丁醇生物合成

1、报告人：报告人：silla silla 异源重构丁醇生物合成途径提高其产量异源重构丁醇生物合成途径提高其产量提纲：提纲：背景背景三种丁醇生物合成途径的异源重构三种丁醇生物合成途径的异源重构总结与展望总结与展望1 14 42 2合成生物学的应用研究合成生物学的应用研究 3 3丁醇耐受性研究丁醇耐受性研究背景背景 随着石化资源的枯竭，石油价格的不断攀升，微生物发酵随着石化资源的枯竭，石油价格的不断攀升，微生物发酵生产丁醇受到了人们的普遍关注。生产丁醇受到了人们的普遍关注。 丁醇的分子式：丁醇的分子式： 丁醇主要应用丁醇主要应用：溶剂、抗氧剂、增塑剂、合成药物、精细溶剂、抗氧剂、增塑剂、合成药物、精

2、细化工等化工等 国内生产生物丁醇主要是以玉米为原料，利用丙酮丁醇梭国内生产生物丁醇主要是以玉米为原料，利用丙酮丁醇梭菌菌(Clostridium acetobutylicum)发酵，其主要产物是丁醇、发酵，其主要产物是丁醇、丙酮和乙醇，含量比例约为丙酮和乙醇，含量比例约为 6：3：1，简称，简称ABE发酵发酵 。背景背景传统传统ABEABE发酵丁醇生产的缺点发酵丁醇生产的缺点 成本过高，价格上对石油燃料没有竞争性成本过高，价格上对石油燃料没有竞争性 发酵菌株产总溶剂较低发酵菌株产总溶剂较低 发酵产物中丁醇比不高发酵产物中丁醇比不高 丁醇耐受性差丁醇耐受性差提高丁醇生产效率的有效技术手段提高丁醇

3、生产效率的有效技术手段分离筛选性能优良的新菌种分离筛选性能优良的新菌种过量表达菌株代谢网络的相关蛋白过量表达菌株代谢网络的相关蛋白敲除合成代谢副产物基因或转录阻遏蛋白的基因敲除合成代谢副产物基因或转录阻遏蛋白的基因利用利用合成生物学合成生物学的方法重建丁醇生物合成途径的方法重建丁醇生物合成途径应用合成生物学应用合成生物学异源重构异源重构丁醇合成途径丁醇合成途径在酿酒酵母中重构在酿酒酵母中重构在大肠杆菌中重构在大肠杆菌中重构在乳酸菌中重构在乳酸菌中重构 Enzymes in black are from other organisms: AtoB, Escherichia coli; Erg10

4、, S. cerevisiae; PhaA, Ralstonia eutropha; PhaB, Ralstonia eutropha; Ccr,Streptomycescollinus.The red ones are from Clostridium beijerinckii.ThlHbdCrtBcdEtfAB AdhE2AdhE2lSteen E J, Chan R, Prasad N, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial C

5、ell Factoris, 2008, 7:36-43.1、Plasmids contain the 2 origin of replication, LEU2D or HIS3 genes for selection, the GAL1 or GAL10 promoters, and the CYC1, ADH1,or PGK1 transcription terminators. 2、The first three genes of the 1-butanol pathway were placed on the pESC-LEU2D plasmid and the last two or

6、 four (in the case of the etfAB, bcd bearing strain) genes were placed on the pESC-HIS3 plasmid.resultERG10，hbd phaA,phaBetfAB,bcd应用合成生物学异源重构丁醇合成途径应用合成生物学异源重构丁醇合成途径在酿酒酵母中重构在酿酒酵母中重构在大肠杆菌中重构在大肠杆菌中重构在乳酸菌中重构在乳酸菌中重构Reconstructing 1-butanol metabolic pathway in Escherichia coli lAtsumi S, Cann A F, Connor

7、M R, et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production. Metabolic Engeering, 2008, 10:305311.C. acetobutylicum thiolase, coded by thl, acetyl-CoA acetyltranserase from E. coli, coded by atoBAnzyme genes selectionbcd and etfAB, from M. elsdenii ccr, from S. coelicolorCCRbcd and

