肿瘤分子生物学讲义

1、肿瘤分子生物学第一节 概述一、肿瘤及肿瘤分子生物学的概念肿瘤（tumor）是一类疾病的总称，它们的基本特征是细胞增殖与凋亡失控，扩张性增生形成新生物。肿瘤可分为良性肿瘤（benign tumor）和恶性肿瘤（malignant tumor）。良性肿瘤生长缓慢，虽可增长至相当大的体积，但仍保留正常细胞的某些特性，通常在瘤体外有完整的包膜，手术切除后患者预后良好。绝大多数良性肿瘤基本上是无害的，不引起或很少引起宿主损伤。不过有极少数良性肿瘤因其靠近生命中枢或能合成大量生物活性物质也可能杀伤宿主。例如，脑膜上生长缓慢的良性肿瘤通过压迫使得生命中枢萎缩破坏，最终导致宿主死亡；胰岛细胞良性肿瘤可以分泌大

2、量胰岛素而引起体内胰岛素过量，导致低血糖和死亡。恶性肿瘤统称为癌症（cancer），它不同于良性肿瘤的最重要的特性是能侵袭周围组织，疾病晚期癌细胞发生远端转移，破坏受侵袭的脏器，最终使机体衰亡，但如能在侵袭转移前切除癌瘤，一般预后明显改善。由于技术水平的限制，目前临床诊断的癌症患者多处于中晚期。加上不良生活方式如吸烟、过度饮酒、不合理饮食习惯，以及环境污染增加等因素，在刚过去的20世纪，世界各国许多常见癌症的发病率在总体上呈上升趋势，或维持在高水平，在我国的情况亦大致如此。目前除几种较少见的癌症如妇科的宫颈癌、绒癌等的死亡率有明显下降外，多数常见恶性肿瘤死亡率还处于令人忧心的高位态势下。有研究

3、者预测，在21世纪癌症仍将是危害人类健康的主要疾病之一，故应引起预防、临床和基础研究者的高度关注。恶性肿瘤几乎在所有类型的细胞中均可发生。根据组织学来源，癌症的起源可分为三种：癌（carcinoma）起源于上皮细胞，大部分成人癌症属此类；淋巴瘤起源于脾和淋巴结等的淋巴细胞；肉瘤（sarcoma）起源于间叶组织如结缔组织、骨和肌肉等。以上在各种实质性组织、脏器中发生的癌症属实体肿瘤（solid tumor）。白血病起源于骨髓造血细胞，恶性细胞存在于流动的血液中，属液体肿瘤（liquid tumor）。肿瘤分子生物学，就是用分子生物学的理论和技术来研究肿瘤的一门科学，是医学和生物学的一门交叉学科二

4、、肿瘤的生物学特征1、癌症是体细胞遗传病就本质而论，癌症是一种遗传学疾病或体细胞遗传学疾病，可简称为遗传病。在癌细胞中发生的遗传学变异有：基因内的碱基替代、缺失、插入和基因扩增等，以及染色体的数量和结构的改变，如非整倍体、易位等；表遗传学改变有：DNA甲基化型式改变、组蛋白修饰和染色质改型等。这些改变引起了肿瘤抑制基因灭活和原癌基因的活化，它们所产生的恶性表型通过有丝分裂能在细胞世代间传递。上述过程均发生在体细胞，这是占全部癌症中绝大多数的、散发性癌症的发生模式。遗传性癌综合征不同于其他一些遗传病，它遗传的仅是癌易感性，还需要体细胞的多次击中才能产生恶性表型。基因组内存在两类癌相关基因：一类基

5、因直接调控细胞增殖与凋亡、运动与黏着，以及细胞基质的改型等，并参与细胞的信号转导，结果得以维持正常组织细胞的自稳性。当这些基因缺陷造成上述过程失衡，随着细胞各种恶性特征的积累，最终癌症发生。这些基因包括癌基因、肿瘤抑制基因中把关基因（gatekeeper gene）；另一类基因并不直接调控细胞的增殖和凋亡，而是影响第一类癌相关基因的突变速率的管护基因（caretaker gene），这包括各类DNA修复基因，还包括代谢酶多态性在内的一组修饰基因（modifier gene）。2、癌细胞的恶性生物学特征（1） 失去了对中止细胞增殖信号和细胞分化信号的反应，并可传出自主的细胞生长、增殖信号。（2）

6、 逃避了细胞凋亡和衰老，是细胞永生。当正常细胞受到严重损伤和营养缺乏时，就发生凋亡并自动解体；而癌细胞并不一定会发生凋亡。体外培养的正常细胞，即使没有受到损伤，约分裂50后也会自动停止分裂，最终细胞死亡（细胞衰老）；而癌细胞能无限制地增殖，获得了永生化。这可能与调控细胞凋亡基因的缺陷和端粒酶恢复活性相关；有作者认为，细胞增殖的失控与必需的凋亡抑制相结合，构成了进一步恶性演进的最小平台。（3） 失去细胞的区域性限制，具有了侵袭和转移能力。例如在体外培养的正常细胞中增殖至彼此接触时，就停止生长和分裂（结出抑制），故细胞呈单层生长，而癌细胞失去了接触抑制，继续分裂而呈多层重叠生长；同时癌细胞表面的识

7、别能力和黏着性发生了改变，使癌细胞不能像不同的正常组织细胞那样保持彼此分开，而能侵入临近组织。（4） 自主的血管生成能力，这保证了肿瘤体积增大后和新形成转移肿瘤的血液供应，以维持癌细胞生长和增殖之所需。上述这些癌细胞的恶性特性，使它们能在没有增殖信号的情况下，自主地无限制增殖，当达到一定的体积时就可能侵袭邻近组织，癌细胞还可能脱落进入血液和淋巴液，发生远端转移并扩增，最终导致宿主死亡。3、癌的单克隆起源和异质性除少数例外，癌是原始的、单个癌细胞增殖的后代，即癌为单克隆起源。这一观点已被普遍接受，部分是依据来自X染色体上基因表达的观察。妇女有两条X染色体，在卵裂的后期其中一条X染色体随机失活，如

