SDS聚丙烯酰胺凝..

1、一、实验目的 了解电泳实验原理 掌握电泳实验操作规程 学习用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质及测定蛋白质相对分子量的原理与技术二、电泳的基本原理电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或

2、提纯的技术。三、电泳的分类三、电泳的分类 从原理上：移界电泳（自由流电泳等），区带电泳（SDS-PAGE等），稳态电泳（等速电泳，等电聚焦（IEF）等），双向电泳等。 凝胶系统的均匀性：连续性凝胶电泳，不连续凝胶电泳 按外形：圆盘状电泳，水平板电泳，垂直板电泳及毛细管电泳等。 被分离的物质是否变性：非变性、变性（） 从载体上：自由流电泳，凝胶电泳，琼脂糖电泳，纸电泳等。：等电聚焦电泳等电聚焦电泳：SDS-PAGE 双向电泳后的凝胶双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维经染色后蛋白呈现二维分布图：分布图： 水平方向反映出蛋白水平方向反映出蛋白在在pI上的差异，上的差异，垂直方向反映出它们在垂直方向

3、反映出它们在分子量上的差别分子量上的差别。第一向电第一向电泳：等电泳：等电聚焦电泳聚焦电泳聚焦后凝聚焦后凝胶放置在胶放置在SDS凝胶凝胶上，进行上，进行第二向电第二向电泳泳第二向电泳：第二向电泳：SDS-PAGE分子量大分子量大分子分子量小量小pH9pH3pH9pH3大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点 （1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的支持介质是聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯丙烯酰胺酰胺(CH2=CHCONH2简称Acr)和交联剂N,N-N,N-甲叉双甲叉双丙烯酰

4、胺丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺四甲基乙二胺(简称TEMEDTEMED)和催催化剂过硫酸铵化剂过硫酸铵 (简称APAP)或核黄素核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶（其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节） ，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGEPAGE)。常用于蛋白质的定性分析，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 （2）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统。 （3）强还原剂可

5、以断开半胱氨酸残基之间的二硫键， SDS与蛋白质充分定量结合（平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,重量比约为1：1.4），以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构，消除了各种蛋白质本身电荷上的差异，从而使蛋白质电泳的速度只与蛋白质的分子量相关，而与蛋白质本身所带电荷无关。（4）由于具有浓缩效应、分子筛效应和电荷效应，使被分离物质在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。图4 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。（5）最后再利用特异性的颜色反应使蛋白质着色，这样就可

6、在凝胶中展现出蛋白质条带。2.蛋白质分子量测定原理 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率），并对各自分子量的对数（log MW）作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率），通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。 lg m=lg m0-KrT lg Rf=lg r0-KrT m和Rf是聚丙烯酰胺浓度为T%时的迁移率和相对迁移率。 m0和r0是假设当凝胶浓度T为0%时的自由迁移率和自由相对迁移率。直线的斜率为阻滞系数。Kr与凝胶系统的交联度、分子的形状和分子质量有

7、关。 迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算： =/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt 为迁移率（cm2V-1min-1）；为颗粒泳动速度（cms-1）；E 为电场强度（ Vcm-1）；d 为颗粒泳动的距离（cm）；l为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为通电时间（s或min）。通过测量d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率。 在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的化学特征常数 由于SDS与蛋白质的结合是成比例结合的，因此 lg mw=K-bX 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 M

8、W=66,200 兔肌动蛋白兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 标准分子量图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 图2 电泳迁移率与logMW之间的关系，其公式为log MW =K-bX 94 00062 00043 00031 00020 10014 400胶槽胶槽123注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白得到同行专家赞3.样品、仪器设备及试剂 （一）样品：透析的细胞色素C及纯化后的细胞色素C。 （二）仪器设备： 恒流恒压电泳仪及配套电泳槽； 冷冻离心机及离

9、心管； 制冰机； pH计； 真空机； 6取样器； 7. 进样器实验流程实验流程分离胶的制备分离胶的制备浓缩胶的制备浓缩胶的制备 加样加样 待分离样品的制备待分离样品的制备 电泳电泳剥胶剥胶 固定染色、洗脱固定染色、洗脱 准备仪器，配制试剂准备仪器，配制试剂4.实验步骤 1.准备仪器设备 2.配制试剂 3.样品处理 4.制备分离胶 5.制备浓缩胶 6.上样 7.电泳 8.染色 9.脱色 10.测量结果（1 1）准备仪器设备）准备仪器设备 1.1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, , 准备准备2 2个干净的个干净的锥形瓶锥形瓶. .2.2.把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶

