生物科学系毕业论文正文的要求

1、生物科学系毕业论文正文的要求（一）基本格式(1).封面； (2).目录； (3).中、英文摘要； (4).正文；(5).致谢； (6).参考文献；（二）论文文字书写基本要求（1）论文字数大于6000字；（2）书写和表格设计规范；（3）标点符号、语法正确，无错别字；（4）语句通顺、流畅； （5）思路清晰，叙述简明扼要；（6）重点突出；（三）论文正文质量 （1）选题科学； （2）实验设计合理；（3）能熟练运用本专业的“三基”，分析问题，解决问题；（4）论证严密、结构严谨、逻辑性强；（5）数据可信、处理正确；（6）讨论充分、了解学科的发展前沿；（7）结论正确 （四）论文创新 （1）达到一定水平，具有

2、理论或实践应用价值；（2）结论见解独到，具有学科前瞻性；生物科学系毕业论文排版格式要求书写格式：字体：宋体，字号：四号3.文题力求简明、醒目,反映出文章的主题;中文文题一般以不超过20个汉字为宜,并附有与之对应的英文文题文题书写格式： 字体：黑体加粗，字号：小二号，居中英文文题书写格式： 字体：Time new Roman，字号：小二号，居中4.中英文摘要，按结构式书写，限600字左右，依次为：目的(Objective)、方法(Methods)、结果(Results)、结论(Conclusion)摘要正文书写格式： 中文 字体：宋体（其中摘要、目的、方法、结果、结论以宋体加粗），字号 ：小四号

3、，左对齐英文 字体: Time new Roman，字号：小四号，段落：1.5倍行距，左对齐例：【摘要】目的：，方法：，结果：，结论：。【Abstracts】Objective：，Methods：，Results：，Conclusion：。5.关键词一般为35个，尽可能采用中国医学主题词表 (1993年再版)中所列的中、英文词 关键词书写格式： 字体：宋体，字号：小四号 ，左对齐,两个关键词之间用分号（；）分隔6.正文标题序号编排用阿拉伯数字，前言不编号1 材料和方法（一级标题书写格式： 字体：宋体加粗，字号：小四，左对齐）1.1 （二、三级标题书写格式： 字体：宋体加粗，字号：小四，左对齐）

4、 正文书写格式： 字体：宋体，字号：小四，段落：首行缩进 2字符7.表格按统计学制表原则设计，尽量使用三线表，在表的上方标注表序和表题。表格书写格式：字体：宋体加粗，字号：五号，居中例：表1 3中抗生素对50种菌株杆菌的8.插图依文中出现的先后排序，如图1.图2，有图题及图说明9.参考文献著录格式采用顺序编码制，以之中出现顺序排序。参考文献的序号在文中引用处用阿拉伯数字置于右上方方括号内。以10篇为宜。文献书写格式：字体：宋体，字号：五号，段落：1.5倍行距，左对齐期刊作者（凡13位作者列出全部作者姓名，3位作者以上，只列前3名，后家“等”或“et al”）.文题.刊名（外文刊名缩写按Inde

5、x Medicus格式），年份，卷（期）：起止页1陈琳，陈德松.MRI在腕血管综合症诊断中的应用.解剖与临床，2003，8（1）：562Cohen IK. Can collagen metabolism becontrolled: Theoretical consideration. JTrauma, 1985,25(4):4104113专著中析出的文献 作者.题名.见（In）：原文献责任者.书名.版次.出版地：出版者，出版年.起止页4Giessen WJ, Wermans WR, Rensing BJ, etal. Restenosis clinical and angiographic d

6、efinitions of restenosis recommendatios forclinicaltrials. In: Schwarttz RS, ed. Coronary restenosis. Boston: Blackwell Scientific Publication, 1993. 169191蚌埠医学院毕 业 论 文 题目： 姓 名： 专 业： 年 级： 学 号： 指导教师： 蚌埠医学院教务处制年 月 日目 录一、中文摘要、关键词 二、英文摘要、关键词 三、论文正文 前言 范文实例：以下为一毕业论文的范文，供同学们书写时候进行格式参考。HLA 1分子在胃癌中的表达机制摘 要目

7、的：肿瘤细胞表达HLA (human leukocyte antigen) 分子是激发肿瘤抗原特异性CTL (cytotoxic T lymphocytes) 进行肿瘤免疫治疗的关键，其中肿瘤细胞中HLA I类分子表达异常是肿瘤逃逸机体免疫监视的重要机制之一。本研究探讨胃癌组织中HLA I类抗原及相关分子的表达情况，检测HLA基因区域微卫星DNA的杂合性丢失 (loss of heterozygosity; LOH)，并分析它们的相关性。为研究胃癌中HLA I类分子的异常表达机制提供理论依据。方法：首先应用4种HLA相关分子单抗，采用免疫组化的方法（ABC法）检测胃癌石蜡组织标本中HLA I类