8、一位基因杂合子的妇女患癌，若是多克隆起源，癌细胞则可能有两种等位基因表达的产物；若是单克隆起源，则癌细胞仅有一种等位基因表达产物，而研究结果证实了癌为单克隆起源。由于与DNA修复和细胞分裂等一系列相关基因的缺陷，使癌细胞基因组和染色体的稳定性下降，于是在肿瘤演进过程中，就可能不断产生新的癌细胞干系，它们彼此间免疫系统和治疗等因子作用下，如不能被全部杀灭，就可能选择了恶性程度更高的癌细胞干系，它们继续重复突变、扩增和选择的过程，给治疗带来困难。三、常见肿瘤概述1. 乳腺癌乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女患乳腺癌。北美和北欧国家乳腺癌发病率最高，亚、非地区最低，南美及拉丁美

9、洲居中。发达国家的发病率明显高于发展中国家。在国内，沿海发达地区发病率高于内陆地区，上海市为全国乳腺癌发病率最高的省份。乳腺癌通常表现为一个无痛的小包块，此病在2030岁十分罕见，但在绝经期和绝经期后发病率明显升高。乳房产生泌乳腺泡的干细胞群定位于小导管，也存留于老年人乳房的纤维间质中，这些干细胞是肿瘤发生的靶细胞。大多数乳腺癌就发生于这些腺泡小导管，大致可以有以下几种情况：绝大多数乳腺癌发展成无痛性孤立小结节，但有些小导管中的乳腺癌，则在小结节开始长大而尚未形成包块前，随血流从乳头渗出。随着乳腺癌的生长，浸润周围组织，最终使深部组织和皮肤粘连固定，从而引起皮肤凹陷，状似酒窝，如果侵袭乳头会造

10、成乳头凹陷。癌肿进一步发展后，首先转移到腋窝淋巴结，然后再转移到肺、胸膜、脊柱和骨盆。患者通常需要取少量组织活检，亦即对瘤块组织进行冰冻切片检查。如果确诊是癌，可能就要切除乳房和腋窝淋巴结。仔细彻底检查这些活检标本，可以确定疾病的分期和乳腺癌的分型。分期非常重要，因为如果肿瘤未发生转移，通常可以治愈；如果累及的淋巴结超过两个，患者的预后就很差；如果转移的腋窝淋巴结少于两个，则愈后良好，治愈率可达50%。2. 肺癌肺癌是人类常见的恶性肿瘤之一。从临床着眼，肺癌可分为两种治疗的类群和四种组织学类型：肺鳞癌、肺腺癌、大细胞肺癌合称为非小细胞肺癌（NSCLC），另一类为小细胞肺癌（SCLC）。NSCL

11、C约占全部肺癌的75%，SCLC约占肺癌的25%。这两个类群肺癌均与吸烟有密切的关系。各类群肺癌的治疗方法都不太理想，这反映在其死亡率较高。每一类群肺癌初始诊断几乎都基于慢性咳漱、发热、呼吸困难、咳血、嘶哑或胸痛，而且患者常有长期吸烟史。NSCLC治疗成功的关键在于早期手术，因为其转移发生较晚。NSCLC的初始诊断处于早期，5年生存率近于75%；如初始诊断为不能切除的NSCLC，可用化疗或放疗，5年生存率为5%。SCLC的临床过程、治疗方法和对治疗的反应不同于NSCLC，它是实体瘤中最易转移的，而且很易致死。这种癌的播散发生早，手术很少作为主要方法。治疗主要靠联合化疗，无转移的病例可附加胸部照

12、射。SCLC最初对这种治疗很敏感，但常常发生复发和抗性，2年生存率约为1424%。3. 肝癌肝癌相关病因的研究中，黄曲霉毒素、酒精的长期摄入，抗结核等药物的医源性损伤，饮食中硒、钼等微量元素的缺乏，以及饮水污染等也属于肝癌发生的重要相关环境因子。肝细胞癌能合成-甲胎蛋白，这是一种有用的肝癌标志物。肝癌可以是单个病灶，也可以是多个病灶，与周围的正常肝脏组织界限分明。有两种组织类型：一种由分化较好的肝细胞（肝实质细胞）组成，肝细胞排列在小梁（结缔组织纤维索）中，其中间为肝血窦（微小静脉）。其中有许多肿瘤细胞是功能性的，因为有一些结节能被胆汁染色（肿瘤的胆小管不与正常的胆管相连），而且含有多种可以通

13、过组织化学方法检测出来的肝酶。另一种肝细胞癌是由小胆管发生的间变性腺癌。4. 胃癌胃癌也是严重威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，我国每年胃癌新发病例占全部恶性肿瘤发病的17.2%，死亡率占全部肿瘤的20%以上，二者均高居首位。胃癌的临床分型分为早期胃癌和进展期胃癌。早期胃癌指癌组织限于黏膜层和黏膜下层，不论有无淋巴结的转移（亦有学者认为只要有淋巴结转移即应视为进展期）。对处于早期胃癌的始发阶段，直径小于5mm的胃癌称为微胃癌，介于510mm的为小胃癌，统称为微小胃癌，微小胃癌的术后10年生存率可达100%，说明早诊断早治疗在临床上的重要意义。进展期胃癌指癌组织浸润已达肌层或浆膜，故亦称为中、晚期

14、胃癌，其中对局限于肌层者为中期，超出肌层者为晚期。胃癌的组织分型中的Lauren分型法将胃癌只分为肠型和弥漫型两种，肠型胃癌主要由类似肠道柱状细胞的腺上皮所组成，可伴有刷状缘，在有的病例中还可见杯状细胞，肠化时柱状细胞有黏液分泌，肿瘤附近的黏膜亦有广泛肠化，肿瘤的边界较清楚，恶性度相对较低；弥漫型胃癌可呈腺管状排列，但细胞黏着力差，癌细胞易形成对胃壁的广泛而弥漫浸润，许多细胞含黏液，呈典型印戒形，肿瘤边界不清。肠型胃癌常见于胃癌高发区人群，老人及男性多见，分化程度较高，术后预后相对较好；弥漫型胃癌多见于非胃癌高发区病人，常见于青壮年，恶性度高，预后较差。总体上讲，临床以肠型为多，相对弥漫型而言

