生物化学试验指导

1、第一部分生物化学与分子生物学概论 本部分的内容为生物化学实验中所涉及的主要原理。介绍如何正确记录实验过程及书写实验报告的一般规则，是训练学生进行正规实验寻林的重要内容。普通实验技术包括玻璃仪器的洗涤，洗液的配制，吸量管的使用、混匀的方法以及过滤、离心等一般实验室技术。实验样品的制备着重讨论在生物化学实验中，血液、尿液样品及组织材料的采集和处理，匀浆制备和组织浸出液制备。离心分离技术、电泳原理、分光分析、层析分离技术，重点讨论这些重要技术的原理，内容则尽可能简洁扼要，作为具体实验内容的参考。一.实验记录和实验报告的书写实验是在理论指导下的科学实践，目的在于经过实践掌握科学观察的基本方法和技能，培

2、养学生科学思维、分析判断和解决实际问题的能力。也是培养探求真知、尊重科学事实和真理的学风，培养科学态度的重要环节。（一）实验记录记录实验中观察到的现象、结果和数据，及时地记录在激烈路本上。原始数据必须准确简练、详尽、清楚。记录时不能夹杂主观因素，在定量实验中观测的数据，如称量物的重量、滴定管的读数、光密度值等，都应设计一定的表格，依据仪器的精确度记录有效数字。完整的实验记录包括实验日期、实验题目、目的、操作、结果。（二）实验报告实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，按照下列顺序写出实验报告：1. 实验名称（The title of experiment ）：2. 目的（Objective

3、）：3. 原理（Principle）：最好使用简式。4. 操作步骤（Operational procedure）：5. 实验记录6. 计算与结果（Calculation and Results）：7. 讨论（Discussion）：对实验方法，实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。二、普通实验技术（一）玻璃仪器的洗涤与清洁 玻璃仪器的洗涤与清洁直接影响实验结果的准确性，因此玻璃仪器的洗涤工作是很重要的。 1.新购置玻璃仪器的清洗 新购置来的玻璃仪器表面附着有游离碱质，应先用肥皂水洗刷后再用流水冲洗，浸泡于I2HCl中过夜，取出后再用流水冲洗，最后用蒸馏水冲洗23

4、次，在干燥箱中烤干或自然晾干，备用。 2.使用过的玻璃仪器的洗涤· （1）一般玻璃仪器：烧杯、三角烧杯、试剂瓶、试管等，可先用洗衣粉或肥皂水刷洗，将器皿内外壁细心地刷洗，使其尽量多地产生泡沫，然后再用自来水洗干净，洗至容器内壁光洁不挂水珠为止，最后用蒸馏水冲洗23次，晾干备用。 （2）容量仪器：吸量管、容量瓶、滴定管等在使用后立即用清水冲洗，勿使粘污物质干涸，并及时用流水或洗衣粉水尽量洗涤，稍干后有铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水反复冲洗，将洗液完全洗去，最后用蒸馏水冲洗23次，晾干备用。 （3）比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗干净，如不干净时可用HCl或适当溶剂冲洗（避免用较强的碱

5、液或强氧化剂清洗），再用自来水冲洗干净。切忌用试管刷或粗糙的布或纸擦洗，以保护比色杯透光性，冲洗后倒置晾干备用。（二）清洗液的原理与配制1.肥皂水，洗衣粉溶液和去污粉：是常用的洗涤剂，有乳化作用，可除去污垢，能使脂肪、蛋白质及其它粘着性物质溶解或松弛，一般玻璃仪器可直接用肥皂水浸泡或刷洗。2.铬酸洗液（三）量器类的使用法 量器是指对液体体积进行计量的玻璃器皿，如滴定管、移液管、容量瓶、量筒、刻度吸量管、刻度离心管及自动加液管等。 l.滴定管： 滴定管分常量与微量滴定管。常量滴定管又分为酸式与碱式两种，各有白色、棕色之分。酸式滴定管用于盛装酸性、氧化性以及盐类的稀溶液。碱式滴定管用来盛装碱性溶液

6、。棕色滴定管用于盛装见光易分解的溶液。常量滴定管的容积有20、25、50、100毫升四种规格。微量滴定管分为一般微量滴定管和自动微量滴定管，容积为5、10g升等规格，刻度精度因规格不同而异。 滴定管主要用于容量分析。它能准确读取试液用量，操作比较方便。一般是左手握塞，右手持瓶；左手滴液体，右手摇动。在滴定台上衬以白纸或者白磁板，以便观察锥形瓶内的颜色。滴定速度以10ml/min，即每秒34滴为宜。接近终点时，滴速要慢。甚至每秒半滴或l/4滴地进行滴定，以免过量。达到终点后稍停l2分钟，等待内壁挂有的溶液完全流下时再读取刻度数。正确读取容积刻度是减少容量分析实验误差的重要措施。滴定管的读数方法，

7、可依个人的习惯而不同。但是在同一实验中读取容积刻度时，必须以液面的同一特征标志为准，以保证其系统误差。 一般读数方法普通滴定管读取数据，双眼与液面同水平读数。 有色液读取数据是溶液弯月面两侧最高点连线与刻度线重合点° 无色液读取数据是溶液弯月面最低点水平线与刻度线重合点。 2吸量管 可准确地量取溶液的体积。 （1）分类：常用分三类： 奥氏吸量管：准确量取05毫升、l毫升、2毫升液体时用。每根吸量管上只有一个刻度，放液时必须吹出量后残留在吸量管尖端的液体，主要用于量取粘滞系数大的液体。 移液管：准确量取5毫升、10毫升、25毫升等较多体积液体时用。每根吸量管上只有一个刻度，放出液体后，