10、支架上固定好. .固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板坏玻璃板. .（2）.配制试剂 1. 贮备液及工作溶液； 2.染色液； 3. 0.1的溴酚蓝水溶液；贮备液及工作溶液 1. 30%凝胶贮液 2. 分离胶buffer 3. 浓缩胶buffer 4. 电极缓冲液 5. 上样缓冲液 6. 10%的AP30%凝胶贮液 29.2g 丙烯酰胺丙烯酰胺Acrylamide, 0.8g 甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺Bisacrylamide, 加蒸馏水定容到加蒸馏水定容到100ml. 73g 丙烯酰胺丙烯酰胺Acrylamide, 2g 甲叉双丙烯酰胺甲

11、叉双丙烯酰胺Bisacrylamide, 加蒸馏水定容到加蒸馏水定容到250ml. 每大组1份浓缩胶buffer 每大组1份分离胶buffer每大组1份上样缓冲液每大组1份Tris-甘氨酸电极缓冲液（1L） 25mM Tris，3g 250mM 甘氨酸,14.4g (pH 8.3) 0.1% SDS,1g 每两小组1份固定液配方 40%甲醇 10%乙酸 50%水 每小组50ml10% Ammonium persulfate(fresh).4.8%浓缩胶（5ml） 30%凝胶贮液 0.8ml 浓缩胶Buffer 1.25ml 蒸馏水 2.95ml AP 20ul TEMED 5ul 每小组1份分

12、离胶(15ml) 30%凝胶贮液5.75ml 分离胶Buffer 3.75ml 蒸馏水5.5ml AP 40ul TEMED 10ul 每小组1份考马斯亮蓝G-250 50g硫酸胺 0.6gG-250 58ml磷酸 定容到400ml 再加100ml甲醇 每大组1份（3）.样品处理 A、标准蛋白质样品、标准蛋白质样品marker B、用样品缓冲液配制、用样品缓冲液配制1mg/ml的纯化蛋白质样品的纯化蛋白质样品 C、制备复杂样品、制备复杂样品 取叶片取叶片1g，加，加5ml样品缓冲液研磨，过滤，样品缓冲液研磨，过滤，12000rpm离心离心10min,取上清，备用。取上清，备用。将样品将样品A、

13、B、C都的沸水中加热都的沸水中加热10min,再置再置12000rpm离心离心10min,取上清，备用。取上清，备用。（4）制备分离胶 按比例配好分离胶按比例配好分离胶, ,用移液管快速加入用移液管快速加入, ,大约大约5 5厘厘米左右米左右, ,之后加少许蒸馏水之后加少许蒸馏水, ,静置静置4040分钟分钟. .凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速, , 催化剂催化剂TEMEDTEMED要在注胶要在注胶前再加入前再加入, ,否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶. .注胶过程最好一注胶过程最好一次性完成次性完成, ,避免产生气泡避免产生气泡. .水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排水封的目的是为

14、了使分离胶上延平直，并排除气泡除气泡凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面的界面. .（5 5）制备浓缩胶）制备浓缩胶倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干, ,按比例配按比例配好浓缩胶好浓缩胶, ,连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm5mm处处, ,迅迅速插入样梳速插入样梳, ,静置静置4040分钟分钟. . 样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入, ,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡, ,梳底梳底需水平需水平. .（6 6）加样）加样拔出样梳后拔出样梳后, ,在上槽内加入缓冲液在上槽内加入缓冲液, ,没过

15、锯齿时可取下梳子没过锯齿时可取下梳子. . 要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出, ,否则会影响加样效果否则会影响加样效果. .加样三个：加样三个： A A、5l标准蛋白溶解液标准蛋白溶解液B、 5l纯化标准样品纯化标准样品C、制备的复杂样品、制备的复杂样品10l用微量注射器距槽底三分之一处进样用微量注射器距槽底三分之一处进样, ,加样前加样前, ,样品在样品在 沸水中加热沸水中加热3 3分钟，去掉亚稳态聚合。分钟，去掉亚稳态聚合。 注射器不可过低注射器不可过低, ,以防刺破胶体以防刺破胶体, ,也不可过高也不可过高, ,在样下在样下 沉时会发生扩散沉时会发生扩散. . 为避免