15、，肠型胃癌有一个相对较为清楚的发生发展过程。5. 白血病白血病是由于造血干、祖细胞发生恶变，失去进一步分化、成熟的能力，使细胞阻滞在不同的造血阶段，从而导致一组异质性造血系统恶性肿瘤。白血病是儿童和青少年中最常见的恶性肿瘤，我国的年发病率和死亡率约为34/10万，在各种肿瘤中居第六位。白血病的发病原因至今尚不明确，有许多因素可能与其发病有关，包括病毒因素、物理因素、化学因素、遗传因素等。胚胎的原始中胚层细胞分化成造血干细胞，后者又能分裂并分化成红系、粒系、单核系、淋巴系和巨核细胞系的干细胞。导致白血病的进程可以影响任何干细胞系或原始的多能造血干细胞。因此，此病起源于骨髓，继发性影响脾脏、淋巴结

16、和肝脏。当恶性细胞增殖时，骨髓中正常的造血成分就被白血病细胞取代。为了维持现状，正常细胞在肝脏和脾脏克隆扩增（骨髓外造血）。继之，肝脾及其他器官也因长满白血病细胞而肿大。结果，产生功能性造血细胞的最后储库也丧失了，患者表现为骨髓衰竭。这些症状和体征包括：不能调动有效的防御机制抵抗细菌、真菌和寄生虫感染，不能停止因巨核细胞被取代而引起的毛细血管出血（如瘀点性出血出现在皮肤和粘膜上的小紫血斑，伴随牙周出血）。当幼红细胞系被取代时就导致贫血。最终白血病细胞将在任何器官的基质中生长。虽然很难精确地描述特定器官的症状，但这些器官都肿大，触之有沉重感，而且白血病细胞的大量增殖可导致恶病质。四、肿瘤的研究简

17、史20世纪人类对肿瘤本质的认识经历了曲折的过程。1914年Boveri首先提出癌变的染色体异常学说，但未被后人所接受，之后在很长一段时间内众说纷纭，有免疫缺陷说、分化失常说、病毒说和突变说等。70年代后至今，随着分子生物学和基因工程技术的快速发展，肿瘤细胞、分子遗传学和基因组学的研究不断深入，使人们认识到原癌基因的活化和肿瘤抑制基因的灭活，在癌变过程中起着中心的生物学作用。80年代后，肿瘤病因学和分子流行病学等的研究表明，人类癌症的主要风险因素是环境因素，而与此相关的代谢酶等修饰基因的遗传多态，决定了个体对这些因素的肿瘤易感性。近5年来癌症研究进入全新的表遗传学（epigenetics）领域，

18、许多实验事实证明，癌相关基因可遗传的表遗传学改变，与遗传学改变具有同样重要的意义。人类肿瘤遗传学作为人类和医学遗传学一个分支，同样既是一门基础科学，也是一门应用科学。作为基础科学，肿瘤遗传学研究癌症的遗传学病因、遗传因素和环境因素的相互作用在肿瘤发生中的意义，检测和分析癌变过程中癌相关基因的遗传学、表遗传学改变及其机制，以及肿瘤类型和个体特征性的癌变遗传学途径。作为应用科学，肿瘤遗传学开发、验证上述各类肿瘤的特异性改变；作为生物学标志，用于临床早期诊断、监测、预后，探讨可作为预防、治疗干预的遗传学和表遗传学靶的和有效的防治措施。对于家族性癌综合症，研究其癌相关基因的种类突变、世代间传递和表达的

19、规律，并探讨癌高发家族中如何合理地开展遗传学测试、筛查和咨询，研究有效的干预方法，以达到降低癌的发病率和死亡率，同时把社会伤害减少到最低程度的目的。第二节 肿瘤的发生机制肿瘤是危害人类健康和生存的顽疾之一，长期以来一直困扰着广大的科学家和医疗工作者。近一个世纪来，人们致力于探讨和研究肿瘤发生、发展的机制，试图找到预防、诊断、监控和治疗肿瘤的有效方法。肿瘤的发生、演变是一个涉及环境与遗传多因素、多阶段、所步骤的生物学过程，这注定人类与肿瘤的斗争是漫长而曲折的。尽管肿瘤的发生涉及许多复杂的机制，但就本质而言，它是一种遗传性疾病。遗传信息或是遗传物质的改变，是肿瘤发生的根本原因。所有肿瘤（包括大多数

20、有明显遗传倾向的肿瘤）都是体细胞突变的结果。突变定义为遗传物质发生的可遗传的变异。广义的突变可分为两大类即染色体突变和基因突变。前者主要指染色体数目和结构的变化，也称为染色体畸变。基因突变，一般情况下指的是分子水平上基因核苷酸序列或数目发生的改变。仅涉及DNA分子中单个碱基的改变称为点突变（point mutation），而涉及多个碱基突变的还有缺失、重复和插入等等。人类的基因组有3109个碱基对，其中5%的DNA为编码序列，含有约3万个基因。在机体内外环境中多种因素的作用下，遗传物质会发生损伤和变异，出现大量的基因突变。突变不仅发生于编码序列中，也可发生于启动子区、剪接部位、内含子及多腺苷酸

21、化位点，甚至发生于核外线粒体DNA及RNA中。这些突变一方面形成正常人体生物化学组成的遗传学差异，如ABO血型、血清蛋白不同类型等，是群体中遗传变异的主要来源，但大部分的基因突变是有害的，可导致各种遗传性疾病及癌症。基因突变分为点突变（即指只有一个碱基对发生的改变）、多点突变（有两个或两个以上的碱基对的改变）。点突变包括置换、插入、缺失（substitution，insertion，deletion）。置换又可分为两类即颠换和转换。置换和缺失是人类基因组中最常见的突变形式。从遗传信息的改变来看，碱基替代会产生不同的后果，可分为同义突变（synonymous mutation）、错义突变（mis