8、及相关分子的表达情况，统计分析各分子表达与临床分期及病理分级的相关性。同时应用5种HLA I类分子相关抗体，采用冰冻切片免疫组化的方法，检测新鲜胃癌组织中HLA I类分子的表达情况，并应用微卫星多态性分析技术检测胃癌组织中6p HLA及15q 2m (2-microglobulin) 基因区域的LOH。结果：在组织学水平，185例胃癌石蜡切片中HLA I类分子表达异常，HLA I类分子B/C位点下调率41%，丢失率22%；A位点下调率32%，丢失率19%。其中B/C位点的表达与肿瘤分期相关，且随着胃癌分化程度的降低逐渐下调。20例淋巴结转移灶中，有8例（40%）HLA I类分子表达低于原发癌。

9、与癌旁组织比较，50例新鲜胃癌组织冰冻切片中 rs36）；应用微卫星多态性分析技术发现，胃癌组织HLA基因区域发生LOH的频率为18.3%，2m%。HLA区域内各位点LOH的频率分别为：D6S1618,16%；D6S291,12%；D6S273,15%；D6S265,15%；D6S105,34%；D6S276,16%。所研究病例未见有6号染色体完全丢失现象的存在。与2m基因紧密相邻的两个微卫星位点，其LOH频率分别为：D15S-126，18%；D15S-209，11%。其中与HLA I类分子重链基因紧密相邻的D6s-105位点LOH频率最高（34.2%）。结论：在胃癌组织中，存在着明显的HLA

10、 I类分子表达下调或缺失，且重链各分子与HLA I类分子表达下调密切相关（P<0.05），淋巴结转移病例HLA I类分子表达下调或丢失高于原发癌。通过HLA I类各分子的表达与相应位点LOH的对比分析，大部分HLA I类各分子与癌旁组织相比表达一致或增强者未发生LOH，表达下调或阴性者则发生了LOH，特别是与HLA重链基因区域紧密相邻的微卫星位点发生LOH的频率最高，说明HLA重链基因区域微卫星DNA的LOH可能影响了HLA重链各分子的表达，并进一步影响了HLA I类分子在细胞表面的完整性表达。本研究显示HLA重链基因区域的LOH是影响胃癌组织HLA I类分子异常表达的重要机制之一。关键

11、词：胃癌；HLA I类抗原；免疫组化；杂合性丢失The mechanism of HLA class I molecules expressed abnormally in gastric cancer ABSTRACTObjective： Pathogenesis of tumors and anti-tumor immune response in host has attracted a lot of attention. HLA class I molecules play a critical role in the antigen processing, presenting an

12、d special recognition of tumor cells by cytotoxic T lymphocytes (CTL). There is a general consensus that the abnormal expression of HLA class I molecules reflects the escape mechanism of tumor cells and it is pivotal to excite tumor antigen-special CTL to carry through immune therapy for the express

13、ion of HLA class I molecules in tumor cells surface. We discussed the expression of HLA class I molecules in gastric cancer tissues and detected the LOH of microsatellite DNA at HLA gene region, which provided a theory basis for studying the abnormal expression mechanism of HLA class I molecules in

14、gastric cancer.Methods：185 formalin-fixed paraffin-embeded tumor tissues, 22 corresponding autologous normal specimens and 20 lymphnode metastatic cases were tested using 4 monoclonal antibodies (mAbs) by meanings of immunohistochemical technique (ABC method); 50 OCT-embeded fresh gastric cancer and

15、 corresponding normal tissues, which were made into freezing slice, were tested applying 5 monoclonal antibodies (mAbs) by the same method, and analyzed of the LOH frequency at HLA (6p) and 2m (15q) gene region by microsatellite polymorphic analysis technology.Results：HLA class I antigens were obvio

16、usly downregulated (A locus 41%, B/C locus 32%) and lost (A locus 22%, B/C locus 19%) in 185 formalin-fixed paraffin-embeded gastric cancer tissues, and the downregulated expression of B/C locus is significantly associated with pathological grade （p<0.05）. In 20 lymphnode metastatic cases, 8 case