8、将吸量管尖在容器内壁上继续停留15秒，注意不要吹出尖端最后的部分。 刻度吸量管：供量取10毫升以下任意体积的液体时用。分全流出式与不完全流出式。全流出式：一般包括尖端部分，欲将所量取液体全部放出时，须将残留管尖的液体吹出。此类吸量管的上端常标有吹字。 不完全流出式：若吸量管上端未标有吹字样，则残留管尖的液体不必吹出o其刻度不包括吸量管的最后一部分。 （2）吸量管的使用 选择：使用前先根据需要选择适当的吸量管，刻度吸量管的总容量最好等于或稍大于最大取液量。临用前要看清容量和刻度。 执管：用拇指和中指（辅以无名指），持吸量管上部，用食指堵住上口并控制液体流速，刻度数字要对向自己。 取液：用另一只手

9、捏压橡皮球，将吸量管插入液体内（不得悬空，以免液体吸入球内），用橡皮球将液体吸至最高刻度上端l2cm处，然后迅速用食指按紧管上口，使液体不致于从管下口流出。 调准刻度：将吸量管提出液面，吸粘性较大的液体（如：全血、血清、血浆）时；先用滤纸擦干管尖外壁，然后用食指控制液体缓慢下降至所需刻度（此时液体凹面，视线和刻度应在同一水面上），并立即按紧吸量管上口o 放液：放松食指，使液体自然流入受器内。放液时，管尖最好接触受器内壁。但不要插入受器内原有的液体中，以免污染吸量管和试剂。 洗涤：吸血液、血清等粘稠液体及标本（尿液）的吸量管，使用后要及时用自来水冲洗干净。吸一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验

10、完毕后再冲洗。冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。 3.容量瓶 用于配制一定浓度标准溶液或试样溶液。颈上刻有标线，表示在20，溶液装至标线的容积。有10、25、50、100、250、500、1000、2000毫升几种规格，并有白色、棕色两种颜色。 使用方法：使用前应先检查容量瓶的瓶塞是否漏水，瓶塞应系在瓶颈上，不得任意更换。瓶内壁不得挂有水珠，所称量的任何固体物质都必须先在小烧杯中溶解或加热溶解，冷却至室温后，才能转移到容量瓶中。 4.量筒 量简是用来量取要求不太严格的溶液体积的。在配制要求不太准确的溶液浓度时，使用量筒比较方便。它有从52000ml十余种规格。用量筒量取液体体积是一种粗略的

11、计量法，所以，在使用中必须选用合适规格，不要用大量筒计量小体积，也不要用小量筒多次量取大体积的溶液。读取刻度的方法与容量瓶和滴定管相同。（四）一般操作法1.溶液的混匀 样品与试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地互相接触，必须借助于外加的机械作用。混匀时须防止容器内液体溅出或被污染，严禁用手指直接堵塞试管口或锥形瓶口振摇。溶液稀释时也须混匀。混匀的方法通常有以下几种： 搅动混匀法：适用于烧杯内溶液的混匀。如固体试剂的溶解和混匀。搅拌使用的玻璃棒必须两头都圆滑，棒的粗、细、长、短必须与容器的大小和所配制的溶液的多少呈适当的比例关系。搅拌时必须使搅棒沿着器壁运动

12、，以免搅入空气或使溶液溅出。倾入液体时必须沿着器壁慢慢倾入，以免产生大量气体，倾倒表面张力低的液体更要缓慢仔细。研磨配制胶体溶液时，搅棒沿着研体的一个方向进行，不要来回研磨。 旋转混匀法：适用于锥形瓶；大试管内溶液的混匀。手持容器使溶液作离心旋转以手腕，肘或肩作轴旋转。 指弹混匀法：适用于离心管或小试管内溶液的混匀。左手持试管上端，用右手指轻轻弹动试管下部，或用一只手的大拇指和食指持管的上端，用其余三个手指弹动离心管，使管内的液体作旋涡运动 振荡混匀法：适用振荡器使多个试管同时混匀，或试管置于试管架上，双手持管架轻轻振荡，达到混匀的目的。 倒转混匀法：适用于有塞量筒和容量瓶及试管内容物的混匀。

13、 吸量管混匀法：用吸量管将溶液反复吸放数次，使溶液混匀。 甩动混匀法：右手持试管上都，轻轻甩动振荡即可混匀。 电磁搅拌混匀法：在电磁搅拌机上放上烧杯，在烧杯内放入封闭于玻璃或塑料管中的小铁棒，利用磁力使小铁棒旋转以达到混匀杯中液体的目的。适用于酸碱自动滴定，pH梯度滴定等。2.过滤法 是分离沉淀和滤液的一种方法，可用于收集滤液，收集或洗涤沉淀。可用漏斗及滤纸或吸滤法。操作时应注意以下几点： 制备血滤液等实验时，要用干滤纸而不能用水把滤纸先弄湿，因为湿滤纸会影晌血液稀释的体积。 折叠滤纸的角度应与漏斗相合，使滤纸上缘能与漏斗壁完全吻合，不留缝隙。般采用平折法（即对折后再对折）。 向漏斗中加溶液时

