宏基因组学在微生物活性物质筛选中的应用

1、=收稿日期>2010-04-09=基金项目>国家高技术研究与发展计划(863项目(2003AA62040;广东省科技计划项目(2007B011000007;南海水产研究所中央公益性科研院所基本科研业务费专项(2010TS01;中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室、广东省应用生物学重点实验室和广东省海洋药物重点实验室联合开放课题(L M B081008=作者简介>丁贤(1972-,男,博士生,从事微生物生化及其活性代谢文章编号:1005-376X(201006-0565-05=综 述>宏基因组学在微生物活性物质筛选中的应用丁贤1,2,殷波3,李慧贤2,杜纪坤2,周世

2、宁2(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州 510300;2.中山大学生命科学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室,广东广州 510275;3.中科院南海海洋研究所,广东广州 510301=摘要> 采用传统分离培养筛选微生物新活性物质的方法受到很大制约,自然界99%以上的微生物不能培养,其资源开发受到很大限制。环境微生物宏基因组技术应用避开了微生物分离纯培养问题,极大拓展了微生物资源的利用空间,增加获得新活性物质的机会和途径。本文着重介绍宏基因组的概念、研究策略包括DNA 提取、文库构建与筛选等及在微生物活性物质筛选中的应用,并对宏基因组研究中存在的问题进行探讨。=关键词&g

3、t; 宏基因组;未培养微生物;活性物质;筛选=中图分类号>Q 93 =文献标识码>AAdvance in the study of screening bioactive co mpounds fro m m icrobe by m etageno m-ic library m et hodDING X i a n 1,2,Y IN Bo 3,LIH u-i x ian 2,DU J-i kun2,ZHOU Sh-i n i n g2(1.South China Sea F isheries R eseach Instit ute of CAFS,Guangzhou 510300,

4、China ;2.S t ate K e y Labora t ory of B iocontro l ,S c hool of L i fe Science ,Sun Yat -sen University,Guangzhou 510275,China;3.Sout h Ch i na Sea Instit u te of O ceano logy,Chi -nese A cade my of Science ,Guangzhou 510301,China =Ab stract >It i s reported tha tm ore than 99%m icrobe species w

5、 ere non -cultured o r un -cu lt ured by t he trad iti ona lcu lti vation approach ,wh ich li m its d i scover i ng novel biocata l ysts(enzym esand bioacti ve co m pounds from m i croorgan i s m s .M etageno m ic li brary m ethod is a new or i entation of the develop m ent of gene tic eng i nee ri

6、ng and study i ng uncu ltured m icroor -g an i s m s .M etageno m e li braries w ere constructed w it h DNA ex tracted direc tly fro m sa m ples and transf o r m ed to appropr iate host .T he li brar i es w ere screened in d ifferent strateg i es such as sequence -driven or f uncti on -dr i ven sc r

7、eeni ngs for d ifferent nove l b i ocata l y sts (enzy m esand b i oactive co m pounds or i nteresting g enes re lated to t he ir synt hases .T hen ,it prov i des anew stra tegy for seeki ng nove l b i oactive com pounds and has a m plifi ed the space that m icrobe resource can be u tilized ,and enh

8、ances the oppo rt unity o f dicove ri ng nove l b i oac tive substances .T he notion and m ethods o f study i n m etagenom e ,i nclu -d i ng DNA ex tracti ng ,librar ies construc tion and screening w ere i ntroduced i n this paper .=K ey w ords > M etageno m e ;U n -cultured m icroo rganis m s ;B

9、 i oactive compounds ;Screening自从微生物被发现以来,其在治疗人类疾病和造福人类方面所发挥的重大作用及其具有的影响力促使微生物学家在研发微生物及其合成的生物活性物质上倾注了极大的精力,遵循传统的研发途径分离纯培养了许多微生物特别是土壤微生物菌株,开发了临床上得到广泛应用的多种抗生素、抗肿瘤药物、免疫调节剂和酶抑制剂等活性物质1,2。微生物提供的脂肽、脂蛋白、脂多糖和核酸工具酶等也已广泛应用于化工业、食品业和基因工程等领域。然而,日益积累和不断深入的研究表明,用传统方法研发筛选上述生物活性物质时,重复发现率高,重复投入劳动。所以,为了开发新活性物质,人们尽可能从极端