22、sense mutation）和无义突变（nonsense mutation）。同义突变是指没有改变产物氨基酸序列的密码子变化。错义突变是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变，有些错义突变严重影响到蛋白质活性甚至完全无活性；如果在必需基因上发生，往往为致死突变。无义突变则是指某个碱基的改变使得代表某种氨基酸的密码子变为终止密码子，使肽链的合成提前终止，因而产生无功能的蛋白质。缺失和插入则通常指较长的碱基序列的增加和缺失。缺失和插入往往引起移码突变，不但改变了产物的氨基酸的组成，而且会出现蛋白质合成的过早终止；对于必需基因来说，常常是致死的。缺失和重复又常分为短序列（20bp左右）和长序列

23、（720bp左右）的变化。基因重复和倒位是不太常见的突变，其发生的频率不高或者说不易估计。从理论上讲，DNA分子上每一碱基都可发生突变，但实际上在某些部位上的突变频率大大高于其他部位，被称为突变热点，其形成原因仍不甚明了。另外，人体基因组中一些微卫星DNA即简单重复，其序列数目上的改变也可引起人类遗传病。与基因重复不同，这种突变只发生重复拷贝数的增减，故称为动态突变。染色体畸变可分为染色体数目畸变和结构畸变。数目畸变中又分为多倍体（polyploid）、非整倍体（aneuploid），而结构畸变包括缺失、重复、倒位、易位、插入和等臂染色体，以及双着丝粒、断片、环状染色体等等。突变的诱发因素各种

24、因素都可以引发突变的生成。由于自然界中诱变剂的作用或由于偶然的复制、转录、修复时的碱基配对错误多产生的突变称为自发突变。人类单基因病大多为自发突变的结果。自发突变的频率平均为10-910-10/核苷酸代，其相对发生率较低。物理、化学、生物学因素均可高频率诱发基因突变，它们被称为诱变剂。人类常使用诱变剂处理生物体而人为造成突变个体，这一过程称为诱发突变。这些突变个体被称为诱发突变题，它们在遗传学的研究上做出了巨大的贡献。大部分诱变剂也是致癌剂，可在生物体诱发各种癌症。致癌物诱发肿瘤形成的能力被称为致癌作用。DNA是生命活动中最重要的物质，保持其分子结构的完整性，对于细胞和个体至关重要，各种因素都

25、会引起DNA序列的损伤和错误，DNA损伤直接影响复制、转录和蛋白质的合成，继而对细胞的遗传、发育、调控、生长、代谢等生命活动产生影响，是引起基因突变的重要原因。在原核和真核生物中普遍存在着复杂、高效的修复机制，对各种损伤进行修复，保持和维护遗传信息的稳定，极少数不能修复的损伤产生基因突变，导致细胞的恶化和死亡。基因突变可在个体发育的任何时期、部位发生，包括体细胞以及生殖细胞生长周期的各个阶段。在体细胞中的突变会在个体体细胞中传递，使个体成为“嵌合体”。其突变效应往往不易观察到。只有突变影响到受累细胞的特定功能或性状时，才能发现。而生殖细胞在减数分裂时期对外界环境具有较高的敏感性，所以发生突变的

26、概率较高，如果是显性基因突变，其效应可通过受精卵而直接遗传给后代，并在子代中表现出来。如果为隐性突变，其效应可能被其他等位基因所掩盖。如果突变在配子发育的早期阶段发生，则多个配子都会得到该基因突变，并将其传递给子代，造成遗传疾病及遗传性肿瘤的发生。携带突变的个体叫做突变体。未发生突变的正常个体称为野生型。影响人类基因突变的因素主要包括：化学致癌物有机化合物（烷化剂、芳烷基化制剂、芳香羟胺）、无机化合物和石棉、天然化学物质、氡；物理致癌物（辐射）紫外线辐射、电离辐射、内源性电离辐射；生物致癌物病毒（乙肝病毒、爱-巴二氏病毒、人乳头状瘤病毒等）。另外，其它因素，如父龄、性别、遗传背景等，也可影响基

27、因突变的速率。第三节 癌基因及其致癌的分子机制一、癌基因的发现癌基因的发现可以追溯到20世纪初。1910年，Rous将鸡肉瘤组织的无细胞滤液注射到健康鸡的体内，结果诱发了健康鸡长出肉瘤，从而发现了现在被称为Rous肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV）的一种RNA急性致癌病毒。然而，这一发现在肿瘤研究中长期遭到漠视。20世纪60年代开始，病毒与肿瘤的关系日益受到重视；Rous终于在1966年获诺贝尔医学生理学奖，时年85岁。1969年，Huebner和Todaro提出“癌基因假说”，认为在所有脊椎动物的细胞内都含有致癌病毒的全部遗传信息，其中，与致癌有关的信息称为癌基因。在通

28、常情况下癌基因处于被阻遏状态；只有当细胞内有关的调节机制遭到破坏的情况下癌基因才表达，从而导致细胞癌变。1970年，Baltimore等和Temin等分别报告他们在两种RNA急性致癌病毒（Rauscher小鼠白血病病毒和Rous鸡肉瘤病毒）中分离了一类很特别的DNA聚合酶，能以RNA为模板指导合成DNA。这类酶被称为“反转录酶”。Baltimore、Temin以及Dulbecco由于他们关于致癌病毒的研究而获1975年诺贝尔医学生理学奖。癌基因研究的实质性突破是1970年由Martin用RSV的温度敏感突变体完成的。温度敏感突变体是遗传学在鉴定基因时常用的研究方法。RSV的温度敏感突变体在较低

