影像及生物力学测试尼古丁剂量与腰椎后外侧植骨融合率的相关性

1、www.CRTER.org杨保家，等. 影像及生物力学测试尼古丁剂量与腰椎后外侧植骨融合率的相关性影像及生物力学测试尼古丁剂量与腰椎后外侧植骨融合率的相关性 杨保家，杨开舜，姚汝斌(大理学院附属医院脊柱外科，云南省大理市 671000)引用本文：杨保家，杨开舜，姚汝斌. 影像及生物力学测试尼古丁剂量与腰椎后外侧植骨融合率的相关性J.中国组织工程研究，2016，20(48):7251-7260.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.48.016 ORCID: 0000-0003-3413-6435(杨开舜)文章快速阅读：尼古丁剂量与腰椎后外侧植骨融合率的相关性杨保

2、家，男，1986年生，硕士，医师。通讯作者：杨开舜，硕士，教授，硕士生导师，主任医师，大理学院附属医院脊柱外科，云南省大理市 671000 中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)48-07251-10稿件接受：2016-09-11对照组：注射生理盐水实验组：注射不同剂量尼古丁观察12周处死家兔X射线评价方法CT扫描手触法生物力学取L4-L7脊柱标本评价脊柱融合情况后路切开L5-6双侧横突后外侧融合术健康新西兰家兔60只文题释义：腰椎融合术：就是以病变的腰椎为中心，从病损的腰椎上下的正常脊椎进行植骨，从而使包括病变腰椎在内的上下正常脊椎的多个节段达到骨性融合，

3、在生物力学上形成一个整体，目的是切除病变、减少或消除疼痛、防止脊柱畸形、重建脊柱稳定性和保护脊髓。生物力学：研究的目的是定量分析物理力对活体系统的效应，其涉及范围相当广泛，凡是可以应用力学及计算机原理进行分析的医学和生物学的问题，均属于生物力学的研究范畴。脊柱生物力学从强度、疲劳和稳定性等方面研究脊柱的功能。摘要背景：临床上出现因吸烟影响植骨区周围血供，最终影响脊柱融合。对于不同剂量尼古丁对脊柱融合影响的相互比较国内外尚未见报道。目的：探讨尼古丁对家兔脊柱融合模型的影响，阐明尼古丁的剂量与脊柱融合率的相关性。方法：选择60只6-8月龄的成年健康家兔，随机分为4组，每组15只。4组动物均在肌肉注

4、射麻醉下行L5/6后路腰椎横突间融合术。术后第1天开始，对照组每天皮下注射生理盐水1 mL/(kg次)，3次/d；其他3组均给予不同剂量的尼古丁溶液，每天皮下注射尼古丁剂量分别为2，4，8 mg/(kg次)，3次/d。术后12周，通过生物力学测试、手触法检测和影像学评估分析尼古丁对脊柱后外侧横突间融合手术融合率的影响。结果与结论：手触法检测和影像学评估结果：2 mg/(kg次)的尼古丁对脊柱融合无明显影响，4，8 mg/(kg次)的尼古丁阻碍了脊柱的融合，降低了融合率；生物力学测试结果：3个尼古丁剂量组与对照组相比，差异均有显著性意义(P < 0.01)；3个尼古丁剂量组的差异均有显著性

5、意义(P < 0.01)；4 mg/(kg次)尼古丁组和8 mg/(kg次)尼古丁组的差异无显著性意义(P > 0.05)；说明所有剂量的尼古丁均影响了骨痂形成，降低了融合率，并且随剂量的增加，融合率明显下降；结果提示，所有剂量的尼古丁均可降低脊柱融合率，而且尼古丁对脊柱融合的影响具有剂量依赖性。关键词：骨科植入物；脊柱植入物；尼古丁；后外侧腰椎融合；动物模型；生物力学主题词：脊柱融合术；模型，动物；尼古丁；生物力学；组织工程基金资助：云南省应用基础研究面上项目(2011FZ294)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Correlati

6、on of nicotine dose and lumbar posterolateral fusion rate: imaging and biomechanical testingYang Bao-jia, Yang Kai-shun, Yao Ru-bin (Department of Spinal Surgery, Affiliated Hospital of Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China)AbstractBACKGROUND: Smoking affects blood supply around the g

7、raft area, ultimately affecting spinal fusion. Few studies reported the effects of different doses of nicotine on spinal fusion. OBJECTIVE: To evaluate nicotine effects on rabbit model of spinal fusion, and to clarify the correlation between the dose of nicotine and spinal fusion rate. METHODS: Sixt