14、，使其沿玻璃棒慢慢流下；玻璃棒不能在漏斗中搅动。倒入速度不要太快，以防损失，不得使液面超过滤纸上缘。 较粗的过滤可用脱脂棉或纱布代替滤纸，有时也可用离心沉淀法代替过滤法。 3.加热法 可直接用火（电炉）或水浴加热，使用水浴时防止浴中容器倾倒。酒精灯使用注意：禁止头碰头点燃。用过后先用盖子盖一下，灭后再拿下重盖，防止形成真空，盖子打不开。加热时管口不要对着人。加热时管夹夹住试管的上l3部分，均匀加热，再固定管底加热。 4.烤干法 烤干试管时，应将管口向下倾斜约成45°角，由上往下，先烤管底，最后将管口的水份烤干。烤干时须经常移动以免炸裂。试管等普通玻璃器材，也可在烘箱内烘烤干。三、实验

15、样品的制备在生物化学实验中，无论分析组织中各种物质的含量，或是探索组织中的物质代谢过程，都需要利用预先处理过的特定生物样品。掌握此种实验样品的正确处理与制备方法是做好生物化学实验的先决条件。在基础生物化学实验中，最常用的实验样品是人或动物的血、尿和组织等。现将动物或人的这些样品制备的方法扼要介绍如下：（一）血液样品收集动物或人的血液样品时应使用清洁干燥的容器以防止溶血。1.全血 取出血液后，迅速盛于含有抗凝剂的试管内，同时轻轻混匀，使血液和抗凝剂充分混匀，以免血液凝固。取得的全血如不立即进行实验，应储存于4冰箱中。常用的抗凝剂草酸盐（12mg/ml全血）、柠檬酸盐（5mg/ml全血）、氟化钠（

16、510mg/ml全血）、肝素（0.010.2mg/ml全血）。可将抗凝剂配成适度的水溶液，按需要量加入试管中，并涂布于试管壁，横放烘干备用。2.血浆 将上述抗凝之全血在离心机中离心，白细胞下沉，上清液既为血浆。分离血浆时必须严格控制溶血，除采血时一切用具都需要清洁干燥外，取出之血液也不能剧烈振摇。3.血清 收集的血液不加抗凝剂，在室温下约520分钟即自行凝固，通常经3小时，血块收缩而分离出血清。血块收缩后，应及早分离出血清，一面溶血。若血块粘着容器壁过紧，血清不易分离出来，可用细玻璃棒轻轻剥离，将血液离心，可分离的较快、较多。4.无蛋白血滤液 分析血液中某些成分时，为了避免蛋白质的干扰，需预先

17、除去血中的蛋白质成分。常用三氯醋酸、钨酸或氢氧化锌等沉淀剂与蛋白质作用，然后用过滤或离心方法制成无蛋白血滤液。（二）尿液样品一般定性实验样品可以用随时收集的新鲜尿液。定量测定尿液中各种成分时应收集24小时的尿液，混合后再取样。收集方法：一般在早晨一定时间排出残余尿弃去，以后每次尿液收集于清洁大玻璃瓶中，到第二天同一时间收集最后一次尿即可。把收集地4小时尿液充分混合后用量筒量准起总体积，然后取样分析。收集的尿液不能立即进行实验，则应置于冷处保存。必要时收集尿瓶中预先放入防腐剂，通常甲苯约10ml/L尿或浓硫酸10ml/L尿。收集实验动物的尿液时，可将动物置于代谢笼中，按以上方法通过笼下的漏斗收集

18、动物24小时的尿液。（三）组织样品在生物化学实验中，常常利用离体组织研究各种物质代谢的突击功能与酶系的作用，也可以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。但生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。因此，利用离体组织作为提取材料或代谢研究材料时应在冰冷条件下迅速取出所需要的组织，并尽快进行提取或测定。1. 组织糜 将组织用剪刀迅速剪碎，或用绞肉机绞成糜状即可。2. 组织匀浆 向剪碎的新鲜组织中加入适量的冰冷的匀浆制备液，用高速电动匀浆机或玻璃匀浆器制成匀浆。3. 组织浸出液 将上述制成的组织匀浆加以离心，其上清液即为组织浸出液。四、离心分离原理（一）原理离心机是利用离心力把溶液中

19、的粒子进行分离的一种仪器。所谓离心力是指物体作圆周运动时形成的一种使物体脱离圆周运动中心的力。离心力的单位为g，即重力加速度（980.6cm/S2），离心力的大小可根据离心时的旋转速度（r/min，每分钟转速）和物体离旋轴中心的距离r（cm）按下式计算：g=r×V2×1.118×10-5或按下式计算所需要的转速V=（g×89445）/r-2 制备离心几乎包括两种方法：一是分级离心法，另一种是密度梯度离心法。（二）分类1. 分级离心法：非均一的粒子悬浮液在离心机中离心时，各种粒子以各自的沉降速度移向离心管底部，逐步字底部形成一层沉淀物质。这层沉淀物质含有各

20、种组分，但是最多的是那些沉降得最快的组分。为了分出某一些特定的组分，通常需要进行一系列离心。通常先选择一个离心速度和离心时间，进行第一次利息，使大部分不需要的大粒子沉降去掉。这时需要的组分大部分仍留在上清液内。然后将收集到的上清液用更高的转速离心，把需要的粒子沉积下来。离心时间要选择得当，使大部分不需要的小粒子仍留在上清液中。倾去上清液，再把沉淀悬浮起来，用较低转速离心。如此反复直至达到所需纯度。2. 密度梯度离心法密度梯度离心法具有很好的分辨能力。可同时使样品中几个或全部组分分离。将样品粒子在一个密度梯度介质中离心，这个介质由一合适的小分子和样品粒子可在其中悬浮的溶剂组成。离心时离轴心愈远介