10、环境中收集样品,以期从中找到能合成新活性物质的微生物,但收效甚微。因此,研究方法的改进和创新成为迫切解决的问题。日用丰富的分子微生物生态学研究表明,海洋环境中存在大量未能培养微生物,约为总量的99%。但对环境微生物多样性缺乏认识和开发新活性物质的新技术和手段尚不具备。基于这一现实需求,认识微生物世界就成为十分必要和迫切,而宏基因组(m etagenome 的提出适应了这一研究技术创新的需要,开创了一个全新的微生物学研究方法,环境微生物因此而成为主要的研究和开发微生物资源的对象3。微生物学研究方法的巨大变革改变了很多微生物学家关于微生物和怎样去研究微生物的观点,激发了微生物研究方法上的一次革命。

11、其变革的支撑点就是基于这样一个事实即未培养微生物的规模远大于可培养的种类并且拥有研究这个未知世界的方法4。利用宏基因组首次通过异源基因组和相关环境的演化分析表明,微生物多样性的复杂程度远远大于传统方法得出的结论,筛选出具有潜在工业开发价值的酶或活性物质58。在本综述中,将宏基因组的研究流程、宏基因组文库的构建与筛选及其在微生物活性物质筛选中的应用等进行总结,并探讨一些存在的问题。1 宏基因组及其研究流程/M etageno m e 0由HANDELS MAN 等9(1998最先提出,其定义为/the geno m es of the tota l m icrob i o ta f ound i

12、 n nature 0,即特定环境境中全部微生物遗传物质的总和。国内学者将其译为/宏基因组0,文献中有/co ll ective genome 0、/env iron m en -ta l genom e 0等写法,现已基本统一采用/M etageno m e 0,主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和,包含可培养与未培养微生物的基因。由于不必经过微生物分离培养环节而避开了微生物单纯分离培养问题,极大拓宽了微生物资源的利用空间,增加获得新活性物质的机会和途径10。宏基因组学常用研究开发流程见图1。 图1 宏基因组学研究开发流程2 宏基因组文库构建与研究策略宏基因组本质上是对一些相似但不相同因

13、素的集合进行分析,是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术,它与群落基因组、环境基因组和种群基因组在研究方法上都有相似之处。其以微生物基因组学的迅速发展和聚合酶链式反应的广泛应用为基础,是统计学的理念在基因组学中的体现和应用。其目的将直接从环境中提取的基因组DNA (eDNA 克隆到适当载体上,构建宏基因组文库。最后运用不同的分析方法和手段筛选和分离感兴趣的基因,通过基因测序,推测活性产物结构,建立系统发生树等。宏基因组的研究方法理论上可以获得环境样品中所有微生物的基因组序列和活性产物的整个操纵子(O perons,为研究原核生物次生代谢产物的合成基因、调控基因及其调控机制等提供可行的技术

14、路线,为活性产物的大量异源表达及其生物合成提供有力的手段。PACE 等(1985提出将环境样品DNA 直接进行克隆的设想,而直到1991年才有SCHM I DT 等利用噬菌体作为载体进行直接克隆成功的报道。宏基因组通常的研究思路包括环境样品总DNA 提取、构建宏基因组文库、筛选感兴趣的目的基因、功能基因表达和产物的分子生化鉴定等。2.1 样品总DNA 提取 宏基因组分析从分离提取环境样品DNA 开始,提取DNA 的质量直接影响文库的构建和后续文库筛选。CENDR I N 等(1993和GARBOR 等(2003研究表明,样品中存在的杂质影响如腐殖酸类、金属离子和多糖等物质对核酸提取过程影响很大