8、y healthy adult white rabbits aged 6-8 months were selected and randomly divided into four groups, with 15 rabbits in each group. Rabbits in the four groups received L5/6 posterior lumbar intertransverse fusion under intramuscular anesthesia. On day 1 after surgery, rabbits in the control group were

9、 subcutaneously injected with physiological saline 1 mL/kg, three times a day. Rabbits in other groups received different doses of nicotine solution: 2, 4, 8 mg/kg through subcutaneous injection, three times a day. 12 weeks after surgery, effects of nicotine on the fusion rate of posterolateral lumb

10、ar interbody fusion surgery were determined by biomechanical testing, hand touch detection and imaging. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hand touch detection and imaging: 2 mg/kg nicotine did not have significant effect on spinal fusion. 4 and 8 mg/kg nicotine blocked spinal fusion and decreased fusion r

11、ate. (2) Biomechanical testing: Significant differences were detected between nicotine groups and control group (P < 0.01). Significant differences were detectable among the three nicotine groups (P < 0.01). No significant difference was determined between 4 mg/kg nicotine and 8 mg/kg nicotine

12、 groups (P > 0.05). All doses of nicotine affected callus formation, reduced fusion rate; moreover, with the increased dose, the fusion rate obviously diminished. (3) These findings concluded that all doses of nicotine could decrease spinal fusion. Moreover, the effect of nicotine on spinal fusio

13、n was dose-dependent. Subject headings: Spinal Fusion; Models, Animal; Nicotine; Biomechanics; Tissue EngineeringFunding: the General Program of Applied Research in Yunnan Province, No. 2011FZ294Cite this article: Yang BJ, Yang KS, Yao RB. Correlation of nicotine dose and lumbar posterolateral fusio

14、n rate: imaging and biomechanical testing. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(48):7251-7260.Yang Bao-jia, Master, Physician, Department of Spinal Surgery, Affiliated Hospital of Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, ChinaCorresponding author: Yang Kai-shun, Master, Professor, Masters

15、supervisor, Chief physician, Department of Spinal Surgery, Affiliated Hospital of Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China7255ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction腰椎融合术被广泛应用于治疗脊柱侧后凸畸形、脊柱骨折脱位、脊柱滑脱、椎管狭窄及椎间盘等多种疾病，重建脊柱稳定性1。作为一种经典的手术方式，手术成功与否主要通过术后脊柱稳定程度以及新骨形成进行评价。随着吸烟人群的

16、增加，临床上出现因吸烟影响植骨区周围血供的情况，最终影响脊柱融合2。吸烟患者进行脊柱融合手术后发生不融合或仍存在腰腿痛的概率明显比不吸烟患者高，其症状改善也不明显3。有研究表明吸烟患者的脊柱不融合明显高于非吸烟患者4-6。烟草中尼古丁含量最多，毒性也最大。对于不同剂量尼古丁对脊柱融合影响的相互比较国内外尚未见报道。家兔能够模拟人体腰椎融合的生理机制和生物力学变化。实验采用家兔作为动物模型，模拟人类不断吸烟造成体内尼古丁剂量增加，探讨尼古丁与脊柱融合的强度、融合率是否存在剂量相关性。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 于

17、2011年10月至2014年7月在大理大学附属医院脊柱外科完成。1.3 材料1.3.1 实验动物 普通健康新西兰家兔60只，大理学院实验动物中心提供，体质量2.5-3.2 kg，月龄6-10个月。脊柱融合手术前适应性喂养实验家兔1周，确定其健康无畸形。将家兔按随机数字表法为4组，每组15只。4组动物均在3%的戊巴比妥钠肌肉注射麻醉下行后路腰椎横突间融合术。术后第1天开始，对照组每天皮下注射生理盐水1 mL/(kg次)，3次/d；其他3组均给予不同剂量的尼古丁溶液，每天皮下注射尼古丁剂量分别为2，4， 8 mg/(kg次)，3次/d。1.3.2 主要器械、仪器及材料手术设备：不锈钢电动煮沸消毒锅

18、，实验用手术器械(手术刀柄、无菌刀片、血管钳、持针器、剪刀、无菌缝针、缝线、镊子)，磨钻，家兔用动物实验台，医用烤灯(泰昌医疗器材厂)，均由大理学院外科实验室提供。实验试剂：尼古丁标准液(上海有思生物有限公司，5 mL/支)，生理盐水(四川科伦药业股份有限公司)，戊巴比妥钠(北京普博斯生物科技有限公司)，注射用头孢唑林钠(河北制药有限责任公司)，自凝牙托粉和自凝牙托水(上海医疗器械股份有限公司)。主要仪器：液压万能力学实验机(上海新三思计量仪器制造有限公司)，见图1，2；X射线机(荷兰PHILIPIS DR机)；CT机(荷兰PHILIPIS 64排螺旋CT)；电冰箱(日本三洋MDF-382E型