21、质密度愈大。（三）电动离心机的使用方法 欲使沉淀和母液分开，过滤和离心都可达到目的，但当沉淀粘稠，或颗粒过小能通过滤纸、总容量太少又需要定量测定时，使用离心沉淀法比过滤法要好。 使用方法： 1.应先将离心机放在稳定的台面上，放平、放稳，检查离心机转动状态是否平稳，以确定离心机的性能。 2检查套管与离心管大小是否相配，离心管应能在套管内自由转动不至太紧，套管软垫（用棉花或橡皮）是否铺好。套管底部是否有碎玻璃片或漏孔（玻璃片必须取出，漏孔经修补好后才能使用）。 3检查合格后，将一对离心管分别放入一对套管中，然后连同套管一起分别置粗天平两侧，使两侧的总重量平衡（包括离心管、离心套管、离心管内装溶液的

22、重量的总和），用滴管向较轻的一侧离心管与套管之间加水，直至天平两侧彼此相等为止。将各对已平衡的套管连同内容物放置于离心机内，两个等重的管必须放在对称位置，严禁在对称两侧离心管套中，仅一侧放置离心管。离心时离心机内不得留有离心管套。 4将离心管放要后，应先盖好离心机盖，检查所需电源电压的大小，再按要求将电源接通。打通电源开关，逐步旋转转速旋钮，速度调节应缓慢，增加离心机转速直至所需的转速。 5离心机转动时，如果机身不稳或声音不均匀时，应立即停止离心，重新检查重量是否对称和离心机是否放平稳。离心时，玻璃管、套管打碎应立即清除，重新配平后再离心。 6离心达规定时间后，将转速旋钮逐步回转到零。再关闭电

23、源。不可以用手强制使其停止转动，因这样既损伤离心机，同时沉淀又可能被搅动浮起，待离心机停稳后，取出离心管及管套，最后将电源插头拨下。注意事项：在配平时，勿使离心管套外部沾水，否则会影响结果。五、电泳原理（一）电泳的基本原理 带电荷的质点，在一定条件的电场作用下，可向一极移动，如带电荷的质点移向负极，这种现象称为电泳。许多生物分孑都带有电荷，其电荷多少取决于分孑性质及其所合在介质的pH和组戍，由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量、颗粒形状的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。 设一带电分子

24、在电场中所受的力为F，F的大小取决于质点所带电荷Q和电场强度X，即FQ·X根据Stoke氏定律，一球形的分子运动时受的阻力F与分子运动的速度V、分子的半径r、介质的粘度的关系为 F6r,当F=F时，即达到动态平衡时： Qx=6r,移项得vxQ6r, (1) 当vx表示带电分子在单位电场强度下运劫速度，移为迁移率，也称为电泳速度，以v表示，即vvxQ6r， （2） 由式（2）可见，一个带电分子的迁移率不仅取诀于其本身所带的电荷，而且还与电场强度介质的pH、禹子强度、粘度、电渗等因素有关。在具体实验中，移动速度v为单位时内t（以秒计）内移动的距离d（以cm计），即 Vd/t,又电场强度为

25、单位距离I（以cm计）内电势差E（以伏待计），即以vdt，XEI代入（2）式即得v=vx=（dt）（E/I）dIEt, 故迁移率的单位为cm2.秒1伏待1。物质（A）在电场中移动的距离为：dAVA EtI,物质（B）在电场中移动的距离为：dB=VBEt/I, 两物质移动的距离之差为ddA-dB（VA-VB）Et。 （3）（3）式表明物质A、B能否分离取诀于两者的迂移率，如相同则不能分离；如有差别则能分离。实验所选择的条件如电压和电泳时间与两物质的分离成正比；电场距离如滤纸与离距离成反比。 （二）影响电泳的主要因素 1.电泳介质的pH当介质等于其两性物质的等电点时，该物质处于等电状态即不向正极或

26、负极移动。当保质pH小于其等电点时，则呈正离子状态移向负极；反之，介质pH大于其等电点时，则呈负离孑状态，移向正极。因此，任何一种两性物质均受介质pH的影晌，即诀定两性物质的带电状态及其量，为了倮持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液。 2.缓冲液的离子强度 离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰，如离子强度低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量（压缩双电层）使电泳速度减慢。所以常用离子强度为0020.2之间。 溶液离子强度的计算Il2CiZi2 I表示离子强度Ci为克分子浓度（指离子而言

27、）Zi表示离子的价数。 3.电场强度 电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。电场强度越高，则带电粒子的移动越快。电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白变性而不能分离。 4.电渗作用 在电场中液体对于固体支持物的相对移动，称为电渗。如滤纸中含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响。如果纸上电泳蛋白移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。如果电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距禹等于二者相加。电渗现象所适成的移动距离可用不带电的有色染料或有