29、温度（允许温度）下能使体外培养的细胞转化为癌细胞，但在较高温度（限制温度）下细胞于几小时内就恢复正常状态，只有当温度再降低时才会再次被转化。这说明，在RSV基因组内确实有能使细胞转化的癌基因，在限制温度时，该基因发生突变，使该基因本身或其蛋白质产物失活了，所以，导致转化的基因是一种必须不断表达才能保持其致癌特性的基因。Martin证明的基因后来被命名为src。这是人类证明的第一个癌基因。1971年，Duesberg等用RSV的src缺失突变体与野生型RSV作基因组比较，确定了src基因位于RSV基因组RNA的3，端。RSV的src缺失突变体除了无致癌作用外一切正常，这说明src对RSV的生长和

30、增殖并非必需。1978年，Erikson等用抗体鉴定了src基因编码的蛋白。这是一种能使蛋白质磷酸化的蛋白激酶，其磷酸化的作用位置在酪氨酸上，分子质量为60kDa，称为P60。所有细胞癌基因都具有真核基因的典型结构割裂基因（split gene），即基因的编码序列（外显子）被若干间插序列（内含子）所割裂，并且，对同一基因来说，内含子的数目、长度和序列都是固定的。Huebner和Todaro在他们的癌基因假说中曾假定细胞癌基因也许是在早期进化过程中通过病毒感染获得的，这一假定显然需要修正了。不是c-onc起源于v-onc，而是v-onc起源于c-onc。病毒侵染细胞时，c-onc的数量应该多于甚

31、至远多于v-onc。事实证明确实如此。20世纪80年代初，已建立了鉴定人细胞癌基因的有效方法DNA转染法检测。通常是将人肿瘤组织的细胞DNA以磷酸钙沉淀法转染体外培养的NIH3T3小鼠成纤维细胞，如出现转化灶，可将转化灶细胞注射入裸鼠体内致癌加以确认，然后，用人基因组特有的Alu重复序列为探针通过Southern杂交从转化灶细胞和裸鼠瘤细胞DNA中分离出人DNA片段，即为人癌基因。用这种方法以及分析人癌细胞中染色体断裂点处的序列和人癌细胞中被大量扩增的序列等方法，迄今已鉴定的人c-onc数量已超出v-onc好几倍。表列出的209种是到2002年5月止的不完全统计。Bishop等又特别强调使用“

32、原癌基因”（proto-oncogene，POG）一词专指正常细胞中的这些DNA序列，而“癌基因”（oncogene）一词则表示原癌基因的变异形式，即在癌细胞中被激活的形式。Bishop由于在癌基因研究中的贡献而获1989年诺贝尔医学生理学奖。二、癌基因癌基因是正常细胞基因即原癌基因（proto-oncogene）的一种转化形式。它编码具有显性转化性质的调节蛋白，即改变了的单拷贝序列能转化整个细胞，而另一正常序列不能阻断这种转化能力。1. 原癌基因的蛋白质产物（1）生长因子在正常情况下人血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）分子被包裹在血小

33、板内，每个血小板中大约有1000个PDGF分子，只有在出现创伤时血小板才局部释放出PDGF，刺激伤口附近血管内皮细胞和上皮细胞增殖以充填伤口，实施其参与组织和血管损伤的修复功能。一旦伤口愈合，血小板即不再释放PDGF，增殖的细胞即转入静止状态。假如由于某种因素的作用而失去了这种正常的调控，使PDGF基因不断产生出PDGF分子，就可能使细胞增殖失控而导致癌变。肉瘤、胶质母细胞瘤等结缔组织肿瘤显示原癌基因SIS的表达证实了这一假设。在这以后，发现相当数量的人原癌基因的蛋白质产物是生长因子（growth factor）。生长因子刺激静止期或G0期细胞进入细胞周期。这一有丝分裂应答需要两个生长因子互补

34、群之间的协同作用。第一互补群是“感受性因子”（competence factors），如PDGF、FGF或表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），它们刺激静止期细胞进入细胞周期的G1期。第二互补群是“进行性因子”（progression factors），如胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1），保证细胞开始DNA合成。这种双重信号需求能防止静止期细胞于瞬时处于有丝分裂生长因子作用之下时意外地引发进入细胞周期的事件。在某些细胞类型中，生长因子刺激的去除很快导致细胞凋亡。某些生长因子在刺激细胞增殖的同时也能促进祖细

35、胞的分化，而另一些生长因子则阻断分化并促进增殖。所以，某种生长因子的不适宜表达除了导致对细胞分化的阻断之外，还会导致对细胞生长的不断刺激。（2）生长因子受体一般来说，生长因子能识别与之相应的生长因子受体（growth factor receptor）。早就知道表皮生长因子受体是一种具有酪氨酸磷酸激酶活性的跨膜蛋白。许多生长因子通过具有酪氨酸激酶活性的受体介导其效应。这些受体都具有一个胞外配体结合结构域，一个跨膜结构域，一个胞内催化结构域，负责转导促细胞分裂信号。生长因子与细胞表面受体的结合引起受体二聚化，激活其内源性酪氨酸激酶，导致每个受体在特异性酪氨酸残基上的分子间磷酸化。不少癌基因编码的是

36、受体酪氨酸激酶的突变形式。这些受体包括：编码表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）；编码集落刺激因子1受体（colony stimulation factor-1 receptor，HGF/SFR）；TRK编码神经生长因子受体（nerve growth factor recetptor，NGFR）；编码干细胞生长因子受体（stem cell growth factor receptor，SCFR）；HER2/NEU（ERBB2）编码神经调节蛋白受体（neuroregulin receptor）；RET编码胶质细胞衍生神经生长因子受体（gi

37、al cell derived nerve growth factor receptor，GDNFR）等。（3）非受体酪氨酸蛋白激酶迄今已鉴定了40多种不同的酪氨酸蛋白激酶。除生长因子受体以外，其余的就是非受体酪氨酸蛋白激酶，如src、YES、FGR、FPS、FES、ABL1等原癌基因的产物。所有的酪氨酸蛋白激酶都有约300个氨基酸的序列同源区，是它们的催化激酶结构域。这一结构域负责在转磷酸化和自磷酸化时催化ATP的磷酸基团转移到酪氨酸残基。早已知道磷酸化作用是蛋白质功能的重要调节器。在正常细胞中，酪氨酸的磷酸化是相当罕见的事件，大部分蛋白激酶（即催化蛋白质磷酸化的酶）是作用于丝氨酸或苏氨酸上