19、)。1.4 实验方法1.4.1 术前准备及麻醉 脊柱融合手术前1周，适应性喂养实验家兔，确定健康无畸形。术前家兔禁食8 h，禁水2 h。术前动物称质量，了解抗生素、麻醉药及后期尼古丁所需的剂量。术前30 min肌肉注射头孢唑林钠50 mg/kg一次。按30 mg/kg剂量的戊巴比妥钠溶液肌注麻醉。麻醉成功后，家兔角膜反射迟钝，对疼痛刺激无反应。麻醉时间可维持二至三小时。1.4.2 家兔腰椎后路横突间植骨融合术 麻醉成功后，背侧脱毛备皮(图3A)，将家兔俯卧位固定于实验台上。开启医用烤灯，使动物体温保持在36.5-37.5 。以L5/6为中心用碘伏消毒手术区域(图3B)，铺无菌洞巾(图3C)，作

20、后正中切口，切开皮肤、皮下组织达深筋膜(图3D)。用刀柄钝性剥离椎旁肌外侧肌肉，在髂腰肌与多肋肌之间进入，显露双侧L5/6横突(图3E)。无菌纱布填塞加压术口。牵开尾端皮肤切口，钝性剥离暴露髂骨，用剪刀取双侧髂骨各约2 g，并将髂骨剪碎成细小颗粒待用(图3F，G)。局部加压彻底止血后，将双侧L5/6横突背侧用磨钻去皮质化(图3H)，并将髂骨颗粒作为移植骨植入L5/6横突间(图3I)。术后彻底止血，用碘伏水及生理盐水彻底冲洗术口。逐层闭合术口(图3J)，术中出血约20 mL。1.4.3 术后处理 术后将家兔置于温箱，用医用烤灯保温(图3K，L)。家兔苏醒并开始进食后，放于动物中心兔笼内继续喂养(

21、图3M，N)。术后所有家兔每天肌注头孢唑林50 mg/(kg次)，2次/d，共2 d。术后1周，观察家兔伤口无感染，饮食、活动均正常。1.4.4 术后家兔注射尼古丁造模及取材 术后第1天开始，对照组每天皮下注射生理盐水1 mL/(kg次)，3次/d；其他3组均给予不同剂量的尼古丁溶液，每天皮下注射尼古丁剂量分别为2，4，8 mg/(kg次)，3次/d。术后12周沿耳缘静脉用空气栓塞方法处死家兔，截取L4-L7脊柱节段，剔除腰椎周围肌肉。保留脊柱前方结构及后方的棘间、棘上韧带和关节囊。1.5 主要观察指标大体及手触观察：观察标本，注意横突间新生骨痂的形状、大小、质地，将明显植骨区骨痂未形成的标本

22、直接剔除。其余有新生骨痂形成标本由2位未参与该实验过程的骨科医师手触法检查骨痂硬度，轻柔检查融合间隙及上下相邻间隙活动度，2名观察者都评价为无明显活动度、固定则定义为融合，任何一位医师评价存在活动，则视为不融合7。X射线检查：对所有拍摄正侧位X射线片，球管距标本80 cm，拍摄条件为55 kV、90 mA、50 ms，观察植骨区横突间骨小梁情况。按照放射学评分系统，融合标准为融合节段出现连续骨桥，中等量新骨形成或大量新骨形成定义为融合8。结果由2名(未参与实验)放射科医师进行评定。CT检查：采用螺旋CT对模型做平扫和三维重建，扫描层厚为1 mm。融合情况采用Baramki等9的分类方法进行评定

23、。以50%-100%植骨区钙化形成骨桥评定为融合。生物力学测试：用融合的模型制作生物力学测试试件(图4A)。用口腔科制作义齿的义齿基托树脂(由牙托粉和牙托水组成)铸造力学试件平台，便于力学实验机夹具的夹持。将自凝牙托粉调和成面团状可塑物。用面团状可塑物包埋标本上下两端，两端平面保持平行，面积约为2 cm×2 cm，便于加载和受力均匀一致。将制作好的试件依次固定于液压万能力学试验机上进行生物力学实验(图4B)，对标本施加0.4 Nm的屈伸力矩，加载速度为1 mm/min。先行2次非破坏性测试，进行加载和卸载循环，减少脊柱黏弹性影响。第3次加载时记录融合节段最大位移。进行力学测量，通过液