15、,必须去除,否则分子克隆操作过程中多种酶的活性会受到影响甚至被强烈抑制。因此,获得高纯度、高分子量、高浓度的环境样品总DNA 是宏基因组文库构建的关键之一,需要尽可能地完全抽提出样品中总DNA 和保持其较大片段以获得完整的目的基因或基因簇。目前,研究人员已经提出并建立了多种DNA 提取方法。在多种提取DNA 的草案11相继被提出过程中,TOR S V I K 等研究小组为宏基因组学这个领域奠定了基础。目前用于土壤或沉积物等环境样品DNA 的分离提取主要是原位(i n situ溶菌法和异位(ex s it u溶菌法13。原位溶菌法将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理后抽提纯化,也称直接裂解法(D

16、 -i rect lysis extraction m ethod,适合用质粒(P l as m i ds或噬菌体(phage为载体克隆13。此法操作方便、成本较低、DNA 提取率高、偏差小,但由于机械剪切作用较强,导致所提取DNA 片段较小(150kb。FA EGR I 等(1977和TOR S V I K 等(1980采用异位溶菌法先分离黏附在土壤、沉积物等样品中的微生物细胞,再提取DNA,又称微生物细胞抽提法(Bacte -tia l ex tracti on m ethod。如采用尼可登介质密度梯度离心法分离微生物细胞,然后包埋于低熔点琼脂糖中裂解,脉冲场凝胶电泳回收DNA,该法适合柯

17、斯质粒(Co s m i ds或者细菌人工染色体(Bac teria l artificia l chromo so m e ,B A C为载体克隆,获得DNA 片段较大(20500kb,纯度高,但操作繁琐,成本较高,有些微生物在分离过程中可能丢失,甚至抽提不出一些细胞壁较厚的微生物DNA 。所以,在实验过程中采用哪一种实验方法取决于实验所要求的目的基因大小和研究目的。2.2 文库构建2.2.1 载体选择 DNA 提取后就可以构建文库。在文库构建过程中,载体是文库构建所必需的因素,而且在活性物质筛选是也发挥极其重要的作用。载体选择的原则主要考虑是否有利于目标基因扩增、表达及在筛选细胞毒类物质时

18、表达量的调控等。筛选目标物不同,其载体不同,筛选技术手段也有所不同。由于活性物质多是微生物的次生代谢物,其代谢途径由多基因调控。因此,有必要尽量插入大片段DNA 以获得完整的代谢途径多基因簇,以期达到预期目的。目前,多采用细菌人工染色体(BA C和粘粒(Cos m i d或Fos m i ds 载体。B A C 和Fos m i ds 载体文库自1992年引入后12,大大提高了基因组克隆的效率。M ICHELL 等构建了2个BAC 文库,包含超过1Gbp 的DNA,筛选和鉴定了几个阳性克隆,其所表达外源基因的表型包括脂肪酶活性、淀粉酶活性、抗菌活性及溶血活性。S H IZUYA 等(1992研

19、究表明用B A C 载体可插入片段和克隆能力较大(>300kb ,但克隆效率低;用Fo s m i ds 载体可插入中等大小片段(3852kb克隆,克隆效率较高13,14。上述载体在宿主菌中的稳定性高,但拷贝数较低,不利于宏基因扩增,表达量也较低。为了提高宏基因表达和重组克隆子的活性检测,甚至可直接利用表达载体构建宏基因组文库。表达载体可插入的宏基因片段一般较小(<10kb,筛选单一基因或小操纵子产物较适宜。正因为BAC 载体的载量大,其曾在人类基因组计划中发挥了巨大作用,其在宏基因组克隆中受到普遍关注。外源基因表达受宿主细胞的遗传类型、细胞基质、细胞生理状态及初级代谢产物等影响,