38、。但是，酪氨酸蛋白激酶能调节那些控制细胞形状和细胞生长的信号转导途径中的关键事件。这一类原癌基因的产物在细胞内的位置是与质膜相联系，而不是跨膜蛋白。它们中大多数具有豆蔻酰化的N端甘氨酸残基，可促进其与质膜的联系。激酶结构域在蛋白质的C端，被称为Src同源结构域1（src homolohy 1，SH1）。非受体蛋白激酶中还有未见于生长因子受体中的两个另外的Src同源结构域SH2和SH3。SH2在涉及信号转导和识别磷酸酪氨酸残基的各种蛋白质中非常保守。SH3则能识别信号蛋白和细胞骨架蛋白中的富含脯氨酸基序。非受体酪氨酸蛋白激酶与质膜的联系对于它们的转化活性非常重要。这些蛋白的豆蔻酰化信号突变能完全

39、破坏其与质膜的联系和转化活性，表明它们的信号转导必定是从质膜起始的，很可能是通过与其他膜结合蛋白的相互作用而起始的。非受体酪氨酸蛋白激酶是促分裂信号转导途径中处于受体酪氨酸激酶下游的重要组分，而且，它们的活性是由受体酪氨酸蛋白激酶激活的，这提示，它们在肿瘤中是在受体酪氨酸蛋白激酶脱调节时才被激活。（4）细胞质衔接子蛋白有些癌基因编码仅含SH2和SH3结构域但缺乏任何催化活性的衔接子蛋白（adaptor protein）。1988年，Mayer等报道了一种新的病毒癌基因v-crk。很快发现它的产物仅含SH2和SH3结构域但导致细胞内酪氨酸磷酸化蛋白的水平增高。此后发现，CRK以及其他仅含SH2和

40、SH3结构域的人原癌基因产物是通过它们的SH2结构域与激活的受体酪氨酸激酶上磷酸化酪氨酸残基结合，又通过它们的SH3结构域与别的蛋白质结合，发挥其衔接子蛋白的作用。在这种方式下，它们把异聚蛋白复合体弄在一起，使激酶催化这一复合体内的蛋白质磷酸化。这种磷酸化反应与去磷酸化反应一起，在把信号从细胞表面一级一级地传递到细胞核的机制中发挥作用。（5）具有GTPase活性的蛋白具有GTPase活性的蛋白在肿瘤发生中的作用，最初是通过发现了编码先前未知形式的GTPase的RAS癌基因家族而鉴定的。在正常细胞中，RAS家族成员在整个进化过程中都非常保守。RAS已被定为生长因子受体下游对细胞形状、游动性和生长

41、的关键调节物。RAS的激活是与生长因子受体的配体刺激作用联结在一起的，并由鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）SOS所介导。就受体酪氨酸激酶而言，RAS的激活由与GRB2衔接子分子结合而介导；这种结合是通过GRB2的SH2结构域与该受体上特异性的磷酸化酪氨酸残基实现的。GRB2把SOS蛋白拉在一起，并将之导向到质膜上；它的底物RAS正位于质膜。于是SOS刺激RAS上GDP交换为GTP，使RAS由失活形式转变为激活形式，能与效应物和底物相互作用。相反，RAS的失活部分是由RAS的内源性GTPase活性介导的。通常这一活性很低；然而，

42、GTPase活性可被GAP所刺激，它能将RAS从与GTP结合的激活形式转变为与GDP结合的失活形式。GAP也含有一个SH2结构域，并由激活的受体酪氨酸激酶募集至质膜。已在许多种肿瘤中鉴定到RAS癌基因。RAS癌基因与RAS原癌基因的差别是点突变，导致其蛋白质产物在磷酸结合结构域的第12位、第13位、第59位、第61位氨基酸的置换。这些致癌的RAS蛋白通过增加GDP交换为GTP、或者通过不能与GAP相互作用等途径把自己锁定在激活的与GTP结合的状态。所以它们对GDP和GTP交换因子的需求就降低，并不再需要由SOS交换因子所起的激活作用。（6）GTPase交换因子DBL、VAV、ECT2、OST、

43、TIM、LBC、LFC、DBS等基因由于它们转化体外培养的成纤维细胞的能力已通过基因转移法而被发现。DBL癌基因是这一基因家族中第一个被鉴定的成员。氨基酸序列分析揭示DBL与酵母细胞分裂周期蛋白Cdc24的同源性局限于Cdc24负责GEF活性的结构域，这一结果导致发现DBL是哺乳类蛋白CDC42的交换因子。所有已鉴定的小GTP结合蛋白的致癌交换蛋白都含有一个相似的结构域，现在被称为DBL同源结构域。DBL结构域对于这一类癌基因的转化活性至关重要，提示它们对GTP结合蛋白的交换活性对于转化作用是十分重要的。现在还不能对这一癌蛋白家族致癌激活机制的特性作完整的描述；然而，DBL或VAV N端序列的

44、缺失将导致致癌激活。这些缺失会丢失一个负调节结构域，这个结构域在正常情况下能调节这些蛋白的GEF活性。（7）胞质丝氨酸苏氨酸蛋白激酶迄今所研究的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶都是可溶性胞质蛋白，它们是原癌基因MOS、COT、PIM1、RAF等的产物。RAF丝氨酸激酶的致癌形式丢失了N端的调节序列，导致该激酶活性以及促分裂MAP激酶途径的组成型激活。RAF蛋白激酶在正常状态下是受严格调节的。当静息细胞（resting cell）受到促分裂原的刺激，或受到丝氨酸苏氨酸蛋白激酶的另一成员蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的刺激，RAF激酶活性即迅速升高。有若干肿瘤促进剂是通过刺激PKC家族