24、压力学试验机的感受器采集数据，经计算机处理，绘制载荷-位移曲线(图4C)，并由曲线得出运动范围和中性区数值。1.6 统计学分析 统计数据用SPSS 19.0软件包进行统计学分析。对于手触法检测和影像学检测，根据融合和未融合将每组家兔进行计数，2组间比较采用4个表2检验，多组间比较采用行×列表资料2检验；生物力学测试数据采用方差分析。2 结果 Results2.1 实验动物数量分析 纳入家兔60只，随机分为4组，每组15只，全部进入结果分析，无脱失。BA图2 液压万能力学实验机-数据图像处理设备Figure 2 Hydraulic universal mechanical testin

25、g machine-data image processing equipment图1 液压万能力学实验机-加压动力机Figure 1 Hydraulic universal mechanical testing machine- pressurized power machine图5 术后12周处死家兔取融合节段标本大体观察Figure 5 General observation of rabbit fusion segment specimens at 12 weeks after surgery图注：图A为对照组标本融合情况；B为尼古丁组标本融合情况。GDCABEFNMLKJIH图3 兔

26、腰椎后外侧融合术中及术后图片Figure 3 Images during and after rabbit lumbar posterolateral fusion图注：图A为剪毛备皮；B为皮肤消毒；C为铺洞巾；D为切开皮肤及皮下筋膜；E为椎旁肌外侧入路暴露横突；F为取自体髂骨术；G为将髂骨剪碎成细颗粒状；H为用磨钻将横突去皮质化；I为将颗粒状髂骨植入横突之间；J为逐层缝合术口；K为术后将兔放于保温箱内待家兔麻醉苏醒；L为术后苏醒，可站立活动，自主进食；M为术后家兔完全苏醒，能自主进食，继续分笼喂养；N为术后家兔完全苏醒，能自主进食，继续分笼喂养。BCA图4 兔融合节段标本生物力学测试相关图片

27、Figure 4 Biomechanical test of rabbit fusion segment specimens图注：图A为截取L4-L7节段用自凝牙托粉包埋两端制成力学试件；B为利用液压万能力学实验机进行生物力学实验；C为利用计算机得到的力-位移曲线。图6 术后12周兔融合节段标本X射线检查结果Figure 6 X-ray films of rabbit fusion segment at 12 weeks after surgery图注：图A为两横突间见充满融合的骨块，和手触法检查一致，均牢固融合；B为两横突间仅为骨桥相连，宽度不一致，和手触法检查融合程度不一致；C为横突间一侧

28、充满骨组织，另一侧被吸收，经手触测定证实为不融合；D为两横突间无任何高密度影，表明移植物已完全被吸。DCBA图7 术后12周兔融合节段标本CT三维重建图片Figure 7 CT three-dimensional images of rabbit fusion segments at 12 weeks after surgery图注：图A为对照组CT三维重建，两横突间见充满融合骨块，表面及边缘光滑；B为低剂量尼古丁组CT三维重建，两横突间见充满融合骨块，但表面及边缘粗糙；C为中等剂量尼古丁组CT三维重建，两横突间新生骨痂较少；D为大剂量尼古丁组CT三维重建，两横突间新生骨痂稀疏。DCBA2.2

29、 手法触诊检查结果 术后12周空气栓塞法处死家兔，截取L4-L7节段。由2位未参与该实验过程的骨科医师手触法检查。对照组4例标本检查发现活动融合节段有轻微松动，评定为不融合；其余11例融合节段结合紧密，触诊检查无活动，评定为融合。融合成功率为73%。实验组中，2 mg/(kg次)尼古丁组有5例出现松动现象，认定为不融合，其余10例标本判定为融合，融合成功率为67%；4 mg/(kg次)尼古丁组3例骨痂明显不连直接认定为不融合，有7例出现松动现象，认定为不融合，其余5例标本判定为融合，融合成功率为33%；8 mg/(kg次)尼古丁组5例骨痂明显不连直接认定为不融合，有7例出现松动现象，认定为不融

30、合，其余3例标本判定为融合，融合成功率为20%。对照组与2 mg/(kg次)尼古丁组比较，2组差异无显著性意义(P > 0.05)，说明2 mg/(kg次)的尼古丁对脊柱融合无明显影响。对照组与4 mg/(kg次)尼古丁组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。对照组与8 mg/(kg次)尼古丁组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。注射尼古丁的3组间采用行×列表资料2检验，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明随着尼古丁剂量的增加，对脊柱融合产生了影响(见表1)。对照组融合标本骨痂体积大，硬度高，骨痂表面光滑(图5A)；8 mg/(kg次)尼古