20、利用穿梭载体可扩大宿主范围有利于提高外源基因表达。基于此,H andels m an 实验室以pBe l oBAC II 为骨架构建的superB A C -X 载体系列,添加各种复制原点,调控其拷贝数及宿主范围,促进外源基因的表达及其表达量调控。2.2.2宿主选择宿主在筛选目标物的过程中起到至关重要的作用。选择宿主主要考虑重组体在宿主细胞中的稳定性、转化效率、宏基因表达量、筛选的目标性状缺陷型(如溶血或抗菌等因素。GUNNAR HAGEL I NA等(2004和OUW E-HAND等(1998指出,微生物种类不同,其所产生的活性物质类型明显不同。因此,应结合不同的研究目的和筛选不同的活性物质

21、考虑选择与其相适应的宿主菌株。利用宏基因组技术克隆表达外源基因通常有3种菌株可作为原核生物反应器即大肠埃希菌(E.coli、恶臭假单胞菌(P seudomonas pu ti da和链霉菌属(Strep to m yces spp。大肠埃希菌作为成熟的基因克隆表达受体细胞,是研究宏基因组的首选宿主菌。如紫色杆菌素(V i o l ace i nc等在大肠埃希菌中的成功表达12。然而由于E.co li的原核性,很多真核生物基因不能在其中表达出具有活性的功能蛋白。因此,大肠埃希菌适合表达低GC含量启动子、小片段基因,不适合高G C含量启动子的抗生素基因簇类大片段基因的表达。恶臭假单胞菌是次生代谢产

22、物的产生者,可以通过基因重组获得链霉菌噬菌体的插入位点,接受链霉菌BAC穿梭载体克隆并稳定表达15。有人尝试用一些革兰阴性菌如荧光假单胞菌(P seudo m onas sp.构建环境样品基因组文库。如果这些尝试成为现实,则这些新宿主的开发将会极大促进筛选效率的提高,但还没有查到目前成功的文献报告。链霉菌属编码次生代谢产物合成的基因以基因簇的形式存在,表达受到细胞信号交流和信号转导的调控,具备天然的抗生素产生机制16。COURTO IS等(2003研究表明,利用变铅链霉菌(Strep tonzyces livi dans作为宿主鉴定有关新抗生素合成的基因。SALOM ON等(2004和S HE

23、N等(2001在链霉菌中表达出一些聚酮和非核糖体肽、杂合抗生素。这些已经存在的生物合成途径构成了外源基因簇适应宿主的分子基础。目前,链霉菌在宏基因组研究中,是次生代谢产物异源表达最合适的生物反应器,受到研究者的广泛关注并试图以此筛选目的物基因。3活性物质文库筛选在传统的生物活性物质筛选程序中,获得的混合物需要活性化合物分离、提纯和鉴定等系列后续处理。高品质的活性物质分析需要培养或发酵,产生某种活性物质的细菌在发酵时其合成能力可能会受到影响,甚至丧失。应用宏基因组技术进行筛选时,由于合成该物质的基因携带在一定载体上,几乎没有丢失功能的可能性。活性物质文库筛选以类似功能互补为基础,克服了发酵限制,

24、其实质是细菌之间通用某些功能基因及其表达调控子,所以优越于传统筛选。应用宏基因组技术筛选活性物质时,根据研究目的不同,可从以下不同水平设计不同的筛选方案。生物活性水平筛选就是异源表达宏基因组文库基因。HENNE等(1999根据重组克隆产生的功能产物筛选出抗生素、抗肿瘤物质、酶17,18、黑色素19等阳性克隆。在此基础上测序和进行生化或活性分析。这种筛选又称功能驱动筛选(function-driven screening。该策略能够快速鉴定目标克隆,发现全新的目标活性物或基因,开发具有应用潜力的克隆子。不足之处在于:它首先要求在宿主菌中表达感兴趣的功能并表达这一功能所需的所有基因;它还受能否找到

