基因型鉴定心得ppt课件

1、培训心得之基因型鉴定 刘艺 :基因型鉴定根本步骤DNA提取PCR反响 :DNA提取所取样本鼠尾取样时间取样过程动物标志取样记录本卷须知:取样时间 10d-14d 鼠小，尾尖部DNA充足，出血少，毛少，易操作。 :取样过程 器械：眼科剪，小镊子，酒精棉，基因型检测记录表，记号笔，1.5ml EP管消毒 减尾长度：1cm左右 小贴士：双人操作，一剪一消毒，两剪同时进展，三序核对，稳准狠 :RF脚标：剪鼠尾的同时，剪去一小段不同脚趾，经过不同脚趾的缺失排布以确定该小鼠的编号。前肢用字母Ffront leg表示(1-8)，后肢用字母Rrear leg表示(1-10)。思索：第26只小鼠标志是什么？:动

2、物基因型检测记录表检测鼠ID:样品预备的本卷须知鼠尾最好当天剪完当天进展DNA的提取。如不能提应放至-20冰箱保管，但留意冻存时间不宜过长。低温保管的样品不宜反复冻融。举例：百奥赛图教师们10d剪尾1周做检测18d基因型鉴定终了分笼:DNA提取的总流程标注序号裂解液的配制鼠尾裂解离心去杂质汲取上层溶液异丙醇沉淀离心洗涤室温风干水溶DNA:裂解液的配方裂解液的配方 蛋白酶蛋白酶K KPKPK：储存浓度：储存浓度：10mg/ml10mg/ml；终浓度；终浓度100ug/m; -20100ug/m; -20保管。保管。 储存液可以事先配制好，蛋白酶储存液可以事先配制好，蛋白酶K K要现用现配。要现用

3、现配。 配制列子：配制列子：10ml10ml裂解液裂解液 Tris-HCl 1ml Tris-HCl 1ml EDTA 100ul EDTA 100ul NaCl 667ul NaCl 667ul SDS 200ul SDS 200ul 蛋白酶蛋白酶K 100ulK 100ul 10000ul(10ml)-1967ul=8033ul 10000ul(10ml)-1967ul=8033ul水水:提取详细步骤EP管中的鼠尾（管壁标号，记录）500ul 配制好的裂解液（含蛋白酶5ul），封口膜封好55 杂交炉转过夜第二天早上，从杂交炉中拿出，室温放置10-15min13000rpm，室温离心15mi

4、n吸取400ul 上清至另一个新的EP管中，加入等体积的异丙醇看到有DNA析出后，12000rpm 离心10min，弃上清冰冷的75%乙醇700ul轻混，漂洗一次，12000rpm 离心5min，将上清液全部吸除在超净台中风干约 3-5 min用50-100ul 双蒸水(根据DNA量确定用水量)，在55 溶解2h 即可用做PCR模板:PCR鉴定引物设计条件探求常见问题举例阐明:引物设计设计原那么引物长度普通为2024bp引物碱基尽能够随机分布：GC含量约60%引物不应有发夹构造：即不能有4bp以上的回文序列引物的3端为关键碱基：两引物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列在3端不应有任何互

5、补碱基产物大小：约200300bpTm值：60左右特异性：即无目的条带之外的多余条带最理想的鉴定引物，一对引物即可以区分两种基因型:条件探求DNA模板引物Mg2+浓度dNTP MixtureddH2O退火温度温度梯度下假设没有条带，直接换引物吧！:常见问题引物是关键： 无扩增产物引物设计不当或发生降解 非特异性扩增引物特异性差缘由对策重新设计引物吧！:模板要干净，浓度要适宜 无扩增产物：含量低，含有抑制物酒精没洗干净 非特异性扩增：模板浓度过高 拖尾景象：模板不纯 模板在参与MIX之前要测定浓度 OD:260/280 纯DNA浓度OD值大约在1.8:假阳性 景象：空白对照出现目的扩增产物水对照