31、丁组融合标本痂体积小，硬度低，骨痂表面粗糙(图5B)。 2.3 X射线检查结果 所有标本经X射线检查发现：双侧横突间充满骨痂，手触法检查也为融合。单侧充满骨痂，对侧被吸收，手触测定也为不融合。对于双侧骨桥宽度不一致的标本，手触法与X射线检查结果不一致。部分手触法无明显骨痂形成的标本，X射线显示为横突间低密度影。对照组1例标本X射线检查发现单侧充满骨痂，对侧无明显骨痂，评定为不融合；其余14例双侧均充满骨痂，评定为融合，融合成功率为93%。实验组中，2 mg/(kg次)尼古丁组有2例双侧无明显骨痂形成，认定为不融合；其余10例双侧均充满骨痂，3例双侧为骨桥相连，标本判定为融合，融合成功率为87%

32、。4 mg/(kg次)尼古丁组11例无明显骨痂形成，认定为不融合；其余4例标本判定为融合，融合成功率为27%。8 mg/(kg次)尼古丁组12例无明显骨痂形成，认定为不融合；其余3例标本判定为融合，融合成功率为20%。对照组与2 mg/(kg.次)尼古丁组比较，2组差异无显著性意义(P > 0.05)，说明2 mg/(kg次)的尼古丁对脊柱融合无明显影响。对照组与4 mg/(kg次)尼古丁组比较，2组差异有显著性意义(P < 0.05)。对照组与 8 mg/(kg次)尼古丁组比较，2组差异有显著性意义(P < 0.05)。注射尼古丁的3组间采用行×列表资料2检验，差

33、异有显著性意义(P < 0.05)，说明随着尼古丁剂量的增加，对脊柱融合产生了影响(见表2)。X射线表现对照组新生骨痂密度较高，皮质较厚，表面光滑(图6A)；尼古丁组随着剂量的增加植骨区骨痂较小，骨痂表面粗糙，不光滑(图6B-D)。2.4 CT检查结果 对照组3例标本CT扫描及三维重建发现骨痂表面粗糙，评定为不融合；其余12例双侧均充满骨痂，评定为融合，融合成功率为80%。实验组中，2 mg/(kg次)尼古丁组有5例双侧无明显骨痂形成，认定为不融合；其余7例双侧均充满骨痂，3例双侧为骨桥相连，标本判定为融合，融合成功率为67%。4 mg/(kg次)尼古丁组10例无明显骨痂形成，认定为不融

34、合；其余5例标本判定为融合，融合成功率为33%。8 mg/(kg次)尼古丁组11例无明显骨痂形成，认定为不融合，其余4例标本判定为融合，融合成功率为27%。图7为各组家兔融合节段CT重建图像。对照组与2 mg/(kg次)尼古丁组比较，2组差异无显著性意义(P > 0.05)，说明2 mg/(kg次)的尼古丁对脊柱融合无明显影响。对照组与4 mg/(kg次)尼古丁组比较,2组差异有显著性意义(P < 0.05)。对照组与8 mg/(kg次)尼古丁组比较，2组差异有显著性意义(P < 0.05)。注射尼古丁的3组间采用行×列表资料2检验，差异有显著性意义(P <

35、0.05)，说明随着尼古丁剂量的增加，对脊柱融合产生了影响(见表3)。2.5 生物力学检查结果 本实验通过液压万能力学试验机记录在0.4 Nm力作用下脊柱模型的最大位移，见表4。通过记录数据，利用SPSS 19.0软件包进行方差分析(表5-7)，评价不同剂量尼古丁对脊柱融合的生物力学影响。表5为各组数据的统计描述表，描述了对照组与不同剂量尼古丁实验组融合节段模型的集中趋势和离散趋势。从左到右依次为各组检测模型的例数(n)、位移数据的均数、标准差、标准误、总体均数95%可信区间、极小值和极大值。方差齐性检验结果显示，Levene统计量为0.668， 1=3，2=25，P=0.58，可认为样本所有

36、各总体的方差齐。表6为单因素方差分析的结果，F=368.976，P < 0.001，按=0.05水准，拒绝H0，接收H1，差异有显著表1 各组术后手触法检查融合结果 (n=15，n)Table 1 Fusion results detected by the hand touch method in each group组别融合数(+)未融合数(-)融合率对照组11473%2 mg/(kg次)尼古丁组10567%4 mg/(kg次)尼古丁组51033%8 mg/(kg次)尼古丁组31220%表2 各组术后X射线检查融合结果 (n=15，n)Table 2 Fusion results d

