生物化学实验：α—淀粉酶蛋白质含量及活力测定

1、淀粉酶蛋白质含量及活力测定生物化学实验安排1 1、淀粉酶蛋白质含量及活力测定（淀粉酶蛋白质含量及活力测定（5 5课时课时2 2周）周）2 2、动物组织中核酸的提取与鉴定、动物组织中核酸的提取与鉴定 （5 5课时课时2 2周）周）3 3、细胞色素、细胞色素C C的制备及测定的制备及测定 （1212课时课时3 3周）周）4 4、SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子质量测定蛋白质分子质量 （8 8课时课时2 2周周9,109,10周）周）5 5、层析技术分离生物大分子、层析技术分离生物大分子 （7 7课时课时2 2周周1111，1212周）周）6 6、凝胶等电聚焦法测定蛋白质等电点（、凝胶

2、等电聚焦法测定蛋白质等电点（8 8课时课时2 2周周1313，1414周）周）淀粉酶蛋白质含量测定一、常用蛋白质含量测定方法一、常用蛋白质含量测定方法n凯氏定氮法凯氏定氮法n双缩脲法双缩脲法n考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250染色法染色法 nFolin酚法酚法n紫外分光光度法紫外分光光度法二、实验方法及设计思路二、实验方法及设计思路1、样品预处理、样品预处理 准确称取准确称取1.5000克酶粉，用蒸馏水溶解，放入研钵中研磨后定容克酶粉，用蒸馏水溶解，放入研钵中研磨后定容50毫毫升，过滤（升，过滤（准备准备5-6个漏斗，同时过滤个漏斗，同时过滤），除去沉淀，合并滤液，制成），除去沉淀，合并滤液，制成酶

3、储备液。此溶液测定蛋白质含量。酶储备液。此溶液测定蛋白质含量。 2、标准曲线测定、标准曲线测定3、待测样品测定、待测样品测定(样品平行做两次样品平行做两次）4、数据处理（、数据处理（用电脑处理用电脑处理）复习与思考n1、凯氏定氮法和比色法测定蛋白质含量有何不、凯氏定氮法和比色法测定蛋白质含量有何不同？（从测定原理进行分析）同？（从测定原理进行分析）n2、用计算机制作标准曲线的方法？（简单描述）、用计算机制作标准曲线的方法？（简单描述）n写出流程。写出流程。n3、分析测定误差形成的原因。、分析测定误差形成的原因。淀粉酶活力测定n一、原理一、原理n淀粉淀粉 糊精糊精n 淀粉酶淀粉酶n葡萄糖残基葡萄

4、糖残基60 蓝色糊精蓝色糊精n葡萄糖残基葡萄糖残基20 红色糊精红色糊精n葡萄糖残基葡萄糖残基6 无色糊精无色糊精n二、实验方法及设计思路二、实验方法及设计思路n1、取酶储备液、取酶储备液5.00mL，稀释至，稀释至50mL，制成酶应用液。，制成酶应用液。n 或或准确称取准确称取0.1500克酶粉，用蒸馏水溶解，放入研钵中研磨后定容克酶粉，用蒸馏水溶解，放入研钵中研磨后定容50毫升，制成酶应用液毫升，制成酶应用液（不测蛋白质含量时）。用时摇匀。（不测蛋白质含量时）。用时摇匀。 n2、取、取l.00mL标准糊精液置于盛有标准糊精液置于盛有3.00mL比色稀碘液的试管中，作为颜色的标准管。所有试管

5、应选用比色稀碘液的试管中，作为颜色的标准管。所有试管应选用管径一致的。管径一致的。n3、在、在60mL的试剂瓶（反应瓶）中加入的试剂瓶（反应瓶）中加入2%可溶性淀粉溶液可溶性淀粉溶液20.00mL，pH6.0缓冲液缓冲液5.00mL，在，在60水浴中平衡温度（约水浴中平衡温度（约10min），加入），加入0.50mL酶应用液，酶应用液，即刻记时，即刻记时，充分混匀，定时（充分混匀，定时（开始开始1分钟左右，分钟左右，后可以稍快后可以稍快）取出）取出lmL（用带刻度的小滴管或移液枪用带刻度的小滴管或移液枪）反应液于试管内（试管中先盛有）反应液于试管内（试管中先盛有3mL比色稀碘比色稀碘液，液，预先准备预先准备8支支），当由紫色逐渐转变为棕橙色，与标准比色管颜色相同时，即为反应终点，记录时），当由紫色逐渐转变为棕橙色，与标准比色管颜色相同时，即为反应终点，记录时间即为液化时间间即为液化时间(t)，重复做一次取平均值。，重复做一次取平均值。n4、液化型淀粉酶的活力（、液化型淀粉酶的活力（u/g粗酶）粗酶）n 200.0260t10.5（50）1W复习与思考