酶；嗜热机制；应用Thermophilic microorganism research progress and applicationZhang Zhigang College of Chemistry and Bioengineering, Bioengineering (Biology education), YiChun University Advisor: Jiang QiongAbstract Thermophilic microorganisms is a type of microorganism

3、s that the most suitable growth temperature is above 45°C,the thermophilic enzyme is a type of a thermostable enzyme separated from the thermophilic microorganism, because there is a lot of hydrogen keys and two-sulphur keys in the thermophilic enzyme molecule, so the thermophilic enzyme have a

4、 very strong stability in the hot condition, as well as there is a stronger fastness to organic solvent、 eradicator and denaturant,the thermophilic enzyme have an extensive application in many fields.The method which obtained the thermophilic enzyme includes three kinds at present: distilled directl

5、y from the thermophilic microorganism, expressed in the mild host making use of a genetic engineering technique and sieved with the directional molecule evolution technique. At present the enzyme purification methods are:chromatography、HPLC and electrophoresis. Due to the cause of worsening environm

6、ent, energy crisis,warmer weather, the development and application of the thermophilic enzyme will appear more captivating foreground.Keywords Thermophilic microorganisms; Thermophilic enzyme; Thermophilic mechanism; Application最适生长温度高于45°C的微生物称为嗜热微生物，是在高温环境下生存的一类微生物，它们有其自己的适应机制和特定的新陈代谢能力，具有独特的

7、基因类型、特殊的生理机制及代谢产物，是地球上的边缘生命形式。嗜热酶是从嗜热微生物中分离得到的一类热稳定性酶，具有化学催化剂无法比拟的优点，尤其是在高温条件下保持极好的稳定性，使很多高温化学反应得以实现从而将极大的促进生物技术产业的发展。近年来，人们已从嗜热微生物中分离得到多种嗜热酶。今后，还应继续在嗜热酶的结构与功能、应用等方面作深入而全面的研究。本文主要对嗜热酶的研究进展及应用作一综述。1 嗜热微生物的分类及其酶的种类和特点1.1 嗜热微生物的分类嗜热微生物是一类生长温度跨度在40150之间的微生物,它可分为轻度嗜热(最适生长温度低于60)、中度嗜热(最适生长温度低于85) 和极度嗜热(最适

8、生长温度大于85) ,主要分布于地热环境(海底温泉和陆地温泉) 和其它高温环境(如堆肥、厩肥、高温水处理厂)1。见诸报道的能产嗜热蛋白酶的嗜热微生物中,以芽孢杆菌最多。例如, Bacillus sp.MO21,B.sp.EA.1,B.thermoproteolyticus ,B . licheniformis及B.circulans,B.sp.AK1,B.sp.B18,B.smithii,B.sp.BT1,B.sp.wai 21a,B.pumilus MK65,B.sp.JB299.此外,在真菌、古细菌、放线菌中也有过报道2。1.2 嗜热酶的种类嗜热酶有许多种，各种酶的作用各不相同，目前已开发

9、的嗜热酶有：1）降解淀粉类的嗜热酶：极端耐热淀粉酶、热稳定的葡萄糖糖化酶(1,4-glucanohydrolase)、热稳定的支链淀粉酶(pullulanase)、热稳定的环糊精糖基转移酶(cycodextrin glycosytransferases,CGTase)；2）降解纤维素类物质的嗜热酶：热稳定性纤维素酶；3）热稳定的木聚糖酶(xylanases)；4）降解几丁质的热稳定性酶：热稳定的几丁质酶；5）降解蛋白质的热稳定性酶：热稳定的蛋白酶；6）葡萄糖异构酶(glucose isomersae)和木糖异构酶(xylose isomersae)；7）DNA聚合酶等3。1.3 嗜热酶的特点嗜

10、热酶是一类主要来源于嗜热微生物的热稳定酶,能够在高温下长时间保持活性而不变性,其特点可概括为三点：1）作用的最佳温度高 嗜热酶作用最佳温度大多数在6080 之间,但也有少数例外。例如,来自Bacillus sp. B18的嗜热蛋白酶,其作用最佳温度为854；来自Thermoplasma acidophilum的嗜热蛋白酶,其作用最佳温度为955。最值得一提的是,来自Pseudomonas sp.的嗜热蛋白酶,其作用最佳温度为1206。2）具有良好的耐热性 例如,由Bacillus sp.AK1产生的proteinase AKl在60、70时酶活性无变化,90时酶活性半衰期为19min7；由Th