37、etected by X-ray after surgery in each group组别融合数(+)未融合数(-)融合率对照组14193%2 mg/(kg次)尼古丁组13287%4 mg/(kg次)尼古丁组41127%8 mg/(kg次)尼古丁组31220%表3 各组术后CT射线检查融合结果 (n=15，n)Table 3 Fusion results detected by CT after surgery in each group组别融合数(+)未融合数(-)融合率对照组12380%2 mg/(kg次)尼古丁组10567%4 mg/(kg次)尼古丁组51033%8 mg/(kg次)尼

38、古丁组41127%表6 在0.4 Nm作用下位移单因素方差分析结果 Table 6 One-way analysis of variance of displacement at 0.4 Nm 项目平方和df均方F显著性组间60.031320.010368.9760.000组内1.356250.054总数61.38728表4 各组标本施加0.4 Nm力的屈曲位移 (n=15，mm)Table 4 Buckling displacement at 0.4 Nm in each group组别标本123456789 1011对照组1.411.421.611.521.711.611.912.021.

39、621.721.522 mg/(kg次)尼古丁组2.012.222.561.922.132.352.232.262.622.564 mg/(kg次)尼古丁组4.514.935.255.335.048 mg/(kg次)尼古丁组5.095.245.46表注：对照组、2，4，8 mg/(kg次)尼古丁组检测标本的样本量(n)分别为11，10，5，3。表5 施加0.4 Nm力后的位移统计描述表 Table 5 Statistics description table of displacement at 0.4 Nm组别n均值标准差标准误均值的 95% 置信区间极小值极大值下限上限对照组111.642

40、 70.189 950.057 271.515 11.770 31.412.022 mg/(kg次)尼古丁组102.286 00.237 680.075 162.116 02.456 01.922.624 mg/(kg次)尼古丁组55.012 00.322 990.144 444.611 05.413 04.515.338 mg/(kg次)尼古丁组35.263 30.186 100.107 454.801 05.725 65.095.46总数292.820 01.480 670.274 952.256 83.38321.415.46性意义。可认为不同剂量尼古丁对脊柱融合产生了影响。表7为采用L

41、SD-t 检验进行两两比较的结果，均数差值用“*”标注者，表示所对应的2组均数差异有显著性意义(P < 0.01)。由表中可知：所有实验组，无论低剂量或高剂量尼古丁组与对照组相比，差异均有显著性意义(P < 0.01)，说明尼古丁对脊柱融合产生了影响；2 mg/(kg次)尼古丁组与4 mg/(kg次)尼古丁组及 8 mg/(kg次)尼古丁组的差异均有显著性意义(P < 0.01)，说明低剂量和高剂量对脊柱融合产生的影响不一致；4 mg/(kg次)尼古丁组和8 mg/(kg次)尼古丁组的差异无显著性意义(P > 0.05)。3 讨论 Discussion3.1 腰椎融合动

42、物模型的建立及意义 目前在脊柱外科领域，对脊柱不稳或滑脱、退变性腰椎管狭窄、腰椎7261ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH表7 在0.4 Nm力作用下位移(因变量)LSD-t检验两两比较结果 Table 7 Paired comparison of LSD-t test of displacement (dependent variable) at 0.4 Nm(I) 组别(J) 组别均值差 (I-J)标准误显著性95% 置信区间下限上限LSD对照组尼古丁2 mg/(kg次)组-0.643 27*0.101 750.000-0.852 8-0.4

43、33 7尼古丁4 mg/(kg次)组-3.369 27*0.125 610.000-3.628 0-3.110 6尼古丁8 mg(kg次)组-3.620 61*0.151 680.000-3.933 0-3.308 2尼古丁2 mg/(kg次)组对照组0.643 27*0.101 750.0000.433 70.852 8尼古丁4 mg/(kg次)组-2.726 00*0.127 550.000-2.988 7-2.463 3尼古丁8 mg/(kg次)组-2.977 33*0.153 300.000-3.293 1-2.661 6尼古丁4 mg/(kg次)组对照组3.369 27*0.125

44、610.0003.110 63.628 0尼古丁2 mg/(kg次)组2.726 00*0.127 550.0002.463 32.988 7尼古丁8 mg/(kg次)组-0.251 330.170 070.152-0.601 60.098 9尼古丁8 mg/(kg次)组对照组3.620 61*0.151 680.0003.308 23.933 0尼古丁2 mg/(kg次)组2.977 33*0.153 300.0002.661 63.293 1尼古丁4 mg/(kg次)组0.251 330.170 070.152-0.098 90.601 6表注：*均值差的显著性水平为 0.05。椎板广泛切