25、一种适合大型文库的快速、有效的分析方法制约20。因为活性克隆的出现频率非常低,工作量大,经常在一轮筛选中分析上万个克隆子只能检测少数几个有活性的克隆,甚至没有。这种筛选压力迫使人们去开发新的表达宿主菌和高通量、高灵敏度的筛选方法,或构建新载体和启动子以便更有效的转录插入的环境基因组DNA。DNA序列水平筛选就是根据已知相关功能基因的序列设计保守DNA杂交探针或PCR引物,通过杂交或PCR扩增筛选宏基因组文库中感兴趣的序列,又称序列驱动筛选(sequence-dri ven screeni ng。也可直接对文库中的所有克隆进行测序,也可挑选若干克隆进行随机测序,然后运用生物信息学手段进行分析和推

26、断,但费用较大,且直接随机测序虽然缺少目的导向性。然而,从宏基因组文库中人为地选取部分克隆测序,得到的数据足以做出假设,也取得不少重大发现21。TY S ON等报道了一个几乎完整来源于一嗜酸性生物膜的宏基因组,有可能鉴定一大批能够在极端条件下发挥功用的生物催化剂基因。KN IET SC H等(2003根据已知脱水酶基因的保守序列设计一对简并PCR引物,扩增宏基因组DNA,扩增产物制作探针与宏基因组文库进行杂交,筛选两个高甘油脱水酶和,l3-丙二醇脱水酶活性的克隆子。对聚酮合成酶(PK S和非核糖体肽合成酶(NRPS的研究也例证了该方法的可行性21。FR I A S-LO PEZ等22利用随机鸟

27、枪法测序在一种高度多样性的微生物被膜中,获得了约5000种新的基因序列。上述研究方法的有效性,能对研究的环境基因组结构探知一二和鉴定较多感兴趣的生物催化剂基因等。该策略有可能筛选到某一类物质中的新分子,有可能利用基因芯片技术大大提高筛选效率,但前提是必须了解相关基因的序列。这些筛选的新鉴定和假定的基因功能性还有待生化试验的进一步验证。序列分析需要分子生物学技术和生物信息学软件的支持。目前已有多种分子生物学技术应用于宏基因组序列分析,如DNA芯片(DNA m-i croa rray,差异显示(D iff e renti a l d i s-play,稳定同位素探针(Stab le i so to

28、pe prob i ng,荧光原位杂交(F luorescence i n situhybr i d i zati on,F IS H,基因陷阱(G ene trap等。生物信息学方法也在序列分析中起到重要的作用,如VENTER等23对马尾藻海(Sargasso Sea表面海水的宏基因组进行了1.6G b DNA序列测定,通过生物信息学软件分析,进行基因组组装,从而发现了148种新的微生物和782种光受体。并从宏基因组的序列中分析得到了A lternative ox i dase (AOX和P lastoqu i nol term i na l ox i dase(PTOX两种酶的功能基因。化

29、合物结构水平的筛选就是根据在一定条件下,物质结构不同,其在色谱中峰值不同进行的。通过比较转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图筛选产生新结构化合物的克隆子。如WANG等(2000等通过对重组克隆子的细胞抽提物与对照宿主细胞抽提物的高压液相色谱图谱进行比较,发现了2个产生新结构化合物的克隆,获得了5种全新的小分子抗菌化合物。该策略可直接筛选到新结构化合物,但不一定有生物活性,且工作量大,成本高。4微生物活性物质筛选现状目前,研究人员已经利用功能和序列为基础的方法通过宏基因组鉴定了多个新型生物催化剂(酶或抗菌活性物质,具有潜在的工业开发利用价值。最近的研究表明,环境宏基因组的研究主要

30、集中在筛选新的功能基因上,如抗生素和一些与生物合成相关的基因簇(见表1。表1宏基因组文库筛选的酶或抗菌活性物质活性类型文献淀粉酶SAR I KA等(2010黑色素HUANG等(2009核酸酶、抗菌STEI N等(1996,BE J A(2004生物素合成酶KRSEK等(1999淀粉酶、琼脂糖酶、酰胺酶P ATRICK等(2002抗菌W REN等(2003抗菌V I GD I S等(1978四环素抗性COURTOIS等(2003几丁质酶M ARTI N(2004脂肪酶/酯酶W REN等(2003肽合成酶SCHM E I SSER等(2003紫色杆菌素GALVAO等(2006晴水解酶SCH LOS