11、ermoactinomyces sp. E79产生的嗜热蛋白酶在90时,酶活半衰期为10min8；由Thermus sp. Rt41A产生的嗜热蛋白酶在70时酶活半衰期为24h9。3）具有良好的PH和热稳定性 例如,由Thermoactinomyces sp. E79产生的嗜热蛋白酶,在pH5.012.0范围内,酶活相当稳定8；由Bacillus sp. B18产生的嗜热蛋白酶在pH5.012.0范围内,酶活也相当稳定4；Bacillus stearothermophilus HY269产生的嗜热蛋白酶在70、80时,pH稳定范围分别为pH6. 010.0、pH6.08.010。2 嗜热酶的热

12、稳定机制嗜热酶的耐热性主要是由其分子内部结构决定的。维持嗜热酶内部立体结构的化学键，主要是氢键、二硫键的存在及数量与其热稳定性有关。一般认为，当这些键存在及数量增加时，酶的热稳定性增强；这些键断开，则酶的热稳定性降低或丧失。嗜热酶分子的许多微妙构造很可能与其稳定性有关。这些包括：稍长的螺旋结构，三股链组成的-折叠结构，C和N端氨基酸残基间的离子作用以及较小的表面环等。这些构造形成了嗜热酶紧密而有韧性的空间结构，从而提高其稳定性。酶蛋白为适应热环境会发生结构改变，但每一种酶的热适应机制不尽相同。一些酶在高温条件下结构发生了重排，使一些空间短距离基团相互作用，堆积的结构更优化，内部空洞的数量和体积

13、减少，在分子内部形成了一个疏水作用很强的疏水核，同时分子外部的极性表面积增加，所有这些都有利于增强嗜热酶的稳定性11。3 嗜热酶的获得3.1 直接从嗜热微生物中提取 从嗜热微生物的生境即堆肥、培养料、木屑堆、木片堆、树木、土壤、空气、动物巢穴、动物粪便、动物身体、昆虫等及火山口、沙漠、发热电器和电缆等特殊高温环境中分离嗜热微生物，然后直接从嗜热微生物中提取出嗜热酶。3.2利用基因工程技术在中温宿主中表达将嗜热微生物中的目的基因利用基因工程技术在中温宿主中成功表达，可在温和培养条件下得到大量的嗜热酶，从而克服因嗜热微生物生长速度较慢、培养条件严格而难以获得大量嗜热微生物的困难。目前，一些从嗜热微

14、生物中获得的基因已在大肠杆菌等中温宿主中得到了成功的表达12。3.3利用定向分子进化技术筛选将克隆的某一基因经体外诱变和重组获得大量突变体，经中温宿主表达后，再筛选得到在高温条件下有催化活力的突变体，着种定向分子进化技术是获得嗜热酶的一种新的途径。4 嗜热酶的纯化目前酶的纯化主要采用层析法：4.1 离子交换层析。离子交换层析是根据不同蛋白质与离子交换剂结合力不同而分离蛋白质。利用此方法能有效纯化嗜热酶。例如,孙超等10用CM-纤维素层析柱分离嗜热脂肪芽孢杆菌HY269的耐热金属蛋白酶获得成功。4.2 亲和层析。亲和层析法是纯化质的一种极为有效方法,它通常只需一步处理即可达到纯化目的。它是根据蛋

15、白质与相应配基亲和力大小不同而分离蛋白质,即目的蛋白因具有较强亲和力而留在层析柱上,非目的蛋白因亲和力小而被洗脱下来。例如,金城等13利用Cbz-L-Phe-T-Sepharose 4B亲和层析柱从嗜热脂肪芽孢杆菌HY269中分离纯化耐热金属蛋白酶。4.3 凝胶过滤层析。它是根据蛋白质分子大小不同而分离蛋白质。这也是一种有效纯化嗜热酶的方法。例如,唐兵等14用Sephadex G50凝胶柱从嗜热脂肪芽孢杆菌WF146中纯化耐热中性蛋白酶。4.4 离子交换层析与凝胶过滤层析配合使用。在分离纯化的过程中,常常出现目的蛋白与非目的蛋白具有相同电荷性质或相同分子量。这就使得用一步离子交换层析或凝胶层析

16、变得无效。若两种方法结合,则能取得满意效果。例如,Kumar CG15用离子交换层析、凝胶过滤层析纯化嗜热碱性蛋白酶。纯化嗜热酶除了层析法,还有高效液相色谱法、电泳法。最值得一提的是:Manro GK等9利用基因工程技术构建融合蛋白的方法来帮助纯化嗜热酶。5 嗜热酶的应用利用嗜热酶作为生物催化剂有如下的优点:(1)酶制剂的制备成本降低。因为嗜热酶的稳定性高,因而可以在室温下分离提纯和包装运输,并且能长久地保持活性;(2)加快了动力学反应。随着反应温度的提高,分子运动速度加快,酶催化能力加强;(3)对反应器冷却系统的要求标准降低,因而减少了能耗。由于嗜热酶有耐高温的特性,所以生产中不需要复杂的冷