17、s show downregulated expression of HLA class I antigens compared with the primary tumor. HLA class I antigens were also obviously downregulated in 50 OCT-embeded fresh gastric cancer compared with corresponding normal tissues (P<0.05). The downregulated expression is correlated with heavy chain m

18、olecules especially HLA-B/C locus. It was accordant to the results of the paraffin-embeded tissues. The LOH frequency of HLA gene region is 18.3% in gastric cancer and the highest is D6s105 (34.2%). The individual LOH frequency for the six intra-MHC markers was: D6S1618, 16%; D6S291, 12%; D6S273, 15

19、%; D6S265, 15%; D6S105, 34%; D6S276, 16%. It was not seen about loss of the whole chromosome 6 in the studied samples. The LOH frequency of 2m gene is 14.5%. D15S-126 and D15S-209, next to2m, was 18% and 11% respectively.Conclusion：expression of HLA class I antigens is obviously downregulated in gas

20、tric cancer, and which is more obvious in lymphnode metastatic cases than the ）. In order to elucidate the mechanism, we extended our study to detect LOH (loss of heterozigosity) of microsatellite DNA at HLA gene region in gastric cancer and compared HLA class I molecules expression with LOH in corr

21、esponding locus, the results indicate that the majority of the tumors with positive expression of HLA class I have no allelic loss at all informative loci, the tumors with weak or negative expression show LOH for at least one locus. However, it can be concluded that LOH of HLA class I heavy chains w

22、as one of the mechanisms that lead to abnormally expression of HLA class I molecules and provided the tumor cells with a way to escape immune surveillance in gastric cancer. But, it is not benefit for T-cell based treat of tumor.Key words： gastric cancer; HLA class I; LOH; Immunohistochemistry 前 言HL

23、A复合体位于1，全长约3600kb，占人体整个基因组的1/30001，是迄今所知最复杂的人类基因复合体。本研究所涉及的是经典HLA I类基因及免疫功能相关基因中的抗原递呈相关基因。HLA分子不仅参与移植排斥反应，而且在免疫细胞的发育和应答过程中发挥更为重要的作用。近20年来的研究表明，HLA I类分子具有重要的免疫生物学功能2：一方面，HLA I类分子直接参与抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）对内源性抗原的加工和处理；另一方面，在TCR (T cell receptor) 特异性识别APC递呈的抗原肽过程中，必须同时识别与抗原肽结合成复合物的HLA分子，才能

24、产生激活T细胞的活化信号，这就是所谓的MHC限制性。HLA复合体通过参与抗原递呈、制约免疫细胞间的相互作用、控制机体免疫应答的发生及强度等多个方面参与免疫调节。可以想象，HLA I类分子抗原递呈途径中任何一个环节发生异常，都会影响HLA I类抗原的表达及机体正常的免疫功能。多年来，国内外的研究已经证实在许多肿瘤中发现HLA I类抗原表达降低或缺失，使肿瘤细胞不能被CTL识别和杀伤，逃避宿主的免疫攻击得以生存和发展。肿瘤细胞HLA I类抗原表达降低有多种类型3，研究表明，在各型肿瘤中全部HLA I类分子降低的频率从16-50%不等，HLA I类基因位点或等位基因的选择性降低的频率也不同（4-35

25、%）。研究还发现各型肿瘤的转移瘤中HLA I类抗原降低的频率也不同（37-69%），并且转移灶比原发灶降低的频率更高。为此在第13届国际组织相容性抗原会议上成立了一个工作组（IHWG），组织有关实验室利用一套标准的试剂和方法以研究各型肿瘤HLA I类抗原降低的频率，并通过肿瘤的组织病理学特征、病程和HLA I类抗原表达水平的关系来评价各型肿瘤HLA I类抗原降低或缺失的临床意义。研究发现在多种类型的人类肿瘤中HLA I类抗原和/或TAP表达的降低与肿瘤的级别、病程以及预后不良的标志(如病灶的厚度、疾病的阶段、发病间隔和生存期等)有关4。通过病程分析CTL对肿瘤细胞的反应显示,复发的病灶中CTL

26、识别所需的HLA I类限制性成分出现进行性的丢失5；在早期对T细胞免疫治疗有效的病人中,其复发的转移瘤的HLA I类抗原已丢失6。因此,应根据肿瘤细胞抗原加工机制和HLA I类抗原表达和功能的完整与否来选择病人进行T细胞免疫治疗。肿瘤细胞上HLA I类分子异常表达的分子基础是多样的，主要体现在（1）基因水平的改变。 如在结肠癌，肺癌和恶性黑色素瘤中发现2m基因的点突变或大片段的缺失而导致HLA I类分子的异常表达7-9；染色体不分离或有丝分裂的错误重组所引起HLA I类等位基因选择性降低。已经证实杂合性丢失可以通过影响HLA分子的表达参与到肿瘤发生的机制之中10。由于HLA基因的复杂性，目前的