31、S等(2003蛋白酶E SCHENFELDT等(2009,2001葡糖酸还原酶GUPTA等(2002纤维素酶HEALY等(1995DNA聚合酶SCH LEPER等(19975微生物多样性及其群落结构研究随着分子生物技术的不断发展,宏基因组学技术逐渐成为研究微生物多样性及其群落结构的又一得力技术手段。宏基因组提供的大量基因信息对环境中不可培养微生物进行系统发育和功能研究所提供可能24。鸟枪法获得的Sarg asso Sea海水宏基因组序列(约1.0Gbp,通过分析发现1800余种基因组中有近148个属于全新的细菌门类25。从沙地生态系统、森林土壤和深海环境样品中提取总DNA构建的大片段文库,通过

32、对古细菌多样性研究发现,其存在更丰富的微生物资源26。TY SON等(2004通过研究生长在流动的酸矿外排液表面的嗜酸生物膜的群落结构及其代谢途径,从中鉴定出L e p tosp ir illu m group II和F errop las ma t ype II近乎完全的基因组和3个基因组的部分序列,并根据微生物之间基因功能互补揭示出它们的碳氮固定和产能的代谢过程。KRUG ER等研究了西北黑海岩的微生物群落(该群落在厌氧条件下进行甲烷氧化产能,鉴定出占提取蛋白总量7%的镍蛋白,进一步的生化分析显示镍蛋白可能对厌氧条件下催化甲烷氧化起着关键的作用27。所以,宏基因组学技术的发展为认识可培养微

33、生物和99%未可培养微生物所构成的复杂生境及其功能提供了可能,在研究生物多样性中发挥重要作用,也将为探寻复杂微生物群落中的感应信号分子及其基因调节机制,探知微生物物种在群落中的功能打下基础28。6展望微生物蕴藏着巨大的基因多样性,宏基因组学技术充分利用了生物学和生物技术等手段,使人们有可能挖掘和利用占微生物种类99%以上的传统途径触及不到的丰富资源。宏基因组技术改变了微生物学家解决很多问题的思路,丰富和拓展了对微生物世界多样性的认识,加速了新基因的发现,从复杂环境的文库中鉴定了一些具有潜在的工业应用价值的新酶、抗生素和其他一些产物6,2930。但宏基因组研究开发依赖于文库构建和分析技术的进步等

34、多元的分析方法。随着技术的不断发展和进步,宏基因组学技术必将成为微生物活性物质筛选的重要手段并发挥越来越大的作用,造福人类。=参考文献>1PELLI GRI N I A,T HOM AS U,W I LD P,et a.l Bact erici dal activities ofl ysozy m e and ap roti n i n agai n st gra m negati ve and gra m pos i ti ve b acteri rel ated to their bas i c characterJ.J App l B acteri o,l1992,72(3: 18

35、0-187.2GUNNAR H,I NGER O,Raknes a A,et a.l Preparative h i gh-perf or m-an ce li qu i d chro m atograph ic s eparati on and anal ys i s of the M alt aci ne co m plex-a fa m ily of cycli c p epti de anti b i oti cs fro m Ba cill u s subtilisJ.J C hro m atog B,2004,811(2:243-251.3LORENZ P,SCHLEPER C.M

36、 et ageno m ea challengi ng source ofen z ym e discoveryJ.J M olC at al B E nzy m,2002,19(2:13-19. 4P ACE N R.Open i ng t he door on t o t he nat u ralm icrob i alw orl d:mo l ecu-l ar m icrob i al ecologyJ.H arvey L ect,1995-1996,91:59-78.5DI AZ-TORRES M L,M CNAB R,SPRATT D A,et a.l Novel tetracy-c