45、并介导RAF信号转导途径的激活而起作用。（8）核内蛋白位于细胞核内的癌基因和原癌基因的产物直接影响细胞增殖与分化所涉及基因表达的控制。这些产物中有许多起转录因子的作用，其致癌机制是组成型激活。例如，致癌的JUN和FOS转录因子带有导致丢失负调节元件的突变，使这些因子具组成型活性。除丢失负调节结构域外，有些致癌转录因子，如像v-Erb A和v-Rel，丢失的是正效应物结构域，导致显性失活蛋白，能防止那些为细胞分化所需基因的表达。原癌基因在进化中是高度保守的，其产物是从原始真核生物到人类各个物种正常细胞生长和分化的重要调节物，它们位于细胞的各个部位，调节着维持细胞周期、细胞分裂、细胞分化有序进行的

46、级联事件。所以，“原癌基因”这一名称看来是一个误称，它们原本就是正常基因，并且是调节细胞的生长和分化必不可少的基因，即所谓“持家基因”。只有在这种有序进行的级联事件部分地丢失，也就是原癌基因的产物不正常的表达时，才有致癌能力。1984年“癌基因，细胞生长和肿瘤”国际讨论会指出：细胞癌基因是维持细胞正常功能的重要成分。在控制细胞生长分化中起重要作用，只有当它的结构域调节区域发生变化，使其被激活，影响了正常生物学功能时，才使细胞发生转化，发生癌变。2. MYC和MYB癌的分子遗传学研究是从鸟类反转录病毒的分析起始的。在这段历史中，研究得最为广泛和深入的是两个癌基因家族MYC和MYB。MYC基因的产

47、物MYC蛋白是一种具有多重功能的蛋白。它能调节细胞周期、细胞生长、细胞分化、细胞凋亡、细胞转化、基因组不稳定性，以及血管生成等等。在人类癌症中最常见的基因突变是扰乱MYC基因的调节或表达水平的突变。异位表达研究弄清了MYC基因的许多生物学活性，包括转化、无限增殖化、阻断细胞分化和细胞凋亡等。如此众多而诱人的生物学活性使MYC基因成为人们最感兴趣的癌基因。核内癌蛋白MYC家族是在大部分人类恶性肿瘤中致癌性激活的主要的细胞生长调节物。自从MYC在20世纪80年代初被鉴定为原癌基因以来，已证明在许多类型的癌症中有异常表达，包括MYC在Burkitt淋巴瘤、非Burkitt淋巴瘤、乳腺瘤、宫颈癌、前列

48、腺癌、胃肠癌、骨肉癌、黑素瘤、畸胎瘤、粒细胞和浆细胞白血病、恶性胶质瘤等，加上神经母细胞瘤中的MYCN和小细胞肺癌中的MYCL的异常表达，MYC基因家族理所当然地成为癌基因研究中普遍关注的热点。MYB基因家族由三个成员组成，既MYB、AMYB和BMYB。它们编码三种核内蛋白，其功能为转录的反式激活蛋白。这些蛋白中的一种或几种与其他转录因子如像ETS2、CEBP、NFM等相互作用。这些基因的表达是受细胞周期调节的，以反义寡核苷酸抑制它们的表达能影响细胞周期的进程、细胞分裂和（或）细胞分化。MYB基因家族成员显示不同的时间与空间表达模式，提示它们各有不同的功能。3. ERBB2在众多癌基因中，另一

49、个受到广泛关注的是ERBB2，又称HER2。原癌基因HER2编码的人表皮生长因子受体2（human epidermal-growth-factor 2，HER2）是一种跨膜受体，具有内在酪氨酸激酶活性。胞内酪氨酸激酶的磷酸化通过胞内信号转导途径激活与细胞生长有关的基因。HER2的超表达是在许多癌症中常见的分子事件，并与患者的不良预后、术后短期复发以及低存活率密切相关。对HER2研究比较集中于乳腺癌。2001年，Riou等研究表明，对乳腺癌患者来说，HER2基因扩增较之HER2蛋白超表达是不良预后的更好的指标。HER2基因扩增是第一个在临床上用作预后和化疗效果预测因子的遗传学改变的指标。三、癌症

50、基因组学1. 癌基因的协同作用在实验研究中已有可能把癌基因分为两个互补群。第一群是使细胞免于衰老和凋亡的基因，或称无限增殖化基因（immortalizing gene）。第二群是使已能无限增殖的细胞改变细胞形状并使之发生致瘤性转化的基因，或称转化基因（transforming gene）。第一互补群包括MYC基因家族、核内转录因子基因FOS和JUN等。第二互补群包括RAS基因家族、SRC基因家族等。肿瘤发生通常需要这两个互补群成员之间的协同作用。一般来说，第一互补群基因的蛋白质产物位于核内，通常不改变细胞形态或贴壁依赖性而是使细胞无限增殖；相反，第二互补群基因的蛋白质产物位于细胞质内，在大多数

51、情况下位于质膜的细胞内一侧，这些蛋白质能降低细胞对生长因子的需求，诱导细胞形状改变，导致贴壁不依赖性细胞生长，但不使细胞无限增殖。2. 癌基因与细胞周期真核细胞的细胞周期在两个主要的决定点上受调节：G1期细胞进入DNA复制的决定点和G2期细胞进入M期的决定点。活体内，许多细胞处于静止期（G0期），DNA不复制。TGF等可溶性因子、细胞间接触、胞外基质组分的黏着等提供了细胞生长抑制信号；生长因子则提供了细胞生长刺激信号。生长抑制信号与生长刺激信号的抗衡迫使细胞作出是否进入G1期和起始细胞分裂的决定。G1晚期有一个被称为“限制点”的关卡，细胞在此处决定所接受的信号是否符合生长和由G1期进入S期的要

52、求。细胞是否通过限制点标志着细胞是继续分裂还是离开细胞周期的转换。这一转换的脱调节对恶性生长而言是必不可少的。癌细胞以若干种方式脱离细胞生长抑制。机制之一是激活促进细胞生长的基因、生长因子、生长因子受体、RAS基因家族成员、使细胞通过G1期的核内癌蛋白等。机制之二是丢失TGF等生长抑制因子的受体。3. 癌基因与细胞凋亡不论是在正常组织还是在肿瘤中，细胞死亡与细胞增殖的抗衡控制着细胞的累积。现在已有证据证明，诱导细胞凋亡是消除那些带有DNA损伤的细胞或具有异常细胞周期的细胞的主要机制，而那些细胞正是致癌性转化的前体。近来已发现有些显性癌基因能抑制细胞诱导凋亡的能力。4. 癌症基因组学的研究实例“