27、研究多用微卫星DNA作为遗传标记研究HLA基因的LOH。在已有研究中，不同的肿瘤中HLA基因杂合性丢失的频率不同，且数据相差较大(宫颈癌 50%，头颈部鳞状细胞癌 49%, 结肠癌13.8%, 喉癌 17.6%, 黑色素瘤 15.3%)11。已经发现一条6号染色体的部分或全部丢失是导致HLA单倍型丢失的主要原因12-13。（2）转录水平调节缺陷而导致HLA I类分子特异性位点的下调14-16。Griffion等发现黑色素瘤细胞系中ISRE (interferon stimulate reaction element; ISRE) 结合的转录因子改变引起HLAI类分子B抗原的表达下调。（3）抗原

28、加工递呈的缺陷。Restifo等17首先在小细胞肺癌细胞系中描述了肿瘤细胞抗原加工的缺陷，发现由于TAP1和TAP2的降低而导致抗原的加工和递呈过程发生缺陷。肿瘤细胞中LMP2或LMP7缺陷对HLA I类抗原表达的影响是微妙的。它可改变HLA I类分子传递的抗原肽类型而不影响HLA I类抗原的表达水平18。最新的调查结果表明，全世界胃癌的发病率和死亡率均居于首位，在我国，尽管在过去的20年中，由于医学的发展，癌肿总体死亡率有所降低，但胃癌的5年存活率仍然很低，严重影响了病人的生活质量。为进一步提高胃癌患者的存活率，需要深入了解胃癌的病因学及其发展过程，并积极研究相应的肿瘤免疫治疗策略。关于胃癌

29、中HLA分子表达情况的研究，在80年代末及90年代初国内外已有报道。但因为抗体的限制，研究不够系统、全面，涉及到分子机制领域的研究甚少。而关于胃癌中HLA及2m基因区域等位基因LOH的研究，国内外均未见报道。基于此，我们利用石蜡切片的免疫组化技术对临床标本进行回顾性研究，探讨胃癌中HLA I类及相关分子的异常表达情况，同时利用第13届“HLA表达和肿瘤”国际组织相容性工作组大会上确立的一套研究LOH所需要最低数目的STR及技术标准和定义LOH的准则19，检测胃癌组织HLA和2m基因区域异常丢失的情况。这不仅有利于进一步理解肿瘤的免疫逃避机制，而且对提高肿瘤细胞表面HLA I类分子的表达、增强免

30、疫治疗的效果，为今后成功进行肿瘤的分子免疫治疗提供实验依据。1材料和方法1.1材料临床标本185例原发性胃癌标本取自南京××医院及××市第一人民医院1994年至2002年手术切除标本，常规石蜡包埋，切片，经病理医师明确诊断。男性148例，女性37例，年龄2780岁。其中22例有癌旁胃粘膜组织，20例有淋巴结转移标本。50例原发性胃癌新鲜手术标本取自20022003年南京××医院、××省肿瘤医院及××市第一人民医院，包括其相应的正常组织，立即用OCT包埋，液氮速冻，-700C冰箱冻存备用。全部病例

31、经病理诊断明确。1. 主要试剂【所用的所有试剂均可记述，且注明规格、生产厂家】1） 单克隆抗体应用于石蜡组织免疫组化的单克隆抗体：HC10 (抗HLA-B/C)、HCA2（抗HLA -A）工作浓度均为1:100，L368（抗2m）和SY-1（抗LMP2）的工作浓度分别为1:50和1:200，无关抗体MK2-23的工作浓度为1:100。应用于冰冻组织免疫组化的单克隆抗体：LGIII-147.4.1（抗HLA-A）、B（抗HLA-B/C）、TP25.99.8.4（抗HLA-A，B，C）、L368（抗2m）工作浓度均为1:20，W6/32（抗HLA I类分子复合物）工作浓度为1:50。所有鼠单抗为美