45、除继发不稳等疾病，其治疗最常用的方法是脊柱稳定和融合术，后路植骨融合是临床最常用的融合方法，具有操作安全、方法简便等优点。随着近年来内固定技术的发展，后路植骨融合在临床应用中更为普遍。横突间植骨融合是其中一种简便的融合方式，但临床随访发现，部分患者出现不融合，术后长期出现下腰痛。另外对于腰椎融合术还存在许多问题没有解决，比如术后临近节段退变、部分术式融合率低等。腰椎融合结果也受多种因素的影响，如融合方法、植骨种类和数量等。针对这些问题，就需要通过基础研究进行分析。但在人体或尸体上研究比较受限制。所以有必要建立理想的动物模型进行研究，为正确认识脊柱融合的生物学机制和影响因素提供依据。大型动物如羊

46、、猪、牛等主要用于研究内固定器材及其生物力学。Rocca等10用羊脊柱作为模型研究用羟基磷灰石包裹的椎弓根螺钉可增强植骨界面的稳定性。Foster等11用绵羊作为动物模型研究脊柱横突间融合与360°融合的差别。Olinger等12用猪做模型研究椎间融合内固定术。但大型动物费用较高，很难做大样本实验研究腰椎后外侧融合，从而限制了其应用。太小的小型动物如小白鼠或大鼠，因为脊柱、横突、髂骨较小，难以进行脊柱融合的研究，只能用来评估分子和细胞水平的改变。家兔是基础研究中常用的动物，能够模拟人体腰椎融合的生理机制和生物力学变化。关凯等13用家兔作为动物模型研究表明与人类脊柱融合率无明显差异。B

47、oden等14-16研究发现家兔横突间融合的过程及假关节发生率与人体报道相似。通过分析实验动物获取难易程度，科研经费的限制以及研究小组的技术和经验，家兔费用低、容易饲养、便于管理等特点。本实验作者选择家兔作为实验动物，建立后外侧腰椎融合模型，研究不同剂量尼古丁对脊柱融合的影响。家兔的腰椎解剖与人类脊柱解剖比较类似，横突间有足够的植骨床，能够提供足够量的髂骨作为移植骨。家兔横突前方肌肉类似人的药大肌，横突后方的椎旁肌类似人的竖脊肌。在横突间融合时，由于家兔横突细长，需广泛剥离椎旁肌暴露横突，提供足够大的植骨床增加融合成功率。利用家兔作为腰椎后外侧融合模型，外科显露简单，并且可以达到融合要求，融合

48、率与临床相似，骨痂形成周期与人类相似(两至三个月)，融合节段可进行生物力学分析17，是基础研究中应用最多的模型17-19。这也是本实验应用家兔作为研究模型的科研依据。本实验成功建立家兔腰椎后外侧横突间融合模型共29例，其中对照组融合11例，低剂量尼古丁组融合10例，中等剂量尼古丁组融合5例，高剂量尼古丁组融合3例，为研究吸烟对骨折愈合延迟和自体骨移植不融合奠定了基础。在建立动物融合模型过程中，需注意以下几点：人类年龄的大小影响骨折愈合，青少年生长较快，更有利于成骨。月龄< 6个月的幼兔，由于更容易成骨，加速融合，所以要选择成年家兔作为造模对象；因融合率的高低与植骨床和植骨量密切相关，所以

49、横突去皮质化面积大小一致，取髂骨量相同，每侧横突间植骨量约1 g；术中应注意止血，避免感染，防止家兔术后死亡，导致实验失败；家兔的不同脊柱节段的解剖、运动和生物力学不同，所以每只家兔选择单节段融合，便于对照研究；评价后外侧融合是否成功，需要结合手触法检查，X射线先扫描，CT扫描，生物力学测试等多种方法检测，仅靠一种方法评价是否融合可能不准确。3.2 烟草中尼古丁对骨折愈合、自体骨植骨融合影响的可能机制 众所周知，吸烟有害健康，其中的有害物质可导致许多疾病20-22。Slemenda等23通过对双胞胎吸烟情况的研究表明吸烟者的骨密度明显降低。通过流行病学调查，Krall等24发现吸烟者比不吸烟着