28、色葡聚糈点在支持物的中问。观察电渗方向和距离。其它因素例如滤纸、缓冲溶液的粘度以及电泳时的温度变化等因素也都影响泳动速度。 （三）区带电泳分类 按支持物物理性状不同，可分为： l滤纸及其他纤维素膜。如乙酸纤维素膜，玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。 2粉末电泳如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳o 3凝胶电泳如琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺电泳。 4.丝线电泳知尼龙丝、人造丝电泳° 按支持物的装置形式不同，可分为： I平板式电泳，支持物水平置，是最常见的电泳方式。 2垂直板式电泳。 3连缓一流动电泳，首先应用于纸电泳将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，缓冲液和样品白顶端下流，与电泳方向垂直。可分离较

29、大量的蛋白质，以后有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸，分离效果更好。 按pH的连续性不同，可分为： l.连续pH电泳 电泳的全部过程中缓冲液的pH保持不变，如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。 2非连续pH电泳 缓冲液和支持物间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳，等速电泳等，能使分离物质的区带更加清晰，并可对极微量物质（ng即109g）迸行分离。 （四）电泳技术的应用。 电泳技术是目前医学研究的重要手段。它可分离各种有机物（氨基酸、多肽、蛋白质、酶、酯类、核苷、核酸等）和无机盐。并可用于某种物质的纯度及分子量的测定。电泳技术与层析技术结合和指纹图可用于蛋白质结构的分析。现免疫结合的免

30、疫电泳，提高了对蛋白质的鉴别能力。与酶方法结合发现了同功酶。电泳技术是目前应用极广的分离物质的一种很好方法。也是医学科学中的重要研究技术。六、分光分析原理分光分析原理许多物质的溶液是具有颜色的，如高锰酸钾显紫红色，硫酸铜溶液显蓝色，这些溶液的颜色深浅是和溶液的浓度有关。在一定浓度范围内溶液的浓度越大，表现为溶液的颜色越深，因此，可以用比较溶液颜色的深浅来测定所含有色物质的含量，这种方法称力比色分析法，简称比色法。光是一种电磁波，具有一定的波长范围。波长在400700nm范圈内的电磁波为可见光。自然界的白光是一种混合的光，是由七种颜色的光按一定的比例混合而成的；知果把两种适当的光按一定的强度比例

31、混合也可得到白光，这两种颜色就叫互补色。溶液对可见光区的各色光几乎都吸收，则溶液呈黑色。如果溶液对各种不同波长的可见光有不同的吸收能力，则溶液呈现出被它吸收色光的补色。例如：白色光照射KmnO4溶液，溶液将其中的绿色光大部分吸收，而其它各色光透过溶液，通过溶液的光除紫色外其它颜色的光都两两互补成白色光，所以看到的是透过高锰酸钾溶液的紫色。从上面可知，有色溶液显现的颜色实质上是它所选择吸收光的互补色。（一）比色法 主要有目视比色法、光电比色法和分光光度法。它们的基本原理是相同的。光电比色法，分光光度法被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其理论依据是Lambert和Beer定律。 1.Lamb

32、ert定律当一束平行单色光通过有色溶液时，光的一部分被溶液吸收，一部分透过，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。若I0表示入射光的强度，I表示光线透过溶液后的强度，L表示溶液的厚度。 则一dIdII dIdIaI或dIIa.dI IoIdII=-aIoIdI， ln（II0）-aI 所以ln I0I= aI或II0eaI 或lgI0IK1e（K1e=a2303）（II010Kie） K1是一常数，受光线波长，溶液性质和溶液浓度影响。从上述公式可知，透过溶液后光线I0强度的减弱（II0）与溶液厚度L呈指数函数关系。 2.Beer定律当一束单色光通过一溶液时

33、，若溶液的厚度不变，则溶液浓度愈高光线强度的减弱也愈显著，与Lambert定律推导相似；两者的关系可表示如下： lgI0Ik2C或II0 =10K2C 其中，C表示溶液的浓度，K2是一常数，受光线波长，溶液性质和溶液厚度的影响。上式公式所表示的光线强度与溶液浓度的关系称为Beer定律。 然所有的溶液均符合Lambert定律，但并非所有的溶液都符合Beer定律，这是由于有些物质在不同浓度条件下其颜色可能发生改变，即在不同浓度条件下其吸收光的波长发生改变。 3.LambertBeer定律及应用 IgII0-KCL 如果将通过溶液后的光线强度（I）和入射光I0的比值称为透光度（T），将-lgII0用

34、光密度（A）表示，则它们之间的关系为： A-lgII0-lgT=KCL ·（1） 其中K为常数，称为消光系数（E），表示物质对光线吸收的本领，受物质种类和光线波长的决定。从公式（l）可知，对于相同物质和相同波长的单色光（消光系数不变）来说，溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。 A1/A2=C1/C2或写作C1A1A.C2 （2）如果C2为标准溶液的浓度，则可根据光密度值，按公式（2）求得待测液的浓度。（二）光电比色计和分光光度计的基本结构。 不论光度计、比色计还是分光光度计，其基本结构原理是相似的，都由光源、单色光器、狭缝、比色杯和检测器系统等部分组成。 1.光源 一个良好的光源要求具备

35、发光强度高，光亮稳定，光谱范围较宽和使用寿命长等特点。一般的光度计采用稳控的钨灯，适用子340900nm范围的光源，更先进的分光光度计外中有稳压调控的氢灯，适宜于作200360nm的紫外分光分析光源。 2.单色光器单色光器的作用在于根据需要选择一定波长的单色光。所谓单色光是指某特定波长有最大发射，而在相邻较长和较短波长的发射能量较少而言。最简单的单色光器是光电比色上所采用的滤光片（一定颜色的玻璃片），由于通过光线光谱范围较宽，所以光电比色分辨效果较差。棱镜和光栅是较好的单色光器，它们能在较宽光谱范围内分离出相对纯的光线，因此分光光度计有较高的分辨效果。 3.狭缝通过单色光器的发射强度可能过强，