32、国S.Ferrone博士惠赠2） ABC试剂盒 （美国Vector公司产品，含有正常马血清、生物素标记的马抗鼠二抗、Avidin、Biotin）3） DAB试剂盒 （美国Vector公司）4） Harris苏木素液：苏木色精g，钾明矾50g，氧化汞（均为上海化学试剂公司产品），无水乙醇25ml，冰醋酸20ml，蒸馏水500ml。将苏木色精溶于纯乙醇中，加入预先已溶解钾明矾的蒸馏水中，使溶液尽快沸腾后，将火焰熄灭或稍有火，慢慢加入氧化汞，防止溶液溅出，稍煮。将烧瓶立即浸入冷水中，当溶液冷却后，加入醋酸。5） PBS（PH=7.4）：Na2HPO4.12H2O ， NaH2PO4.2H2O ，Na

33、Cl ，加蒸馏水至1000ml，调PH至7.4。6） 柠檬酸盐抗原修复缓冲液：80ml dH2O中溶解 NaCl和柠檬酸三钠，调节PH至6.0，加dH2O定容至100ml。7） Tween-20 8） 中性树胶（福州迈新）：加入少许二甲苯。9） 多聚赖氨酸（福州迈新）：用蒸馏水配制10%多聚赖氨酸。10）其他均为国产分析纯。1.1.3 主要仪器及材料【所用的所有仪器均可记述，且注明厂家】1） 切片机 （美国Reichert HistoSTAT）2） 孵箱 （隔水式电热恒温培养箱）3） 电热恒温鼓风干燥箱 （上海精宏实验设备有限公司）4） 冰箱 （中国海尔）5） 显微镜 （日本OLYMPUS）6

34、） 天平 （上海天平仪器厂）7） 耐高温塑料染色架 （福州迈新）8） 免疫组化染色孵育盒（自制）9） 免疫组化笔 （日本PAP Pen）10）磨砂载玻片方法【要详细记述说使用的方法，这点与发表论文有些不同。】 组织切片处理载玻片预先清洗后用10%多聚赖氨酸处理5分钟，烤干备用。石蜡组织切片厚度为4m，捞片后放入600C烤箱中23 h，室温保存备用。新鲜胃癌组织经OCT包埋，固定，修块后切片，冰冻切片厚度为46m，室温干燥30 min，40C冷丙酮固定后-20保存备用。 石蜡切片免疫组化染色步骤1） 石蜡切片脱蜡水化：组织切片60 烘箱烤片20 min，二甲苯 3×5 min ，100

35、%乙醇 1×5 min，100%乙醇 1×1 min，95%乙醇 2×1 min，70%乙醇 1×1 min，过水，PBS冲洗 3×3 min。2） 每张片子加一滴或50 l 3% H2O2，以阻断内源性过氧化物酶的活性室温15 min。3） PBS冲洗3×5 min。 ml柠檬酸盐缓冲液+450 ml H20）的烧杯中，中火15 min，解冻8 min。将烧杯取出，浸入冷水中（不可将玻片从缓冲液中取出冷却）。5） PBS冲洗，将切片组织周围擦干，用免疫组化笔画圈，稍干。6） PBS冲洗3×5 min。7） 每张片子加一滴或

36、50 l的2%正常马血清，室温30 min。8） 每张片子加一滴或50 l的一抗，370C 60 min或40C过夜。9） PBST（0.03% Tween-20+ PBS）冲洗3×5 min。 10）每张片子加一滴或50 l生物素标记的马抗鼠二抗（用PBS稀释为1：200），370C 60 min。11） PBST冲洗3×5 min。12） 每张片子加一滴或50 l亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（A 20l + B 20l +PBS 1 ml，用前半小时配），370C 30 min。 13） PBST冲洗1×5 min，PBS冲洗2×5 min。14

37、） 每张片子加2滴新鲜配制的DAB溶液，镜下观察染色深浅， 染好立即中止,用自来水轻柔冲洗15 min。15） 苏木素复染，自来水冲洗泛兰，1%盐酸酒精分化，自来水冲洗10分钟，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 冰冻切片免疫组化染色步骤冰冻切片46 m，室温放置30 min后，入4丙酮固定20 min，PBST冲洗，5 min×3。用3%过氧化氢孵育10 min，消除内源性过氧化物酶的活性。PBST冲洗，5 min×3，下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。 判断标准石蜡切片：阳性为棕黄色或棕褐色。计数着色细胞数和染色强度（两人单独计数）：整张切片中着色的癌细胞或癌旁细

