实用pcr流程表

1、临床PCR检验流程记录表 检验日期： 检验项目： HBV-DNA 扩增仪中保存文件名 使用说明：严格按单一流向进行实验，即试剂准备区标本制备区扩增区，严禁逆向移动。本记录表的流向亦遵循此流程；各项工作执行后在相应项目前的方框内打“”；本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。实验前准备试剂在有效期内 扩增仪、加样器、金属浴、温湿度计等仪器在校准有效期内（校准之日起1年） 生物安全柜的滤膜在使用有效期内 离心管、带滤芯吸头已经过质检合格 各区按消毒液配制SOP配制500mg/L含氯消毒液、2000mg/L含氯消毒液和70%酒精，即用即配。 打开通风设备操作者 试剂准备区实

2、验前：更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套 实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭） 冰箱温度：冷藏室（28） ； 冷冻室（-20±2） 实验室温度 （允许范围：1530）；相对湿度： （允许范围：30%70%）PCR试剂来源： 试剂厂家：口 深圳匹基生物工程有限公司 批号： 检验项目： HBV-DNA 本次实验用量： 人份； 剩余量： 人份其他有关试剂配制： 仪器设备使用：离心机：正常 不正常 ； 振荡器：正常 不正常； 生物安全柜： 口 正常 口 不正常实验后： 按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。 按实验室

3、废弃物处理SOP处理实验废弃物。 操作者 检验日期： 检验项目： HBV-DNA 样本处理区实验前：更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套 实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭） 冰箱温度：冷藏室（28） ； 冷冻室（-20±2） 实验室温度 （允许范围：1530）；相对湿度： （允许范围：30%70%）HBV-DNA阳性室内质控物来源： 浓度及批号： 扩增位置：HBV-DNA阴性室内质控物来源： 批号： 扩增位置：所处理的HBV-DNA标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：1917253341495765738189210182634425058667482

4、90311192735435159677583914122028364452606876849251321293745536169778593614223038465462707886947152331394755637179879581624324048566472808896核酸提取及加样过程：按乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。 仪器设备使用： 生物安全柜： 正常 不正常； 恒温金属浴： ；离心机： 正常 不正常； 振荡器： 正常 不正常； 低温离心机：制冷：正常 不正常； 离心：正常 不正常 实验后： 按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行

5、紫外线照射30分钟以上。 按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。 口 使用后标本冷冻保存3个月，以备复查。 操作者 检验日期： 检验项目： HBV-DNA 扩增及产物分析区实验前：更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套 实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭） 实验室温度 （允许范围：1530）；相对湿度： （允许范围：30%70%）LightCycler扩增仪操作：开机自检及运行正常； 按LightCycler操作使用SOP进行编程、参数设定HBV-DNA 标准曲线计算值：Slope 值： Intercept值： r2值： 室内质控结果：阴性质控物结果： ；阳性质控物结果：

6、 口填写室内质控记录、质控图； 是否失控：口否 口是室内质控结果：阴性质控物结果： ；阳性质控物结果： 口填写室内质控记录、质控图； 是否失控：口否 口是失控原因及分析：（失控判断标准及原因分析按室内质控SOP进行）实验结果：见所附扩增仪打印结果实验结果有效性判断：有效 无效（依据实验结果有效性判断SOP进行）实验后： 按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。 按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。 操作者 1. 操作步骤：1.2.1 取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临

7、界阳性对照）1.2.2 向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。1.2.3 分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.1.2.4 加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。（注意：不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。1.2.5 56摄氏度温浴15分钟。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。1.2.6 加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。在室温下静置5分钟（15-25摄氏度）。注意：如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。1.2.7 将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将

8、步骤中的液体移入核酸提取柱中。盖上盖子，6000*g离心1分钟。倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体）1.2.8 小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。1.2.9 小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。1.2.10 小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul无水乙醇，盖上盖子，6000*g离心1分钟，丢弃收集管，将提取柱