36、也可能过弱，不适于检测。狭缝是由一对隔板在光起路上形成的缝隙，通过调节缝隙的大小来调节入射单色光的强度使入射光形成平行光线，以适应检测器的需要。光电比色计的狭缝是固定的，而光度计和分光光度计的缝隙大小是可调的。 4.比色杯又叫吸收杯、样品杯。是光度测量系统中最重要的部件之一，在可见光范围内测量时选用光学玻璃比色杯，在紫外线范围内测量时要选用石英比色杯。保护比色杯的质量是取得良好的分析结果的重要条件之一，不得用粗糙坚硬物质接触比色杯，不能用手指拿取比色杯的光学面，用后要及时洗涤比色杯，不得残留测定液。 5.检测器系统硒光电池、光电管或光电倍增管等光电元件常用来作为受光器，将通过比色杯的光线能量转

37、变成电能。进一步再用适量的方法测量所产生的电能。光电比色计用硒光电池作为受光器，其光敏感性低，不能检出强度非常弱的光线，对波长在270nm以下和700nm以上的光线不敏感。较精密的分光光度计都采用真空光电管或光电倍增管作为受光器，并应用放大装置以提高敏感度，虽然光谱范围狭窄的单色光的能量比范围宽的弱得多，但这种有放大线路的灵敏检流系统仍可准确的将其检测出来。（三）几种常用国产光电比色计和分光光度计 1.721型分光光度计光谱范围在360800nm，所有部件均在一主机内，操仵方便，灵敏度高。原理：以12伏25瓦白灼钨灯为光源，经透镜聚光后射入单色光器内，经棱镜色散反射到准直镜，穿狭缝得到，波长范

38、围更窄的光波作为入射光进入比色皿，透出的光波被受光器光电管所接受，产生光电流，再经放大在微安表上反映出电流大小，并直接读出光密度。使用方法如下： 灵敏度选择钮放在“l”（如调不到“0”的选用较高档）。 转动波长旋钮，选用所需波长。 接通电源，打开电源开关，将仪器预热。 打开吸收杯暗箱盖（光门档板自动遮住光路），转动零点谓节旋钮，使电流指针圆复到透光度“0”。 将吸收杯放入杯架中，使空白杯对向光路，盖好吸收杯暗盖，转动“100%电位器”，调准电表指针使之指向透光度100位置上。若空白杯液对光吸收能力过强，仪器灵敏度不够不能调到100时，可将“100%电位钮”向回旋再将灵敏度选择开关拔到较高档（2

39、5档）。 将标椎液及测定的吸收杯依次推入光道，即可自电流计直接读出其光密度值。 用完毕后，将开关放回“关”的位置，切断电源，并将吸收杯取出，用蒸馏水充分洗干净。 注意事项a分光光度计属精密仪器，应糈心爱护使用。防震、防潮、防腐蚀。b要保持吸收杯的清浩干净，保护光学面的透明度。 c读取光密度值的时间应尽量缩短，以防光电系统疲劳，如连续使用时，中间应适当使之避光体息。 d比色杯不要放置在仪器面上，以免液体腐蚀仪器表面。 e调0位及100旋钮要轻旋，旋到终点时指针仍未指到位，一定不能再用力旋，以免损坏电位器。2.722型分光光度计722型分光光度计是将光电管和微电流放大器同装在一密闭暗盒内，光信号由

40、光电管接受后通过高值电阻转换成微弱的信号，再经微电流放大器加以放大后，在数字显示器上读出。操作方法如下： 将仪器的电源开关接通，打开样品室盖，选择所需用的单色波长。灵敏度选择在“1”档，调节“0T”旋钮，使数字显示为“000”，然后将样品室盖合上。 将装有溶液的比色皿置于比色架中，盖上样品室盖，将蒸馏水校正或空白对照管置于光路，调节透过率“100T”旋钮，使数字显示为100.0T”。仪器预热15分钟。注意：如果显示不到100.0T，请调节灵敏度档。调节原则是保证空白档良好。调到“100%T”情况，尽可能采用灵敏度较低档，这样仪器具有更高的稳定性。特别指出的是：改变灵敏度后应按重新调节“0T”旋

41、钮，使数字显示为“000”和透光度为100T”。 将选择开关置于A，旋动吸光度调零旋钮，使数字显示为“000”，然后移入被测溶液，显示值即为试样的吸光度A值。 浓度C的测量：将选择开关旋至C，将已标定浓度的溶液移入光路，调节浓庋旋钮，使数字显示为标定值。将被测溶液移入光路，即可读出相应的浓度值。 测毕，打开样品室盖，关电源，将各旋钮停在起始位置上，冲洗比色杯。 注意：如果需大幅度改变波长时，需等数分钟才能正常工作，（因波长由长波向短波或短波向长波移动时，光能量变化急剧，光电管响应缓慢，需一段光响应平衡时间，使数字显示稳定后，重新进行“”和“”。在实际应用中常使用的待测介质颜色所对应的应使用的波