50、脊柱和股骨颈骨密度丢失率高。Vogel等25发现随着吸烟量的增多和吸烟时间的延长，桡骨远端骨折的发生率就高。吸烟还可使血流速度减慢26，骨折或植骨区周围血供减少，影响骨痂形成。这些研究证实，吸烟影响了骨的愈合。骨折愈合可分为一期愈合和二期愈合两种方式27。凡是骨折后经坚强内固定而愈合的曾被认为是一期愈合。影像学检查及病理切片发现，骨折断端周围无特异骨痂形成，其愈合主要依赖骨重建，遵循Wollf定律28。骨折愈合的主要方式为二期愈合，依靠骨折断端周围血肿机化，骨痂形成和塑型恢复骨的连续性。根据骨痂形成量来判断骨折是否愈合或脊柱自体移植骨是否融合直观明了。可通过X射线扫描、CT平扫加重建来评价骨痂

51、形成量29-31，从而判断骨折愈合和脊柱融合情况。许多研究表明，尼古丁是烟草中的主要成分，其生物学作用广泛，可以使体内的组织和器官发生与凋亡相关的生理作用32。影响运动、呼吸、神经、心血管等系统的发育。对促进还是延缓骨痂形成，目前不十分明确。Rothem等33-34通过研究尼古丁对成骨样细胞的影响，发现低剂量的尼古丁可促进成骨细胞增殖，使骨钙素、型胶原蛋白基因表达增高，而大剂量的尼古丁则起抑制作用。Skott等35研究表明尼古丁对大鼠骨折愈合无明显影响。但大量研究表明尼古丁延缓了骨折愈合、自体骨移植融合36-37。Zheng等38研究表明尼古丁虽然使微血管密度增加，但阻碍骨痂增殖，抑制塑型，降

52、低了骨折愈合率。Iwaniec等39利用小鼠作为研究模型，发现给予尼古丁的小鼠体内血钙下降，血磷升高，甲状旁腺激素升高、降钙素减少。这些变化可能导致成骨作用减弱，影响脊柱融合。Theiss等40在给家兔注射尼古丁后发现血管内皮因子的表达明显受到抑制。Forrest等41利用猪做皮瓣成活研究，发现在给猪注射尼古丁后，引起血管明显收缩，并且注射大剂量尼古丁后引起了血管内皮细胞的坏死。Krall等42研究发现低剂量的尼古丁对成骨细胞的增殖分化起促进作用，而大剂量却明显起抑制作用。Reitstetter等43发现持续低剂量尼古丁同样抑制了成骨细胞的增殖分化。秦宏敏等44研究了尼古丁对骨折愈合的影响发现

53、，尼古丁对骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性起抑制作用，并且随着尼古丁量的增加，抑制作用随之增加。刘卫平等45通过对大鼠颅骨缺损造模，研究尼古丁对其修复效能的影响，发现尼古丁阻碍了骨缺损修复。王勇平等46制作了被动吸烟的大鼠颅骨缺损模型，通过X射线检查、四环素荧光标记检测、新生骨矿物质含量测定表明吸烟影响了骨痂形成，阻碍骨折愈合。 本次实验中通过给各组家兔注射不同剂量的尼古丁，通过手触法检查、影像学检查以及生物力学测试观察尼古丁对家兔腰椎后外侧融合的影响，发现2 mg/(kg次)的尼古丁对脊柱融合无明显影响，8 mg/(kg次)的尼古丁骨痂形成减少，影响了脊柱的融合。该实验结果与其他作者的研究结

54、果(低剂量的尼古丁促进了脊柱的融合)不一致，根据本次实验作者认为尼古丁对家兔后外侧横突间脊柱融合的影响可能存在剂量相关性。大剂量的尼古丁降低了脊柱的融合率，原因可能为以下几个方面：尼古丁干扰了血清中钙、磷、甲状旁腺激素、降钙素等的代谢；尼古丁作用于植骨区周围血管，影响新生毛细血管的形成，使植骨区血供减少，阻碍新骨形成；尼古丁可能阻碍了成骨细胞的增殖分化，从而降低了脊柱融合率。3.3 脊柱的生物力学研究方法及注意事项 生物力学是生物学与工程学相结合的学科，主要运用基础力学理论研究生物体的肌肉组织、骨骼等的运动和功能的学科47。20世纪70年代起，开始进行脊柱生物力学研究，运用的力学理论为有限元方法48-49。该方法是在1956年由Clough在处理平面弹性问题时首次提出并使用50。20世纪80年代后又将该方法扩展应用到四肢骨、颅骨等骨骼的生物力学研究51。本实验通过计算机控制万能液压力学测试机研究腰椎后外侧融合后相应节段的生物力学。在生物