16、边缘效应为避免边缘效应, ,最好选用中部的孔注样最好选用中部的孔注样. .（7）电泳 A、浓缩胶15mA/胶 B、分离胶25mA/胶 到距离底部5mm处停止，取出胶(8)固定染色与脱色 加固定液固定0.5h 水洗3次，每次15min 加染色液染色6h或过夜 水洗脱色至无背景（9）测量数据 A、指示剂迁移距离 B、不同分子量蛋白质迁移距离四、实验报告 、实验名称 、时间、地点 、任课教师 、学生姓名、学号、分组 、实验目的 、实验原理 、仪器、试剂 、实验步聚 、结果及计算 、分析及讨论 1：Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作 用，操作时应戴手套 2：玻璃管表面应光滑洁净，蔗糖溶液封住管

17、 底，否则会造成凝胶与玻璃管之间产生气 泡 3：尽量不要破坏胶面，否则样品区带不平整。五、注意事项五、注意事项 4：并非所有蛋白质的分子量都可以用这种方法准确测定。一些电荷异常及带有大的辅基的蛋白质分子的分子量无法准确测定。 5：有多个亚基的蛋白质分子量在测定时要结合其它方法。 六、参考资料 张龙翔等，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社 中国科学院上海植生所编，现代植物生理学实验指南，科学出版社 张龙翔等， 生化实验方法和技术（第1版），1981年，高教出版社 郭尧君，蛋白质电泳实验技术（第2版），2005，科学出版社 http/:61.index.php 样

18、品的浓缩效应：由于电泳基质的四个不连续性(即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性)，使样品在电泳开始时在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带(厚度为10-2cm)，而得以浓缩，然后再进行电泳分离。浓缩效应分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓分子筛效应。即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质分子，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。 此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面。而在柱层析方法中的分子筛作用，则是大分子通过凝胶颗粒之间

19、的缝隙先流出，而小分子则通过凝胶颗粒内的孔道后流出。电荷效应 蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多，泳动速度快，反之则慢。因此各种蛋白质就以一定的顺序排列戍一个一个的圆盘状。在进入分离胶中时，此种电荷效应仍起作用。凝胶层的不连续性层（或层）不同的凝胶，其作用如下 样品胶：为大孔胶，用光聚合法制备，样品预先加在其中再聚合，起防止对流的作用，避免样品跑到上面的缓冲液中。 浓缩胶：为大孔胶，用光聚合法（或化学聚合法）制备，有防对流作用。样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界

20、面上积聚成薄层。 分离胶：为小孔胶，一般采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离。也有防对流的作用。 蛋白质分子在大孔凝胶中受到的阻力小 移 动速度快。缓冲液离子的不连续性 在电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方向泳动,其迁移率大小不同，两种离子若能形成界面，则走在前面的离子称为快离子 (又称先行离子)，走在后面的离子称为慢离子(又称随后离子)。为使样品达到浓缩的目的需在电泳缓冲系统中加入有效迁移率大小不相同的两种离子。并使这两种离子在缓冲系统中组成不连续的两相。即在三层凝胶中加入快离子，在电极缓冲液中加入慢离子。 为了保持溶液的电中性及一定的PH，需加入一种与快、慢离子符号相反的离子称为缓冲配对离子。使缓冲配对离子分布于全部电泳缓冲系统中(即三层凝胶及电极缓冲液中)。例如分离蛋白质样品时通常用氯根(Cl-)为快离子，甘氨酸根负离子(NH2CH2COO-)为慢离子，采用三羟甲基氨基甲烷(简称Tris)作为缓冲配对离子。 电泳开始前，如图A所示，慢离子位于两个电极槽中，快离子分布在三层凝胶中，样品在样品凝胶中，缓冲配对离子位于全部系统中。 电泳进行中如图B所示，快离子与慢离子的界面向下移动，由于选择适当的pH缓冲液，使蛋白质样品的有效迁移率(有效迁移率 ，为迁移率，为解离度)介于快离子与慢离子的界面处，而浓缩成为极窄的区带。它们的有