38、胞的百分数>75%、7525%、<25%分别为阳性、弱阳性和阴性，染色强度分为强、弱和无，两种计分结果相加综合打分为、±、。相邻正常结构（如淋巴和内皮细胞）可作为内对照来评价细胞的染色强度，无关抗体MK2-23作阴性对照。坏死的胃癌细胞不计数。注：本实验结果判定方法是按照第12届国际组织相容性大会上确定的统一标准47 。冰冻切片：染色结果分别由两人按以下标准判断，以组织中淋巴细胞作为阳性参照对象，再根据肿瘤细胞是否被染色，分为阴性和阳性，阳性分成+，+，+三个等级，染色强度为淡黄色，棕黄色，深棕色，分别记分为0，1，2，3。部分肿瘤组织染色不均一，根据肿瘤组织阳性面积计算

39、，阳性面积25%，按阴性计算；阳性面积75%，按阳性计算;在两者之间，根据其染色强度减0.5（该标准参照Lopez-nevot的方法48）。 统计学分析根据以上标准，结合临床病理资料进行分期、分级（TNM分级根据1987年制定的标准），统计每组各抗原的表达水平，用SAS 6.12软件对资料用列联表卡方检验进行统计分析。2结果【根据实验的结果，分为几个部分分别书写，图文并茂，加入适当的表格。图、表的说明要规范！】 石蜡组织切片表达情况染色结果显示：胃癌及癌旁组织细胞染色较均一，间质（内皮细胞、淋巴细胞）均表达阳性。HC10和HCA2染色以膜为主，2m表达为膜浆型，以膜为主，而LMP2则表达在胞浆

40、中(图1-6)。在22例癌旁胃粘膜组织中，大部分HLA I，2m和LMP2表达为阳性，只有4例（18%）HLA I类分子表达阴性。与癌旁组织相比，HLA I类分子有明显的表达下调或缺失，B/C位点最显著（见表1）。2m和LMP2有表达下调或缺失，但与I 类分子的下调或丢失无统计学意义。表1 HLA I类抗原及相关分子在胃癌中的表达情况HLA-B/CHLA-A2mLMP237%49%55%73%±41%32%32%22%22%19%13%5%+：表达正常； ±：表达下调； ：表达缺失 冰冻组织切片表达情况50例新鲜胃癌组织切片中淋巴细胞都表达HLA I类各分子，成为本实验良好

41、的内参照。HLA各分子均表达在细胞浆或细胞膜表面，呈黄色或淡黄色（如图8-15），其表达情况同石蜡组织切片基本一致。胃癌组织中HLA I类各分子的表达与癌旁组织相比表达下调显著（图7），且HLA I类重链各分子及I类分子复合物表达下调有显著性差异（P<0.05见表2）。2m表达也呈下调趋势，但无统计学意义（P>0.05）。表2 胃癌及癌旁组织中HLA I类各分子的表达情况HLA-AHLA-B/CHLA-A,B,C2m W6/32癌旁组织胃癌组织P应用偏相关分析，HLA重链各分子与HLA I类分子表达下调显著相关，尤以HLA-B/C位点显著（P<0.05，相关系数rs=0.82

42、36见表3）。2m与HLA I类分子表达下调之间的相关性未见有统计学意义（P>0.05）。表3 胃癌中HLA I类各分子与HLA I类分子复合物之间的关系HLA-AHLA-B/CHLA-A，B，C2mW6/32rsrsrsrs 图1 癌旁胃粘膜HLA-B/C抗原阳性染色 图2 胃癌HLA-A抗原阳性染色膜型 ABC 法 400× 膜型 ABC 法400× 图3胃癌 LMP2抗原 阳性染色 图4淋巴结转移灶 HLA-A抗原阴性染色ABC 法 400×浆型 （淋巴细胞阳性）ABC法 100× 图5 2m抗原阳性染色 图6 MK2-23 阴性对照膜浆型

43、ABC 法 400X ABC 法 100X图7 胃癌中HLA I类分子的表达 图8 HLA I类分子复合物胃癌阴性染色 图9 HLA-A，B，C 抗原胃癌阴性染色癌旁胃黏膜阳性染色 癌旁胃黏膜阳性染色 ABC法 100 × ABC法 100 × 图10 2m抗原胃癌组织表达阴性 图11 2m抗原胃癌组织表达阳性间质表达阳性 ABC法 100 × ABC法 100 × 图12 HLA-B/C抗原胃癌组织表达阳性 图13 HAL-B/C抗原胃癌组织表达阴性ABC法 100 × 间质表达阳性 ABC法 100 × 图14 HLA-A抗原胃癌