17、却装置。一方面节省了开支,另一方面也降低了冷却过程对环境所造成的污染;(4)提高了产物的纯度。在嗜热酶催化反应条件下(超过70),很少有杂菌生存,从而减少了细菌代谢物对产物的污染;(5) 生化过程在高温下进行,能提高难溶物质如淀粉、纤维素、脂类的溶解性和可利用性,降低有机化合物的黏度而利于物质的扩散和混合。 基于嗜热酶的高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，使它在许多方面都有广泛的应用潜力。5.1 食品酿造工业 食品加工过程中,通常要经过脂肪水解,蛋白质消化、纤维素水解等处理过程16 。嗜热蛋白酶、淀粉酶及糖化酶已经在食品加工过程中发挥了重要作用。一些具有耐热活性的-淀粉酶已

18、用于淀粉加工、酒精、啤酒及其他发酵工业生产。嗜高温水解酶给食品工业带来生机,消化蛋白酶加工纤维使食品更具风味和有益健康。在啤酒中应用-葡聚糖酶可以提高麦汁分离速度,降低啤酒浑浊度,减少胶状沉淀。嗜热链球菌是TTC 法检测牛乳中抗生素的指示菌,又是酸奶生产特定菌,它与保加利亚杆菌混合培养能产生出芳香适口的酸奶。-半乳糖苷酶可用于生产低乳糖食品,改善乳制品的风味和营养,在水解过程中还会发生转糖苷反应, 生成具有多种功能的低聚乳糖(GOS)17 。5.2 造纸工业传统的方法是利用强酸或强碱处理木桨,大约90%的木质素可以被水解。从嗜热菌Thermotoga中分离得到1,4-木聚糖内切酶,其最适温度为

19、105,用这种酶处理木浆可以有效地去除木质素,减少对化学漂白剂的用量 18。5.3 环境保护 在环境保护方面,主要体现在处理食品和造纸工业废水、芳香族化合物、氰化物、有机磷农药、重金属及其他有机难降解物质19 。利用嗜热酶处理木浆可以有效地祛除木质素,减少对化学漂白剂的用量,从而减少了对环境的污染。在污水处理及废物处理方面,人们不仅可以利用嗜热酶的耐热性,更重要的是利用它对有机溶剂的抗性。所以在许多污染地区利用嗜热酶除去烷类化合物的污染有很大的优势16。5.4 能源利用 目前,人们利用的主要能源物质为煤和石油,然而大多数煤和石油中都含有很高的无机或有机硫成分,在天然煤中硫的含量大约是0.5%6

20、%,在燃过煤的废物中,它的含量高达11%,SO2直接进入大气中,促进了酸雨的形成,所以对煤的直接利用已引起了严重的环境污染。在煤和石油脱硫处理中,用化学法脱硫需要100400高温,而且由于有硫酸的生成,导致了很强的酸性环境。而用物理方法价格昂贵,同时也会引起好煤的流失。与这些方法相比,微生物除硫所需能量少,避免了好煤的流失及对环境的污染,既提高了煤的质量,又降低了成本16。嗜热细菌木聚糖异构酶能缓解能源危机和环境污染的日益严重,并促进资源的再生,尤其对农副产品及林产品的木质废弃物以及以农产品和林产品为原料的木业和造纸厂废弃物中的木糖的利用,特别是通过微生物转化木糖产生乙醇的研究已经成为热点之一

21、。有研究表明嗜热酶能将葡萄糖转化为氢气和水,这种从糖中获取无污染燃料的方法可能导致能源革命,已经研究了嗜高温微生物的半纤维素酶,可在较高温度下水解树脂。 石油开采过程中,利用粘胶混合细沙在岩石床上加压,出现裂缝后,用超嗜热酶可以提高油和气的流动性,加速石油或天然气的流出16。美国Halliburton能源服务公司将把Diversa公司制造的一种嗜热酶加入该公司已获专利的压裂液中。压裂液是天然聚合物, 在高压下用于在岩层中压出裂缝。一旦岩层被压裂, 压裂液中的酶就会使物质分解, 降低油的粘度, 从而使油能流出裂缝20。5.5 代谢工程方面嗜热菌在糖代谢、三羧酸循环、氨基酸代谢中除了催化每一步酶的