37、li ne res i stan ce det er m i nant f ro m t h e oralm et ageno m eJ.An ti m icrob Agen ts C he m other,2003,47(4:1430-1432.6G I LLESPI E D E,BRAD Y S F,BETTER M ANN A D.Isolati on of an t-ib i oti cs turbo m yci n A and B fro m a m etageno m ic li brary of soilm icrob i alDNAJ.A pp l Environ M icro

38、b io,l2002,68(9:4301-4306.7KN I ETSCH A,BO W I EN S,WH I TED G,et a.l Iden tifi cati on and char-acteri zation of coen z y m e B12-dependen t glycero l dehyd ratase-and d i ol dehydratase-encod i ng gen es from m et ageno m ic DNA li b raries deri ved fro m enrichm ent cu lt uresJ.App l Env i ron M

39、icrob io,l2003,69(6: 3048-3060.8LORENZ P,LI EBETON K,N I EHAUS K,et a.l Screening for novel en-zy m es f or b i ocatal yti c processes:acces s i ng t h e m etageno m e as a re-sou rce of novel f un cti onal sequen ce s paceJ.Cu rr Op i n B i otechno,l 2002,13(6:572-577.9HANDELS M AN J,RONDON M R,BRA

40、D Y S F,et a1.M olecu l ar b i o-l ogical access to the che m i stry of unkn o w n soilm icrobes:a ne w fron tierf or nat u ral p roductsJ.C he m B i o,l1998,5(10:245-249.10RONDON M R,AUGUST P R,BETTER M ANN A D,et a.l C lon i ngt h e s o ilm etagen o m e:a s trat egy for access i ng t h e genetic a

41、nd f unctionald i versity of un cu l tured m icroorgan is m sJ.Appl Env i ron M icrob i o,l2000,66(6:2541-2547.11KRSEK M,W ELL I NGTON E M.C o m paris on of d ifferent m et hod s fort h e isol ation and purifi cati on of t otal co mmun it y DNA from soilJ.J M icrob i olM et h ods,1999,39(1:1-16.12BE

42、 J A O.To BAC or n ot t o BAC:m ari ne ecogen o m icsJ.Cu rr O pi nB i otechno1,2004,15(3:187-190.13STEI N J L,M ARS H T L,WU K Y,et a1.Characteri zation of uncu lt-ivated p rokaryotes:isol ati on and anal ysis of a40-k ilobase-p ai r geno m e frag m en t fro m a p l ank t onic mari n e archaeonJ.J

43、Bacteri o,l1996,178(3:591-599.14BRADY S F,CHAO C J,HANDELSMAN J,et a.l C l on i ng and heter-ologous exp ress i on of a nat u ral product b i oayu t heti c gen e cl u ster fro m eDNAJ.OrgLen,2001,3(13:1981-1984.15M ARTI NEZ A,KOLVEK S J,Y I P C L,et a1.Genetically m od ifi edbacteri al strai n s and

44、 novel bact eri al artifici al ch ro m oso m e s hu ttle vec-t ors f or con structi ng environm en tsl li braries and detecti ng heterol ogoua natural p roducts i n mu lti p l e expression hostsJ.App l Environ M icro-b i o,l2004,70(4:2452.16M ARTI N J F.Ph osphate con trol of the b i osynthesis of a

45、n ti b i oti cs andother secondary m etabolites i s m ed i ated by the Pho R-PhoP s yste m:an un fi n is hed st oryJ.J Bacteri a,l2004,186(16:5197.17TANJ A W,STEPHANIE R,ROLF D.Is o l ation and characterizati on ofm etall oproteas es w it h a novel do m ai n stru cture by construction and screen i n

46、g ofm etageno m i c li b rariesJ.App lE nviron M i crob io,l2009, 75(8:2506-2516.18SARI KA S,F ARRAH G K,GHUL AM N.M ol ecu l ar clon i ng and char-acteriz ati on of a my l as e fro m soil m etagen o m ic li brary derived fro m N orthw estern H i m alayasJ.A pp l M i crob i o l B i otec hno,l2010,DO