44、组织表达阳性 图15 MK2-23 阴性对照ABC法 100 × ABC法 100 ×3讨论【围绕几个要点进行。参考论据要围绕你要说明的论点展开论述，切忌无病呻吟，不切合主题。同时讨论要深入，不要肤浅而显得太简单。】从八十年代后期开始，Ferrone A, Lopez-Nenot MA, Teh M等陆续报导了胃癌中HLA分子的表达情况及其与病理学分型，临床预后的关系。但同其它肿瘤一样，由于各实验室所用的方法和试剂的不同，结论不尽一致，也不利于互相比较和归纳总结。为此，第十二届国际组织相容性抗原会议(IHWG)成立了“HLA表达与肿瘤”工作组，组织有关实验室利用一套标准的试

45、剂和方法以研究各型肿瘤的HLA抗原的改变频率。并通过肿瘤的组织病理学特征，病程和HLA抗原表达水平的关系来评价各型肿瘤原发灶和转移灶中HLA抗原改变的临床意义。目前，国际上关于HLA分子在不同肿瘤中低表达或失表达的文献较多，主要的结论有以下几点：(1)HLA I类分子在许多肿瘤中有低表达或失表达的现象。主要形式有5种3： I类分子全部失表达或低表达：可能与2m蛋白合成，抗原肽转运蛋白，MHC基因结构缺陷有关，这类表型的细胞系有淋巴细胞系Daudi，黑色素瘤FO-1，结肠癌COVO。 I类分子单倍型失表达：很少见，可能与染色体不分离和有丝分裂重组有关。 A、B、C、TAP、LMP等位点选择性失表

46、达：黑色素瘤HLA-B7下调与原癌基因c-myc的转录增加有关，可干扰HLA-B在启动子水平的转录。这种类型能被细胞因子治疗所逆转。 I类分子某些特定等位基因选择性失表达：可能由于点突变、HLA基因部分缺失或基因断裂重组的结果，不能被细胞因子治疗所逆转。 复合表型：不能归纳为以上4种情况者。例如在转移的黑色素瘤上仅发现有HLA-A24表达10，另外还发现了HLA-B下调和HLA-A缺失造成的新表型33。(2)HLA I类分子全部失表达以及特定位点选择性失表达的频率在不同种肿瘤中有差异（16-50%），在子宫颈癌、前列腺癌和黑色素瘤中失表达的频率高于头颈部癌、乳房癌、肺癌和结肠癌。(3)HLA

47、I类分子低表达的发生机制在不同肿瘤和个体中不同，主要涉及两方面：（1）基因突变或大片段缺失及表达调控异常；（2）抗原加工异常：TAP失表达会导致A、B、C在胞内不能与抗原肽结合，从而不能表达于细胞膜上；LMP失表达对A、B、C的表达水平无明显影响，但可改变它们提呈的多肽谱18。(4)HLA I类分子和TAP的低表达常常预示着肿瘤的临床进程加快和预后不良。如：在多种肿瘤中，I类分子和TAP在转移癌组织中低表达频率明显高于原位癌组织；在黑色素瘤组织中，已证实它们的低表达与预后不良的判断指标（如原位癌组织的厚度、疾病的进展阶段、无症状的间歇期长短和存活率等）相关。(5) 在黑色素瘤的研究中表明：HL

48、A I类分子的低表达在体外培养中能导致肿瘤细胞对T细胞和NK细胞的敏感性丧失或降低；在体内，低表达能明显影响病人进行T细胞免疫治疗的效果。如在几个黑色素瘤病人中，HLA表达正常的原位癌阶段，T细胞免疫治疗的效果相当满意。当转移复发后，T细胞疗法则收效甚微。因此国际HLA工作组建议：在选择病人进行T细胞免疫治疗时，应常规检测癌组织中HLA I类分子的表达情况，把HLA低表达程度和功能的完整性作为是否治疗的标准。本实验室利用IHWG提供的标准方法和试剂对江苏省185例胃癌石蜡标本和50例新鲜胃癌组织标本进行免疫组化染色，探讨HLA抗原及相关分子在胃癌组织中的表达及意义，其中胃癌石蜡标本部分数据已在

49、第十三届国际组织相容性抗原会议上报导49。结果显示，石蜡与冰冻组织切片的免疫组化染色结果基本一致。本研究用存档的石蜡组织进行免疫组化分析,方法简便,结果满意,使研究者能够获得丰富的材料进行回顾性研究,不受标本来源的限制,值得推广和应用。我们还对50例胃癌及相应癌旁组织的冰冻切片进行了免疫组化分析。已知HLA I类分子复合物是三聚体分子，细胞表面HLA I类分子复合物结构的完整性，是判断其是否具有功能的关键因素之一。能够准确、充分体现HLA I类分子复合物表达情况的单克隆抗体是W6/32，该抗体仅适用于冰冻组织切片，且新鲜组织的冰冻切片相对于石蜡组织切片，无须抗原修复等相应特殊步骤的处理，对组织