22、热稳定性较高以外,还有一些区别性的特点。如高温菌的烯醇化酶为10或8聚体,而常温菌为2聚体,高温菌中的乙酰辅酶A和天门冬氨酸对丙酮酸羧化酶有双重作用,缬氨酸对乙酰乳酸合成酶的反馈抑制,高温菌中有2种类型的天门冬氨酸激酶存在等21,为发现新的代谢途径提供了依据。5.6 医药工业耐热-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等已广泛应用于医药工业。如利用-淀粉酶生产葡萄糖,利用脂肪酶高度立体选择,进行光学合成手性药物等。极端微生物酶的相关产物已应用于疾病的诊断及治疗、胎儿性别鉴定及法医鉴定等22。5.7 遗传研究嗜热微生物酶对核苷酸序列分析、染色体畸变和基因突变等理论研究工作起很大促进作用21。在PCR 技术中DN

23、A聚合酶起着关键性的作用。近年来,PCR得到较大的改进,通过Taq酶或其他一些低保真酶的作用,PCR反应中加入少量具有高热稳定性的来自古细菌的高保真性DNA聚合酶,可以大幅度降低大片段DNA(2040kb)扩增的错配率,这对进行一些哺乳动物的基因扩增是非常有用的23。5.8 生物转化及抗生素的生产随着对嗜热酶研究的深入,其在生物转化方面的作用日益引起人们的重视。已有报道,嗜热菌对维生素及类固醇等生物物质的修饰有重要作用。在堆肥实验中,Kplan及合作者利用嗜热菌对2,4,6-三硝基甲苯进行了转化24。另外,他们也利用Pseudomonas thermophila中的一种嗜热需氧菌生产出了多种B

24、族维生素。在抗生素的生产中,利用嗜热酶催化获得的抗生素也有报道。在利用嗜热菌Thermoactinomyces 获得的9种抗生素中,两种热红菌素及热绿链菌素已进行工业化生产并在医药领域得到应用25。5.9 洗涤剂行业嗜热酶还有一个重要的应用领域就是洗涤剂行业，如蛋白酶、脂肪酶、-淀粉酶和纤维素酶等，上述酶已广泛用作去污剂的添加剂。然而，一般酶是在30-40中发挥作用，如果水的温度超过该温度，则洗涤效果受到影响。洗碗机和工业去油污使用的洗涤剂需要在高温下洗涤，因而需要开发高温酶做添加剂。因此，嗜热酶的应用将拓展洗涤剂市场26。此外，嗜热酶还在冶金工业方面也有广泛的应用。6前景展望当前，嗜热微生物

25、及其嗜热酶越来越受到人们的重视。但因嗜热酶的稳定性机理仍不太清楚、培养条件苛刻、虽然利用基因工程技术已在中温宿主中得到表达，但酶的表达量低等原因，其广泛应用受到限制。嗜热酶的研究还处于起步阶段,有许多问题有待解决,主要包括以下几个方面: 1）进一步筛选具有优良特性的高产菌株；2）加强嗜热酶耐热机制的研究,为人们利用蛋白质工程技术改造天然酶提供理论依据；3）开发适合嗜热微生物生长的生物反应器以实现工业化生产；4）加强嗜热酶的应用研究。由于环境恶化,能源危机,全球变暖等原因, 嗜热微生物酶的开发和应用将出现更加诱人的前景。致谢在我的论文完成之际，首先要感谢我的指导老师姜琼，姜老师平日里工作繁忙，但

26、在我做毕业设计的过程中，给予我许多帮助，及时的纠正我在论文创作中各种错误。除了姜老师的专业水平是我敬佩外，他的治学严谨和科学研究的精神也是我学习的榜样。其次要感谢的是一起帮助我的同学，没有他们的帮助，此次设计将会变得更加困难。最后感谢化生学院和我的母校宜春学院为我提供了许多论文的素材。参考文献1 和致中,彭谦,陈俊英.高温微生物学M.北京:科学出版社,2000.1-3.2 张云峰,罗玉明,王新风.嗜热蛋白酶的研究与应用J.淮阴师范学院学报,2003,2(3):245-246.3 王顺民,董文宾.嗜热酶的研究及其在食品等相关工业的应用J.自然杂志,2004,26(6):339-341.4 Fuj

27、iwara N,Masui A,ImanakaT.Purification and propertes of the highly thermostable alkaline protease from and alkaliphilic an thermophilic Bacillus spJ.J Biotechnol,1993,30(2):245-246.5 Beadell J S,Clark D S.Probing stability-activity relationship in the thermophilic protease from Thermoplasma acidphilu

28、m by random mutagenesisJ.Extremephiles,2001,5(1):3-10.6 Barach J T,Adams D M.Thermostability at ultrahigh temperatures of thermolysin and a proteinase from a psychotrophic pseudomonasJ.Bochem Biophys Acta,1977,485(2):417-427.7 Peek K,Veitch D P.Some characterization of a proteinase from a thermophil

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