42、长表选择波长（nm）波长对应颜色待测介质颜色400-435青紫黄绿435-480蓝黄480-490蓝绿桔黄490-500绿蓝红500-560暗绿深紫560-580绿黄蓝紫580-595黄蓝595-610桔黄蓝绿610-750红绿蓝3.UV-756MC紫外可见分光光度计使用（1）接通电源，打开电源开关（关好暗箱盖），仪器显示“756”并进行自检和初始化，整个过程约需要10分钟，结束后显示“220”，DATA显示“0.000”。2.按下“MODE”键，显示“2”，然后按下“ENTER”键，显示“220”。3.按下“GOTO”键，用数字键输入所需波长，显示所输入数值，按下“ENTER”键，等待出现所

43、选择波长，DATA显示“0.000”。4.按顺序将空白杯、标准杯、测定杯置于比色槽中，将空白杯对向光路，Cell面板显示“R”位置（注意，比色杯中液体不得超过杯高的3/4）。5. 按“A/T”键，再“2”，按下“ENTER”，再按下“ABSO/100%T”键，ABSO/位显示“0.000”。6.按下START/STOP键，将标准杯、测定杯分别对向光路，CELL显示“S”，DATA显示测定的A值。7.记录或打印数据。8.按下START/STOP键，关闭电源。七、层析分析原理层析法又称色谱法，色层法和层离法（Chromatography），是广泛应用的一种生物化学技术，层析法是利用混合物各组分物理

44、化学性质（如溶解度、吸附能力、电荷和分子量等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同区域；借此将各组分分离。层析利用两个相，一个相称为固定相；另一个相称为流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度各异，从而使各组得到分离。层析法有多种类型，液体作为流动相的称为液相层析，气体作为流动相称为气相层析。按层析过程的机理不同，层析法可以分为下列几种类型： l.吸附层析 利用吸附剂表面对不同物质吸附性能的差异进行分离。 2.分配层析 利用不同物质在流动相和固定之间的分配系数和溶解度不同，使物质分离。 3.离子交换层析 利用不同物质对离子交换剂亲和力不同分离。 4.凝胶层析

45、 利用某些凝胶对不同分子量的物质阻滞作用不同进行分离，亦称分子筛层析。 5.亲和层析利用某些蛋白质能与配体分子特异而非共价地结合进行分离。（）吸附层析（absorption chromatography）氧化铝、硅胶等物质具有吸附其它一些物质的性质，而且对各种被吸附物质的吸附能力不同。吸附力的强弱，除与吸附剂本身的性质有关外，也与被附物质的性质有关。l、柱层析法柱层析是用一根玻璃管，管内加吸附剂粉末，用溶解剂湿润后，即成为吸附柱。然后在柱顶部加入要分离的样品溶液，假如样品内含两种成分A与B，则三者被吸附在柱上端，形成色谱。样品溶液全部流入吸附柱之后，加入合适的溶剂洗脱，A与B也就随着溶剂向下流

46、动而移动，最后达到分离。在洗脱过程中，管内连续发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的现象。例如，被吸附的A粒子被溶解随溶剂下移，但遇新的吸附剂，又将A吸附，随后，新溶剂又使A溶解下移，由于溶剂与吸附剂对A与B的溶解力与被吸附力不完全相同，A与B移动的距离也不同。连续加入溶剂，连续分段收集洗脱液，各成分即可顺序洗出。最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝，硅胶的吸附能力和含水量关系极大，硅胶吸水后，吸附能力下降。甘油酯、磷脂、胆固醇等非极性的与极性不强的有机物用这种方法分离效果较好。2.薄层层析法 薄层层析法是将吸附剂在玻璃板上或其它薄膜上均匀地铺成薄层，把要分析的样品加到薄层上，然后用合适的溶剂展开，而达到分

47、离鉴定的目的。优点是设备简单，操作容易，层析展开时间短，分离效率高，并可采用腐蚀性显色剂，而且可以在高温下显色。 （二）分配层析（partition chromatography）溶质在两种不相混的溶剂中溶解分配是逐步达到平衡的，平衡后，溶质在两种溶剂中的浓度取决于分配系数（a）a=SXOX在溶剂1中的浓度X在溶剂2中的浓度，分配层析即是利用物质在两种溶剂中的分配平衡。溶剂之一通常是水，它是保持在圈定的支持相之中（用淀粉、纤维素粉、滤纸等惰性材料制成），另一溶剂是移动相，由以水饱和过的有机溶剂组成，被分离的物质，如果彼此之间分配系数相差较大，就容易被分离开来。 （三）离子交换层析（iOn-ex

48、change chromatography）离子交换层析，是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各离子的亲和力的不同，经过交换平衡达到一种柱层析法。目前大多数采用合成的离子交换剂，例知：以苯乙烯与二乙烯交联聚合的树脂为母体的离子交换树脂对分离小分子物质（如氨基酸，核苷，核苷酸等）是理想的。但对大分子物质（如蛋白质）是不适当的。因为它不能扩散到树脂的链状结构中，所以分离大分子物质常选用葡聚凝胶进行分子筛层析。（四）凝胶层析（gelchromatography）凝胶层析即分子筛层析，是选用孔径大小一定的凝胶，将混合液中的小分子物质“筛”开来的一种分离方法。当一混合的蛋白质溶液通过凝胶柱