50、抗原的破坏性小，其结果更加真实、可靠。此外，其他抗体均是位点特异性的单克隆抗体，不能真实地反映HLA I类分子结构和功能的完整性。更为重要的是，同例胃癌组织冰冻切片免疫组化与HLA基因区域LOH的综合分析，对阐明胃癌组织HLA I类及相关分子异常表达机制提供了良好的实验依据。关于正常胃粘膜上皮HLA分子的表达存在争议。本实验胃癌石蜡组织与冰冻切片中，大部分癌旁胃粘膜上皮HLA I类抗原表达阳性，着色均一。这与Klein B50, 张宏博51等的结论一致，但Lopez-Nenot MA48等认为其表达弱且不均一。结果的差异可能与各实验室所选用的方法、试剂和判定标准不同有关。此外，由于HLA的表达

51、存在个体的差异性，某些个别病例并不能反应正常胃粘膜HLA分子表达的整体情况。因此，我们的研究结果表明正常胃粘膜HLA I类及相关分子的表达是稳定、均一的。胃癌细胞HLA I类及相关分子表达有明显的下调或缺失。细胞表面的HLA I类分子是由重链、轻链和抗原肽共同组成的三元复合体，重链、轻链基因突变或I类分子依赖的抗原加工递呈分子缺陷均可导致I类抗原表达下调或缺失。本实验显示，胃癌中HLA重链各分子和HLA I类分子复合物表达下调显著，而且重链各分子与HLA I类分子复合物表达下调密切相关，尤以HLA-B/C抗原显著（P<0.05）。轻链和一种抗原加工分子LMP2的改变较少，且与I类抗原的下

52、调和丢失无统计学意义。这些数据表明HLA重链各分子可能是影响胃癌中HLA I类分子异常表达的重要因素之一。胃癌细胞HLA I类抗原表达与病理学类型有关。随着腺癌分化程度的增高，HLA-I类分子表达下调和缺失率减低。185例胃癌石蜡组织中，HLA-B/C位点的表达下调与病理学分期相关，低分化腺癌的下调率显著高于高分化腺癌（P<0.05）。分化程度是组织成熟度的标志，分化低的癌组织，HLA I类分子表达下调及缺失率高，易于逃避宿主的T细胞杀伤，可能是分化程度低的癌细胞更易于扩散和转移的原因之一。50例新鲜胃癌组织冰冻切片免疫组化结果显示，HLA I类各分子表达水平与肿瘤分化程度无明显相关性（

53、P >0.05）。可能与我们的样本例数较少，所用的抗体，组织材料的差异有关。基于目前的实验资料，只能就HLA分子表达与病理分级、临床分期的关系做一趋势性分析，如有可能应扩大样本量作进一步研究。此外，在20例原发胃癌转移灶中，40%病例HLA I类分子的表达均弱于原发癌。在头颈部恶性肿瘤，乳腺癌，肺癌等肿瘤中也存在这样的现象52，说明在机体的免疫选择作用下，HLA分子表达下调或丢失的肿瘤更容易逃避免疫攻击，发生远处转移。本研究中，我们对石蜡和冰冻组织切片的免疫组织化学染色结果采用了不同的判断标准进行统计学分析，因为我们所收集的185例胃癌石蜡标本，仅有20例相应的癌旁组织，按照第12届国际

54、组织相容性大会上确定的统一判定标准，了解胃癌组织HLA及相关分子的表达情况，无须相应的癌旁组织，其结果同样是安全可靠的。但是，为了与同例胃癌组织LOH的结果相对应，我们对50例胃癌及相应癌旁组织的冰冻切片采用了Lopez-nevot改良的方法作为判断标准，它不仅使我们可以了解肿瘤组织HLA及其相关分子的表达情况，同时对于了解正常胃粘膜上皮HLA及其相关分子的表达有一定的帮助。更为重要的是，依据Lopez-nevot改良的方法，对HLA I类分子在胃癌及相应癌旁组织中的表达强度和表达面积进行综合对比分析，更能充分体现其表达的差异性，并且成为同例胃癌组织HLA及2m基因区域等位基因LOH强有力的支持依据。免疫组化技术53是近十年发展很快的原位杂交检测蛋白表达水平的技术。随着单抗的大量涌现，其应用领域从新鲜组织的冰冻切片扩展到病理存档的石蜡切片，并以其快捷性、方便性、应