6、，阴性对照。缘由被污染了！1.操作时动作要轻柔2.器材要高温高压消毒3.各种试剂事先分装，低温储存:PCR中对照组的设立Cre-loxp systemFlp-Frt system基因敲进Rosa 26工具鼠查找运用:Cre 一种重组酶，可由噬菌体转染到细胞，催化Loxp位点间的DNA进展特异性重组。Loxp 34bp序列，两端是13bp的反向反复序列，中间是其定向作用的8bp间隔区。重组产物 根据loxp位点的位置和相对方向而不同，在一条链上单loxp位点的DNA将被交融。 CreLoxpLoxp:Flp-Frt system:主要用来去除NeoNeoFrtFrtFlpNeo：新霉素抗性基因(

7、neo)是真核表达载体的常用挑选标志。:基因敲进Rosa 26 Rosa 26不编码蛋白质，在其前面参与强启动子，后面加一个过表达的基因便可以实现定点敲进，用于识踪。TargetNeoRosaNeo 后有一个stop序列，所以当Neo存在时，后方的报告基因不表达，Cre敲掉目的基因同时报告基因被敲进。LoxpLoxpPromotor+Rosa26+geneFrtFrtRosaCre:工具鼠 含有重组酶Cre,Flp)的小鼠，可与含Loxp,Frt)小鼠交配，得到基因敲除/敲进小鼠。选择工具鼠： 有详细的引见各种工具鼠。 工具鼠是B6品系的。 Promotor 全身性敲除，特异性

8、敲除，常染色体，性染 色体。 工具鼠的纯和程度，概率。 :Target NeoLoxpFrtFrtLoxp全基因敲除Cre:PCR过程中各种对照组的选择获得全基因敲除/敲进小鼠 F1代杂合子小鼠(fl-neo) 直接跟Cre-deleter小鼠交配，从而将exon6和Neo cassette 一同敲除，获得全基因敲除目的基因同时敲进Tdtomato报告基因的小鼠。 杂合子小鼠交配获得纯合子。:1. 与与Cre-deleter小鼠交配，获得全基因敲除小鼠交配，获得全基因敲除/敲进敲进杂合子小鼠杂合子小鼠Controls: +/+, Cre/+:2. 获得全基因敲除获得全基因敲除/敲进纯合子小鼠敲

9、进纯合子小鼠Controls: M / +; + / +:获得条件性基因敲除/敲进小鼠 由于由于Neo cassette位于目的基因的下游，不会影响目的位于目的基因的下游，不会影响目的基因的表达，但基因的表达，但Neo cassette的存在势必会一定程度上影响的存在势必会一定程度上影响小鼠的表型。所以得到小鼠的表型。所以得到F1代杂合子小鼠后，需求去掉代杂合子小鼠后，需求去掉Neo cassette。Neo cassette的两端分别有一个的两端分别有一个Frt序列，是序列，是Flp重组酶的识别位点。将杂合子小鼠重组酶的识别位点。将杂合子小鼠(fl-neo)与与Flp-deleter小小 鼠交配，得到带有鼠交配，得到带有Flp转基因的转基因的floxedfl杂合子小鼠。杂合子小鼠。 fl杂合子小鼠再与组织特异性的杂合子小鼠再与组织特异性的cre小鼠交配，实现小鼠交配，实现Dmp1基因组织特异性基因组织特异性:与Flp-deleter小鼠交配，去除 Neo cassette基因型为 fl/+,Flp/+，阐明已去除掉Neo cassette ，小鼠将用于下一步交配；所用的Flp-deleter小鼠可以是纯合子，也可以是杂合子。:与组织特异性Cre小鼠ts-Cre交配，获得fl杂合子小鼠。1. 此步只能获得杂合子，纯合子小鼠实验用小鼠需求进展进一步交配获得；此步只能获得杂合子，