8、 etfAB, from C. acetobutylicum Anzyme genes selection磷酸乙酰转移酶磷酸乙酰转移酶( PTA, pta)Corresponding genes knockout580mg/LResults应用合成生物学异源重构丁醇合成途径应用合成生物学异源重构丁醇合成途径在酿酒酵母中重构在酿酒酵母中重构在大肠杆菌中重构在大肠杆菌中重构在乳酸菌中重构在乳酸菌中重构Reconstructing n-butanol metabolic pathway in Lactobacillus brevisBerezina O V, Zakharova N V, Brand

9、 A t, et al. Reconstructing the clostridial n-butanol metabolic pathway in Lactobacillus brevis. Appllied Microbiol Biotechnol, 2010, 87:635646ThlHbdAdh丁醇耐受性研究丁醇耐受性研究Engineering Butanol-Tolerance in Escherichia coliGlobal transcription machinery engineering (gTME)is a novel method of directed evolut

10、ion for improving cellular phenotype.全局转录机制工程全局转录机制工程 (gTME）技术正是通过基因工程方法技术正是通过基因工程方法改造全局转录调控因子使整改造全局转录调控因子使整个转录调控过程发生变化从个转录调控过程发生变化从而改变或提高目标基因的转而改变或提高目标基因的转录及表达。录及表达。Artificial transcription factors(ATFs)通常由通常由 DNA 结合结构域与效应结构结合结构域与效应结构域两部分组成域两部分组成, 研究发现这两个结构研究发现这两个结构域可以各自独立发生作用。基于转域可以各自独立发生作用。基于转录因子

11、的这种结构特点录因子的这种结构特点, 可以人为地可以人为地选择针对特定序列的选择针对特定序列的 DNA 结合结构结合结构域与具有特定作用的效应结构域构域与具有特定作用的效应结构域构建人工转录因子。建人工转录因子。人工转录因子的人工转录因子的 DNA 结合结构域多为结合结构域多为 C2H2 型锌指结构型锌指结构Developed novel artificial transcription factors (ATFs) composed of zinc finger (ZF) DNA-binding proteins, with distinct specificities, fused to

12、an E. coli cyclic AMP receptor protein (CRP)Engineering Butanol-Tolerance in Escherichia coliLee J Y, Yang K S, Jang S A, et al. Engineering Butanol-Tolerance in Escherichia coli With Artificial Transcription Factor Libraries. Biotechenology and Bioengeering, 2011, 108 (4): 742-749.Artificial transc

13、ription Factor LibrariesEliciting a Butanol-Tolerant PhenotypeSummary & Future work Using native enzymes/Heterologous expression of expression of the corr-esponding genesDeleting corresponding genes开发利用廉价开发利用廉价Feedstocks的工程的工程菌菌丁醇生物合成途径已丁醇生物合成途径已成功在多类细胞中重成功在多类细胞中重建建提高丁醇耐受性的提高丁醇耐受性的研究研究基因的优化合基因的优

14、化合提高丁醇产量提高丁醇产量已发现与丁醇耐已发现与丁醇耐受相关的基因受相关的基因利用利用CO2，纤维素水解糖纤维素水解糖参考其他耐受性研参考其他耐受性研究成果进行更具体，究成果进行更具体，深层研究深层研究寻找优势酶，寻找优势酶，酶基因序列人酶基因序列人工优化工优化细微调节细微调节寻找潜在宿主，寻找潜在宿主，构建工程构建工程Clostridium用合成生物学的用合成生物学的方法构建利用廉方法构建利用廉价价/宽泛原料工宽泛原料工程菌菌程菌菌Escherichia coli Saccharomyces cerevisiaeLactobacillus brevis Pseudomonas putida

15、Bacillus subtilis cyanobacteria主要参考文献主要参考文献lGreen E M. Fermentative production of butanolthe industrial perspective.Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22:337-343.lLee J Y, Yang K S, Jang S A, et al. Engineering Butanol-Tolerance in Escherichia coli With Artificial Transcription Factor Libraries

16、. Biotechenology and Bioengeering, 2011, 108 (4): 742-749.lBerezina O V, Zakharova N V, Brand A t, et al. Reconstructing the clostridial n-butanol metabolic pathway in Lactobacillus brevis. Appllied Microbiol Biotechnol, 2010, 87:635646.lAtsumi S, Cann A F, ConnorM R, et al.Metabolic engineering of Escherichia