47、 I19HUANG Y L,LA I X T,H E X C,et a.l Ch aracteriz ati on of a deep-seased i m entm etageno m ic cl one that p rodues w ater sol ub l e m elan i n i n E.coliJ.M ari ne B i otechno,l2009,11(1:124-131.20SCHLOSS P D,HANDELS M AN J.B i otec hno l og i cal pros p ects fro mm etageno m icsJ.Cu rr Op i n B

48、 i otechno,l2003,14(3:303-310. 21LILES M R,M SNAKE B F,B I NTR I M S B,et a1.A cen s us of r RNAgenes and li nk ed geno m i c s equ ences w it h i n a s o ilm et ageno m ic li brary J.App lE nviron M i crob i o,l2003,69(5:2684-2691.22FRI AS-LOPEZ J,S H I Y,TYSON G W,et a1.M i crob i a l co mmun it y

49、gene express i on i n ocean surf ace w atersJ.P NAS,2008,105(10: 3805-3810.23VENTER J C,RE M I NGTON K,HE I DELBERG J F,et a1.E nviron-m en t a l genom e s hot gun sequen ci ng of the Sargasso S eaJ.Science, 2004,304(2:66-74.24VOGET S,LEGGE W IE C,UESBECK A,et a1.Prospecti ng f or novelb iocatal yst

50、s in a s o ilm et agenom eJ.App l Environ M i crob i o,l2003,69(10:6235-6242.25CRA I G VENTER J,KARI N R,J OHN F,et a1.Environm en talgeno m es hotgun sequenci ng of t he sargass o seaJ.S ci en ce,2004,304 (5667:66-74.26HENNE A,DAN I EL R,SEHM ITZ R A,et a1.Con strueti on of env-ironm entalDNA li br

51、ari es i n E sc h eri ehia coli and screen i ng f or the pres-en ce of genes conferri ng utili zation of4-hydroxybu tyrateJ.App lE n-viron M icrob i o,l1999,65(9:3901-3907.27KR UGERM,M EYERD I ERKS A,G I DCKNER F O,et aI.A con s p icu-ou s n ic k el protei n i n m i crob ialmats t h at oxidizem etha

52、ne anaerob i call y J.Nat u re,2003,426(6968:878-888.28LEE C M,YEO Y S,LEE J H,et a1.Id entifi cati on of a novel4-hyd roxyphenylpyruvate d i oxygenase fro m t he soilm et ageno m eJ.B i o-ch e m B i ophys Res Comm un,2008,370(2:322-326.29E SCHENFELDT W H,STOLS L,ROSENBAUM H,et a.l DNA fro muncu lt

53、u red organ i s m s as a s ou rce of2,5-d i keto-D-gl ucon i c aci d redu c-t asesJ.Appl Environ M icrob i o,l2001,67(9:4206-4214.30GUPTA R,BEG Q K,LORENZ P.Bact eri a l al k ali ne proteas es:m o-lecu l ar approaches and i ndu stri al appli cati on sJ.App lM i crob i ol B i o-techno,l2002,59(1:15-3

54、2.31HEALY F G,RAY R M,ALDR I CH H C,et a.l D irect i sol ati on off uncti onal genes en cod i ng cell u l as es fro m the m i crob ial consorti a i n at h er m oph ilic,anaerob i c d i gesterm aintai ned on lignocell u l oseJ.A pp l M icrob i ol B i otechno,l1995,43(4:667-674.(上接第562页生6,促进肝细胞的再生,有利于肝功能的恢复。本实验表明整肠生通过调节肠道菌群的平衡,能够降低酒精性肝炎患者同型半胱氨酸水平,对酒精肝炎患者的肝功能恢复有积极的意义。=参考文献>1曾民德,陆伦根.酒精性肝病的治疗J.胃肠病学和肝病学杂志,2000,9(3:164-168.oscl er R