49、时，分子直径小于凝胶孔隙的可以进入胶粒内部，分子直径大于孔隙的不能进入。因此，小分子蛋白质在前进路上通过胶粒时遇到的阻力大，所以流速慢。相反地，大分子蛋白质不会进入胶粒内部，可以比较顺利地通过胶粒的空隙而流出，所以阻力小，流速快。由于流速不同，就可以把分子大小不同的蛋白质分开，因为凝胶具有这种性能，所以把它称为“分子筛”。凝胶颗粒是多孔性的网络结构，凝胶作为一种层析介质，它是不带电荷的物质，在层析时一般不换洗脱液，只是一种滤过仵用。故又称为凝胶过滤。用于生物材料分离的凝胶主要有以下几类：交联萄聚糖（Ssphadex），聚丙烯酰胺胶（BioGel），琼脂糖凝胶（Sepharose）和交联琼脂糖（

50、Sepharose CI）。 （五）亲和层析（aff1nity Chromatography）亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法。它经常只需经过一种处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，并且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质具有的生物学性质，与另一种称为配体的分子能特异而非共价地结合，如某些酶可以通过其共价键与其特异的辅酶牢固结合。亲合层析的基本原理是：先把待提纯的某一蛋白的配体，通过适当的化学反应共价地连接到象琼脂一类的多糖颗粒表面的功能团上，构成层析体。这种多糖材料在性能方面允许其它蛋由质白由通过。但能与配体结合的蛋白质则保留在柱内，然后改变洗脱条件，使蛋白

51、质和配体分离，即可将蛋白质纯化。第二部分生物化学基础试验实验一双缩脲法测定血清蛋白质含量一、实验目的：  1.掌握分光光度计的使用方法。  2.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。二、实验原理：蛋白质分子中的肽键（-CONH-）在碱性条件下能与Cu2+ 作用形成紫红色络合物。此呈色反应与双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与Cu2+ 作用产生紫红色的反应相似，故称为双缩脲反应。反应中溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用分光光度法定量检测蛋白质的含量。凡具有两个以上肽键结构的化合物均有此反应，因此双缩脲反应广泛用于肽及蛋白质定性、定量检测。三、实验器材和试

52、剂：恒温水浴箱、分光光度计、刻度吸管、试管、试管架。【试剂】16molL （24%）NaOH溶液称取NaOH（优级纯）240g，溶解于新鲜蒸馏水中并加至1000ml。置聚乙烯瓶内盖紧室温保存。2. 双缩脲试剂  精确称取结晶硫酸铜(CuSO4·5H20)3.0g，酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O)9.0g，碘化钾(KI)5.0g，分别溶解于是25m1蒸馏水中。将酒石酸钾钠和碘化钾溶液倒入1000ml容量瓶中，加入6molL氢氧化钠溶液100ml，混匀，再加硫酸铜溶液，边加边摇，最后加蒸馏水稀释至1000ml。置聚乙烯瓶内盖紧，室温保存。310g/L蛋白标准

53、液  牛血清蛋白10g，用1L蒸馏水溶解。4.家兔血清，用蒸馏水稀释10倍，使其蛋白质浓度在标准曲线测试范围内。四、实验操作与步骤：1.取7支试管按下表操作：试管号1234567标准蛋白（mL）0.10.30.50.70.9- 血清（mL）-0.1生理盐水（mL）0.90.70.50.30.110.9双缩脲试剂（mL）4.04.04.04.04.04.04.0相当蛋白浓度135790待测摇匀，37水浴15min后，用分光光度计于520nm波长处比色，以第6管调零点，测得各管吸光度。2. 以前5管的蛋白质含量（g/l）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，画出标准曲线。由第7管的

54、吸光度值，在标准曲线上求出第7管（待测血清）的蛋白浓度。【临床意义】1.血清总蛋白降低（1）合成障碍：肝功能严重受损时，蛋白质合成减少，其中以清蛋白下降最为明显。（2）丢失过多：见于严重烧伤时大量血浆渗出，大失血，肾病综合征时大量蛋白尿，溃疡性结肠炎时肠道长期丢失一定量的蛋白质等。（3）营养不良或消耗增加:长期低蛋白饮食、慢性胃肠道疾病所引起的消化道吸收不良，使体内缺乏合成蛋白质的原料，或长期患消耗性疾病，如结核病、恶性肿瘤、甲状腺功能亢进等均可引起血清蛋白浓度降低。（4）血液稀释：静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留。2.血清总蛋白增高（1）血液浓缩：急性失水（严重腹泻、呕吐、高热等

55、），休克（毛细血管的通透性增加），慢性肾上腺皮质功能减退, 急性失水尿钠增多引起继发性脱水。（2）合成增加:主要是球蛋白合成增加，如多发性骨髓瘤。五、实验注意事项：1由于各种蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用mol/L表示，而用g/L表示。2.试管、吸管应清洁，否则会有混浊现象出现。3.高脂、黄疸和溶血标本应作血清空白对照，以保证结果准确。含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色。4.须于显色30分钟内比色，否则可有雾状沉淀产生，同时注意各管从显色到比色的时间应尽可能一致。5.避免硫酸铜过量，否则生成氢氧化铜，其蓝色将掩盖紫红色，影响测定结果。六、思考题：蛋白质常见的呈色反应有哪些？本实验结果如何，请分析。实验二：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳一、实验目的：1. 掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的方法及实验原理。2. 了解血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的临床意义及影响因素。二、实验原理：带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。血清蛋白质的等电点均低于pH7.4，因此，在pH比