53、基因组”（genome）是机体的全部遗传物质。1986年出现的“基因组学”（genomics）一词是指综合研究全套基因及其相互作用而不是研究单个基因。癌症是一种基因组疾病。在癌细胞中，基因组总是在多个位置上发生改变。癌症基因组学就是研究各种癌症中有哪些基因发生了改变，以及它们是如何改变的。迄今还没有一种癌症其所有发生改变的基因被完全描述，但已有一些可喜的探索。第四节 抑癌基因及其抑癌的分子机制癌基因对细胞的作用是显性的。同一基因座上的一对基因，只要其中一个发生突变，尽管另一个仍然正常，那个突变的基因就可使其蛋白质产物超表达或活性改变而成为致癌蛋白。细胞中有另一大类对细胞增殖起负调节作用的基因及

54、其产物，它们的作用一般是在同一基因座上一对基因都丢失或失活后方能显示。也就是说，这类基因的产物对细胞生长调节或分化途径是必需的；一旦它们的功能丧失，将促成癌细胞表型。这类基因被称为肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene）。一、 肿瘤抑制基因的发现从1969年起，Harris等用体细胞杂交的方法研究肿瘤。他们发现，小鼠的恶性肿瘤细胞与正常小鼠细胞杂交后，产生的杂种细胞失去了恶性表型；接种到适当的宿主体内后不再长瘤。这用显性转化基因的作用是完全不能解释的。这一结果提示，正常细胞中存在肿瘤抑制基因，可以抑制肿瘤细胞的恶性表型。二、 几种肿瘤抑制基因及其产物肿瘤抑制基因按照失活机制的

55、不同可分为两类：I类肿瘤抑制基因，其功能丢失是由于DNA点突变或缺失，如RB1、TP53、WT1等；II类肿瘤抑制基因，其功能丢失则是由于其表达调节受阻，如VCL、MASPIN HREV107等。II类基因的表达调节又往往受控于I类基因，即I类基因的突变能抑制有些II类基因的表达。1. RB1RB1编码的蛋白P105含928个氨基酸。免疫荧光技术证明约85%RB1蛋白存在于细胞核内，约10%在质膜上，胞质和间质中几乎没有RB1蛋白。RB1蛋白是一种磷酸化蛋白，它能与DNA结合；另外，还有一个GGAAGTGA元件，对TP53的作用敏感，受它的调节。RB1蛋白在60%以上已研究过的人类肿瘤中失活，

56、肿瘤类型除视网膜母细胞瘤外，包括骨肉瘤、软组织肉瘤、小细胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等。RB1蛋白的失活可通过多种不同的机制实现，包括基因突变导致直接丢失功能蛋白、RB1蛋白磷酸化，或者RB1蛋白与DNA肿瘤病毒的癌蛋白结合。将RB1正常基因导入几种肿瘤细胞系的实验证明，RB1基因可以完全抑制视网膜母细胞瘤的致瘤性，但只能部分抑制前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌细胞的致癌性，说明这些肿瘤的发生还有其他基因的改变。2001年，Zheng和Lee综合了RB1蛋白影响有丝分裂、染色体分离、“关卡”控制、染色质重建等方面的近代研究成果后指出，RB1蛋白的功能在于维持基因组的完整性。它很可能是通过其多重生物

57、学活性的效能而抑制肿瘤形成的。他们认为，一种单个蛋白能履行多重抗癌功能也许是RB1和TP53、BRCA1、BRCA2等其他肿瘤抑制蛋白的共同特征。2. TP53自从1979年被发现并命名以来，人们对TP53蛋白和TP53基因的认识经历了由癌蛋白抗原，到癌基因，到肿瘤抑制基因，再到DNA损伤激活的细胞周期调节物的转变过程。TP53基因是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，几乎在所有种类的肿瘤中，在80%以上的肿瘤组织中发现了TP53基因的突变。TP53蛋白是细胞核内的一种序列特异性转录因子。在正常情况下它在细胞内的半寿期仅为20min，所以TP53保持在很低的浓度。有证据提示这是TP53与它的

58、负调节物MDM2结合并引发遍在蛋白（ubiquitin）介导的酶解反应的结果。另外，在有些细胞中，TP53还可能处于失活状态。在这些条件下，TP53必须接受一个激活信号才能发挥其功能。体内和体外实验都证明了TP53与细胞凋亡的关联。TP53蛋白在细胞凋亡中的作用是：DNA损伤引起TP53水平急剧上升，诱导P21的转录而将细胞停止在G1期，使细胞赢得时间通过DNA修复系统在进入S期之前修复损伤的DNA；如损伤太大不能修复时，TP53诱导细胞凋亡。这样，TP53防止了携带广泛性DNA损伤的细胞通过克隆性生长而导致肿瘤。3. WT1当WT1基因的蛋白质产物与EGR1竞争性地结合于CGCCCCCGC序列时，抑制了后者的转录活性，从而抑制细胞的增殖。WT1基因的表达有组织特异性，在胚胎肾上皮、胎儿睾丸和卵巢，以及一些造血细胞中有表达，但在成人肾中不表达。1987年，Weissman等将正常人11号染色体通过微细胞转移技术导入Wilms瘤细胞系，有力证明WT1基因是肿瘤抑制基因。4. NF1NF1基因可使RAS失去活性。突变的NF1基因丧失这种功能，使RAS活性增强，导致不适当的细胞生长和肿瘤形成。已在神经纤维瘤1型及部分肉瘤中发现NF1基因的缺失、插入和点突变。5. APC和MCCAPC基因的产物既位于细胞质中又位于细胞核内。APC蛋白是一种具有多重功能的蛋白