9、放入新的收集管中。1.2.11 20000*g高速离心3分钟，彻底去除乙醇。1.2.12 丢弃收集管，将核酸提取柱放入干净的1.5ml离心管中，打开提取柱的盖子， 56摄氏度温浴3分钟，以彻底去除残余的液体。1.213 将核酸提取柱放入另一干净的1.5ml离心管中，小心打开提取柱的盖子，加入60ul洗脱液（请将洗脱液加到膜的中央），盖上盖子，室温静置5分钟。20000*g高速离心1分钟收集滤出液，做好标记，4摄氏度保存备用。提取的病毒核酸应在2小时内用于PCR扩增，或在-70摄氏度下可以保存一个月。2. 扩增试剂准备（PCR前准备区） 从试剂盒中取出HCV RT-PCR反应液、Enzyme M

10、ix , 在室温下融化后，2000*g离心5秒。设所需要的PCR反应管数（玻璃毛细管）为n（n=样本数+1管空白对照+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照+4管HCV定量标准品），每个测试反应体系配制如下表： 试剂 HCV RT-PCR反应液 Enzyme Mix 用量 n*13ul n*2ul 计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，充分混匀均匀后2000*g离心10秒，向各玻璃毛细管中分装15ul，转移至样本处理区。3. 加样（样本处理区）吸取10ul样本处理步骤中收集得到的RNA溶液及HCV定量标准品分别加入到上述反应管中（空白对照直接加入10ul洗脱液

11、），盖紧反应管管盖，连同Roche专用金属反应管套放在离心机中，于2000*g离心10秒，将毛细管转移到检测区。将毛细管排放好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。4. RT-PCR反应（检测区）4.1 循环条件设置ProgramCyclesTemperature摄氏度Incubation Time(min:sec)TemperatureTransitionRate( 摄氏度/sec)AcquisitionModeAnalysisMode1 1 50 30:00 20 NoneNone2 1 95 15:00 20 NoneNone3 45 95 00:05 20 NoneQuantifi

12、cation 50 00:30 20 Single 72 00:20 10None反应体系为25ul.具体设置方法请参照各仪器使用说明书。4.2 仪器检测通道选择选择F1检测通道：HCV内对照（IC）选择F2检测通道。4.3 样本的设定在扩增开始前条件设定时，将HCV定量标准品设为“Standard”并输入试剂盒内给定浓度值，待检样本和对照品设定为“Unknown”。结果分析条件设定1. 对HCV的曲线和HCV内对照（IC）的曲线进行分别分析。2. 分析方式选择Fit Points，基线调整选择Arithmetic,阈值（threshold）设定原则以阈值线刚好超过正常HCV阴性对照曲线的最高

13、点，且正常HCV阴性对照病毒滴度为0.0IU/ml为准。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。质控标准1. 将HCV定量标准品1-4的浓度值输入，仪器将自动以HCV定量标准品的浓度值为横坐标，以其实际测得的外标Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的拟和度绝对值应大于等于0.980，四个HCV定量标准品的Ct值都应<38.0，否则视为定量结果无效。2. HCV阴性对照、空白对照HCV RNA应为0.0IU/ml；HCV强阳性对照HCV RNA应为5.0E+05-1.0E+07IU/ml；HCV临界阳性对照应为1.0E+03-1.0E+05 IU/ml；且HCV阴性对照、HCV临界阳性对照中HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33，否则此次实验视为无效。所有实验从样本处理开始重做。结果判断1. 检测样本中1.0E+03 IU/ml小于等于HCV RNA小于等于5.0E+07 IU/ml，测定结果有效，可直接报告相应的浓度值。2. 检测样本中HCV RNA大于5.0E+07 IU/ml，可按实际测得值报告相应的病毒滴度，亦可将该样本用正常人血浆按10倍梯度稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。3. 检测样本中0.0IU/ml小于HCV RNA小于1.0E+03 IU/ml，且HCV内对照（IC）的Ct值